Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Vurdering av lang tids depresjon induksjon i voksen lillehjernen skiver

Published: October 16, 2019 doi: 10.3791/59859
Automatic Translation
1, 2
1Laboratory for Behavioral Genetics, Center for Brain Science, RIKEN, 2Senior Adviser's Office, Center for Brain Science, RIKEN

Summary

I noen genet-manipulert dyr, ved hjelp av en enkelt protokoll kan mislykkes i å indusere LTD i lillehjernen Purkinje celler, og det kan være et avvik mellom LTD og motor læring. Flere protokoller er nødvendig for å vurdere LTD-induksjon i genet-manipulert dyr. Standard protokoller vises.

Abstract

Synaptic plastisitet gir en mekanisme for læring og hukommelse. For lillehjernen motor læring, langsiktig depresjon (LTD) av Synaptic sendinger fra parallelle fibre (PF) til Purkinje celler (PC) regnes som grunnlag for motor læring, og mangler av både LTD og motor læring er observert i ulike Gen-manipulert dyr. Vanlige motoriske lære sett, slik som tilpasning av optokinetic refleks (OKR), Vestibular-øyerefleks (VOR), og rotarod test ble brukt til evaluering av motoriske læringsferdigheter. Resultatene fra GluA2-carboxy Terminus modifiserte knock-in-mus viste imidlertid normal tilpasning av VOR og OKR, til tross for manglende PF-LTD. I den rapporten, induksjon av LTD ble bare forsøkt å bruke en type stimulering protokoll ved romtemperatur. Dermed forhold til å indusere lillehjernen LTD ble utforsket i samme knock-in mutanter ved hjelp av ulike protokoller ved nær fysiologisk temperatur. Til slutt fant vi stimulering protokoller, der LTD kunne bli indusert i disse genet-manipulert mus. I denne studien foreslås et sett av protokoller for å evaluere LTD-induksjon, som vil mer nøyaktig tillate undersøkelse av årsakssammenheng mellom LTD og motor læring. Som konklusjon, eksperimentelle forhold er avgjørende når man evaluerer LTD i genet-manipulert mus.

Introduction

Den Synaptic organiseringen av utarbeidet neuronal nettverk av lillehjernen cortex, bestående av PCer, molekylær lag interneurons (kurv og Stel celler), Golgi celler, PFs fra granule celler, mosegrodd fibre og klatring fibre (CFs), har vært belyst i form av eksitasjon/hemming og avvik/konvergens, og godt organisert kretser diagram har antydet at lillehjernen er en "neuronal maskin"1, men det var tidligere ingen anelse om hensikten med denne "maskinen". Senere foreslo Marr at PFs-inngangen til PCer utgjør et trippel lag assosiativ lærings nettverk2. Han foreslo også at hver CF formidler en cerebral instruksjon for elementær bevegelse2. Han antok at samtidig aktivering av PFs og CF ville forbedre PF-PC-synapse aktivitet, og forårsake langsiktige potensiering (LTP) av PF-PC-synapse. På den annen side antok Albus at synkron aktivering av PFs og CF resulterte i LTD ved PF-PC-synapser3. Begge de ovennevnte studiene tolke lillehjernen som en unik minneenhet, inkorporering av som i lillehjernen kortikale nettverket fører til dannelsen av Marr-Albus modell læring maskinmodell.

Etter disse teoretiske spådommer, tyder to linjer av bevis tilstedeværelsen av Synaptic plastisitet i lillehjernen. Den første linjen av bevis ble foreslått av den anatomiske organiseringen av flocculus; Her MF trasé av Vestibular orgel opprinnelse og CF trasé av retinal opprinnelse møtes på PCer4. Denne unike konvergens mønster antyder at en Synaptic plastisitet forekommer i flocculus forårsaker bemerkelsesverdig tilpasningsdyktighet av vestibulo-øyerefleks. For det andre, innspillingen av PCene respons i flocculus og lesioning av flocculus også støttet ovenfor hypotesen5,6,7. Videre PC utslipp mønster under tilpasningen av en ape hånd bevegelse8 støttet Synaptic plastisitet hypotesen, spesielt Albus ' s Ltd-hypotese3.

For å bestemme arten av Synaptic plastisitet direkte, gjentatt konjunktiv stimulering (CJS) av en bunt av PFs og CF som spesifikt innerverer PC in vivo ble vist å indusere LTD for overføring effekten av PF-PC synapser9, 10,11. I den påfølgende in vitro utforskningen ved hjelp av en lillehjernen Slice12 og kultivert stk, sammen med co-kultivert granule celle stimulering og oliven celle stimulering13 eller forbindelse av iontophoretically brukt glutamat og somatiske depolarizationforårsaket Ltd Signal Transduction mekanismen under den Ltd-induksjon ble også intensivt undersøkt ved hjelp av in vitro forberedelser16,17.

Tilpasninger av VOR og OKR ble ofte brukt til kvantitativ evaluering av gen-manipulasjon effekter på lillehjernen motor læring, fordi vestibylen-lillehjernen cortex ble påvist å være den essensielle opprinnelsen i adaptiv læring av VOR18 ,19,20 og OKR19,21 sammenhengen mellom svikt i Ltd-induksjon og svekkelse av atferdsdata motor læring har blitt tatt som bevis på at Ltd spiller en viktig rolle i motor lærings mekanismer22. Disse synspunktene er kollektivt referert til som Ltd hypotesen om motor læring, eller Marr-Albus-Ito hypotese23,24,25,26.

Adaptiv læring av øyebevegelser ble målt ved hjelp av lignende protokoller, mens ulike eksperimentelle forhold ble brukt til å indusere Ltd i Slice forberedelse27,28,29,30,31 . Nylig rapporterte Schonewille et al.26 at noen genet-manipulert mus demonstrerte normal motor læring, men lillehjernen skiver VISTE ikke Ltd, og dermed konkluderte med at Ltd ikke var avgjørende for motor læring. Imidlertid var induksjon av LTD bare forsøkt å bruke en type protokoll ved romtemperatur. Derfor brukte vi flere typer LTD-inducing protokoller under opptaksforholdene på rundt 30 ° c, og vi bekreftet at LTD ble pålitelig indusert i genet-manipulert mus ved å bruke disse protokollene ved nær fysiologiske temperaturer32.

Men det er fortsatt noen spørsmål om de grunnleggende egenskapene til konjunktiv stimulering. Den første er forholdet mellom den komplekse Spike form og amplitude av LTD. Sekund, i forbindelse med PF-stimulering og somatiske depolarization, om antall stimuli som brukes var nødvendig eller ikke var unnvikende. I denne studien ble disse spørsmålene undersøkt ved hjelp av Wild-mus (WT).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av RIKEN komiteen for omsorg og bruk av dyr i eksperimenter. Mus ble holdt i dyret anlegget av RIKEN Center for Brain Science under godt kontrollert temperatur (23-25 ° c) og luftfuktighet (45%-65%) Forhold. Både mannlige og kvinnelige WT mus (C57BL/6, 3 – 6 måneder) ble brukt.

1. utarbeidelse av løsninger som brukes i eksperimenter

Merk: Alle løsninger bør gjøres i ultrarent vannfri for metaller (resistivitet > 18,2 MΩ) og andre urenheter (total organisk karbon (TOC) < 5,0 ppb). Working kunstig spinalvæske (ACSF) for Slice-skjæring og opptak er laget fersk på dagen av eksperimentet fra en 10 ganger (x10) lager av ACSF. Bubble løsningene med 5% CO2/95% O2 gassblandingen før bruk. PH-verdien i ACSF justeres til 7,4 ± 0,1, og OSMOLARITETSSYSTEM justeres 315 ± 5 mOsm/kg ved å tilsette ultrarent vann.

  1. Forbered 10x lager av ACSF inneholdende 1250 mM NaCl, 30 mM KCl, 12,5 mM NaH2PO4, og 260 mm NaHCO3. Denne løsningen kan oppbevares ved 4 ° c.
  2. Forbered arbeider ACSF inneholdende 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mm mg2så4, 1,25 mm NaH2PO4, 26 mm NaHCO3 og 20 mm glukose.
    1. Først Tilsett 1 mL 2 M CaCl2 løsning etterfulgt av 1 ml 1 m mg2så4 løsning inn rundt 800 ml ultrarent vann, for å unngå nedbør. Deretter legger 100 mL av 10x ACSF og glukose. Til slutt, utgjør et total volum på 1 000 mL ved å tilsette ultrarent vann.
  3. Forbered 3,3% agar for hjernen håndtering. Oppløse 1 g agar i 30 mL 0,9% NaCl løsning, og varme i en mikrobølgeovn til bare kokende. Rør for å blande, og hell den i en steril 4 cm x 10 cm plastboks og la stivne. Lagre agar plate (~8 mm tykkelse) i et kjøleskap.
  4. Forbered den interne løsningen.
    1. Forbered K+-baserte intern løsning som inneholder 60 mm KCl, 60 mm K-gluconate, 0,3 mm EGTA, 4 mm MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mM GTP og 30 mm HEPES (pH 7,2).
      Merk: Lav konsentrasjon (0,3 mM) av EGTA, en langsom ca2 +-chelator, tilsettes til chelate muligens forurenset ca2 + i rent vann, men denne lave konsentrasjonen av EGTA i den interne løsningen aldri blokkerer induksjon av Ltd (Figur 3, Figur 4, figur 5) under hele celle innspillingen. Målt osmotisk trykk er 285 mOsm/kg.
    2. Forbered cs+-basert intern løsning som inneholder 60 mm CsCl, 46 mm D-gluconate, 27 mm tetraethylammonium KLORID (Tea-CL), 0,3 mm EGTA, 4 mm MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mM GTP og 30 mm HEPES (pH 7,2, justert ved hjelp av CsOH).
      Merk: CS+ blokker spennings avhengige K-kanaler, og forbedrer plass-klemme forhold på eksterne dendrites ved å øke lengden-konstant. Målt osmotisk trykk er 285 mOsm/kg.
    3. Klargjør 200 μL alikvoter av løsningene og oppbevar ved-30 ° c.

2. Brain disseksjon og trimming

  1. Chill og oxygenate 2 50 mL kanner av ACSF på is til temperaturen er lavere enn 4 ° c. Tilsett 50 μL av tetrodotoxin (TTX, 1 mM) i en av de iskalde kanner til ACSF og reserver den for skiver skjæring. For å få musen lillehjernen Slice reservere LTD-inducing evne, tillegg av TTX til normal ACSF er nødvendig.
  2. Kjøl ned metall prøvebrettet ved å fylle et is bad område av skjære kammeret med is.
  3. Hell 1 mL isoflurane i en anesthetizing krukke (~1000 ml) og Plasser en mus i den i 30 – 45 s. Kontroller at musen er dypt anesthetized ved å bekrefte sin manglende evne til å reagere på mekanisk stimulering.
  4. Halshugge musa ved hjelp av kirurgisk saks. Hold hodet og skjær den overfladiske huden langs midtlinjen ved hjelp av en oftalmologisk saks. Trekk huden ved å holde med fingrene for å utsette hodeskallen overflaten.
  5. Skjær skallen horisontalt langs en linje fra de store spinocerebellar hullet like over øret og øyet ved hjelp av en oftalmologisk saks. Skjær skallen langs en linje over begge øynene og fjern for å isolere skallen.
  6. Skjær hjernen i midten av cerebrum ved hjelp av en skalpell, deretter isolere den caudal delen av hjernen, inkludert lillehjernen fra skallen. Dypp den i et iskaldt beger med ACSF. Vanligvis, den totale tiden fra halshogging til nedsenking av hjernen blokken inn i pre-kjølt beger med ACSF bør være mindre enn 60 s.
  7. Posisjon bobler rør bør justeres for ikke å røre hjernen blokken i begeret. Mekanisk skade kan føre til hevelse av stykket under opptak. La den i minst 7 min og la hjernen avkjøles.
  8. For å trimme hjerne blokken, skjær en rektangulær agar brikke (2 cm x 2 cm) fra en stor agar plate (4 cm x 10 cm, lagret ved 4 ° c) og legg den på et filter papir for å absorbere overflødig væske.
  9. Snu agar stykket opp-ned på filter papiret, og plasser agar brikken på et filter papir på en pre-kjølt metall prøve skuff (16 cm x 20 cm). Plukk opp hjernen blokken med en slikkepott og absorberer overdreven væske rundt den med et stykke filter papir.
  10. Monter hjernen blokken på agar blokken ved hjelp av lim (medisinsk Cyanoacrylate Instant lim). Sørg for å feste bunnen (ventrale side) av hjernen blokken til agar.
  11. Skjær ut høyre halvkule med et blad. Pass på at siden av skjæringsplanet er så parallell som mulig til dendrittiske planet på PCen fordi denne siden er festet til overflaten av prøve skuffen. Klipp ut og fjern den andre siden av halvkule. Deretter kuttet hjernen mellom overlegen og mindreverdig colliculi, og kuttet av ryggmargen.
  12. Lim høyre side av trimmet lillehjernen med agar blokken på pre-kjølt prøven skuffen. Spre overflødig lim rundt lillehjernen med den flate delen av en slikkepott, for å hindre overflødig lim fra feste til lillehjernen overflate. Vipp metallbrettet og hell ACSF for å fikse limet og vaske bort overflødig lim.

3. Brain kutting

  1. Orientere prøven slik at rygg siden av lillehjernen er på forsiden. Hell iskald skjæring ACSF, som inneholder 1 μM TTX, tilstrekkelig til å dyppe lillehjernen helt. Plasser et gass rør inn i ACSF og start bobler med O2/co2 gassblanding.
  2. Fjern arachnoid mater ved hjelp av en fin TWEEZER under kikkert. Skjær lillehjernen peduncle med et blad, og fjern hjernestammen og agar blokk. Roter skuffen 180 ° slik at rygg flaten på lillehjernen vender mot en barberblad.
  3. Still inn bladet, og Juster det første klippe stedet. Sett vibratome kutting parametre til følgende: amplitude til 5,5, frekvens til 85 Hz, hastighet til 3 – 4, og Slice tykkelse til 300 μm.
  4. Overfør lillehjernen skive på en nylon-net i en akryl inkubator og dyppe skive helt inn i oksygenert ACSF. Inkubator skal plasseres i et vannbad som opprettholder en temperatur ved 26 ° c.
  5. Oppbevar skivene i minst 1 time for å tillate at skaden blir frisk under kutting.

4. helt celle patch-klemme opptak

Merk: En patch-klemme opptak krever følgende utstyr: en oppreist mikroskop med infrarød differensial interferens kontrast (IR-DIC) optikk, en patch-Clamp forsterker, data digitalisering, digital stimulator, isolator, datamaskin, programvare for data-oppkjøpet og analyse, motorisert manipulator, mikroskop plattform, vibrasjons isolasjons bord, Faraday bur, løsning varmesystem, peristaltisk pumper og elektrode avtrekker.

  1. Legg pikrotoksin (0,1 mM) til ACSF og løse det ved hjelp av ultra-sonikering i 3 min.
  2. Perfuse et opptaks kammer med pikrotoksin, O2-co2-mettet ACSF med en hastighet på 2 ml/min. opprettholde temperaturen i opptaks kammeret på rundt 30 ° c.
  3. Lag en opptaks elektrode ved å trekke en Borosilikatglass glass kapillær med filament (ytre diameter = 1,5 mm) ved hjelp av en avtrekker med 4 trinn. Spiss diameteren skal være rundt 1 μm.
  4. Lag en stimulerende elektrode ved å trekke den samme kapillær ved hjelp av avtrekker med 2 trinn, og deretter bryte for å produsere en fin spiss ved å slå spissen mot en jern blokk under et kikkert mikroskop. Den endelige diameteren skal være 3 – 5 μm.
  5. Overfør lillehjernen skive til opptaks kammeret og fest den med en PT-vekt med nylon tråder. Fyll en stimulerende elektrode med ACSF.
  6. For stimulering av PFs, plasserer du den stimulerende elektroden på overflaten av molekyl laget, rundt 50 μm fra Purkinje celle lag.
  7. For stimulering av CF plasserer du den stimulerende elektroden i bunnen av Purkinje celle lag (trinn 5,3, 5,4).
  8. Filtrer K+-basert eller cs+-basert intern løsning med et 0,45 μm-filter. Bruk en mikro-loader til å fylle en opptaks elektrode med 8 μL intern løsning.
  9. Påfør et svakt positivt trykk på opptaks elektroden før du fordyper den i ACSF. Motstanden bør være 2 – 4 MΩ og det flytende junctional potensialet bør rettes.
  10. Nærme den sunne, lyse celle kroppen på PC-en med opptaks elektroden. Skyv overflaten av Purkinje celle litt, slutte å bruke positivt trykk, neste gjelder negativt trykk til danner en Giga-ohm segl. Deretter etablere hele cellen konfigurasjon ved hjelp av negativt trykk.
  11. Hold membran potensialet ved-70 mV, og påfør-2 mV puls (varighet, 100 MS) ved 0,1 Hz å overvåke input motstand, seriemotstand og input kapasitans, kontinuerlig. Ikke bruk serie motstands kompensasjonen. Forkast data når serie motstanden varierer med mer enn 15%.

5. induksjon av LTD

  1. Stimulere molekyl laget med en puls (varighet, 0,1 MS). Identifiser PF-eksitatoriske postsynaptic strømninger (EPSC) ved å bruke en dobbel puls stimulans (interspike intervall (ISI) av 50 MS). Den PF-EPSC skal vise sammenkoblet-puls tilrettelegging og gradvis økning i amplitude i forhold til økning i stimulering intensitet.
  2. Record test responsen av PF-EPSC ved å bruke en enkelt puls på 0,1 Hz. Juster intensiteten av stimulans slik at fremkalt EPSC amplitude er rundt 200 pA. Unngå forurensning av strøm gjennom spennings avhengig ioniske kanal.
  3. Stimulere CF på bunnen av Purkinje celle lag, og identifisere EPSC elicited av CF aktivering (ved å bruke en dobbel puls stimulans). CF-EPSC skal vise sammenkoblet-puls depresjon og en alt-eller-ingen måte i henhold til økningen i stimulering intensitet. For LTD induksjon, en enkelt stimulans bør brukes.
  4. LTD-inducing protokollen 1
    1. Ved hjelp av en elektrode som inneholder K+-basert intern løsning under gjeldende-klemme forhold, Påfør en enkelt PF-stimulans og en enkelt CF-stimulans samtidig ved 1 Hz i 5 min (300 pulser) (figur 1a).
  5. LTD-inducing protokollen 2
    1. Ved hjelp av en elektrode som inneholder K+-basert intern løsning under gjeldende-klemme forhold, gjelder doble PF-STIMULI (ISI av 50 MS) og enkel CF-stimulans som andre PF-stimulans er SAMMENFALLENDE med CF-stimuli ved 1 Hz i 5 min (figur 1B).
  6. LTD-inducing protokollen 3
    1. Ved hjelp av en elektrode som inneholder cs+-basert intern løsning under spenning-klemme forhold, gjelder en dobbel PF-STIMULANS (ISI av 50 MS) og en enkelt depolariserende spenning-trinn (-70 til 0 mV, 50 MS) til Soma ved 1 Hz for 3 min, slik at den andre PF-stimulans er tilsvarer begynnelsen av depolariserende spennings trinn (figur 1C).
  7. LTD-inducing protokollen-4
    1. Ved hjelp av en elektrode som inneholder cs+-basert intern løsning under spenning-klemme forhold, gjelder PF-stimuli (5x ved 100 Hz) og en enkelt depolariserende spenning-trinn (-70 til 0 mV, 50 MS) til soma ved 0,5 Hz i 3 min, samtidig (figur 1d ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fire protokoller ble brukt i denne studien for å indusere lillehjernen LTD. I de to første protokollene (protokoll 1 og 2) ble forbindelsen mellom PF-stimulering og CF-stimulering påført under gjeldende-klemme-forhold. I de to andre protokollene (protokoll 3 og 4) ble somatiske depolarization erstattet av CF-stimulering under spennings-klemme-forhold. Spenning-spor eller strøm-spor under konjunktiv stimulering ble sammenlignet (figur 2).

Kombinasjon av 1 PF-stimulering og 1 CF-stimulering under gjeldende-klemme betingelser (protokoll-1) ble konvensjonelt brukt til Slice forberedelse26,27. Formen på den komplekse pigg elicited av CJ var lik som elicited av CF-stimulering alene, med den første bratte spikelet etterfulgt av 2 til 3 spikelets (figur 2a). En tilsvarende formet kompleks pigg ble observert under stimulering med protokoll 2, nemlig 1 PF-stimulering ble fulgt 50 MS senere av en konjunktiv andre PF-og CF-stimulering (figur 2b). Under spenning-klemme forhold ved hjelp av en cs+-basert intern løsning, sammen med en 2 PF stimulering og somatiske depolarization ble brukt (protokoll 3) (figur 2C). Den første PF-stimulering ble fulgt 50 MS senere av en samtidig anvendelse av en andre PF-stimulering og somatiske depolarization. En indre strøm ble elicited upon somatiske depolarization fra-70 til 0 mV. En hale strøm ble også fremkalt etter repolarisasjon. Noen ganger ble repeterende generering av en indre strøm observert, noe som ville gjenspeile ca-Spike aktiviteten på den eksterne dendrittiske regionen der membranen potensialet ikke var klemt tilstrekkelig, til tross for å bruke en cs+-basert intern løsning ( Figur 2C). Til slutt, 5 PF-stimuli på 100 Hz ble gitt samtidig med somatiske depolarization under spenning-klemme forhold (protokoll 4). Igjen, repeterende generering av innover strømmer ble elicited under depolarization og en hale strøm ble elicited etter repolarisasjon. Timing av repeterende generasjon av innover strømmen ble ikke synkronisert med PF-stimuli (figur 2D). Noen ganger, repeterende generering av innover strømmen fortsatte etter repolarisasjon.

Som for LTD indusert av protokoller-1 og-2, reduksjon av EPSC-amplitude målt i løpet av 25-min etter utbruddet av CJ ble spredt over et relativt bredt spekter32. Sammenlignet med den stabile formen på PF-EPSP, var formen av komplekse Spike ganske variabel fra celle til celle. Fordi spikelets i en kompleks pigg reflektert ca2 +-kanals aktivisering33, form av en kompleks pigg, slik som amplitude eller steepness av spikelets, påvirker Ltd amplitude ble undersøkt med komplekse Spike elicited av protokollen 1. Fordi formen på de komplekse toppene elicited av protokoll 2 var forurenset med PF-EPSP, vi ikke analysere disse dataene. Først, summen av alle spikelets (1 – 4)-amplitude var korrelert med amplituden til LTD (-ΔEPSC%) (Figur 3A, B). Korrelasjonskoeffisienten (r) var 0,28, men var ikke statistisk signifikant (p > 0,5). Fordi spikelets inneholdt mer av ca2 +-komponent34, var summen av spikelet (2 – 4)-amplitude korrelert med Ltd-amplitude. Sammenhengen syntes å være sterkere (r = 0,67), men fortsatt ikke statistisk signifikant (p > 0,1) (figur 3c). Deretter, den maksimale verdien av dVm/dt (maksimal renteøkning [MRR]) for hver spikelet ble beregnet (figur 3D), fordi produktet av membran kapasitans (cm) og dVm/dt reflekterer omtrent membranen strømmene35. Korrelasjon mellom produktet av cm og summen av MRRs av spikelets (1 – 4) og LTD-amplitude ble undersøkt (figur 3e), og r var 0,18 (p > 0,9). Sammenhengen mellom produktet av cm og summen av MRR av spikelets (2 – 4) viste en litt sterkere r (0,36), men det var ikke signifikant (p > 0 .6) (figur 3F).

Under spennings klemme forhold, protokoll 3 med 180 CJS effektivt indusert LTD (figur 4b)32. Men om et mindre antall stimuli effektivt kan indusere LTD forblir ukjent. Således ble 60 CJS påført ved 1 Hz i 1 min. ca 10 min etter CJ, EPSC amplitude ble undertrykt, men det utvinnes på 15 min etter CJ-utbruddet. Dette tyder på at 60 ganger CJS ved 1 Hz var utilstrekkelig til å indusere LTD (figur 4a). Videre, gjentakelse av somatiske depolarization alene (180 ganger) induserer ikke LTD (figur 4b)32.

Protokoll 4 ble opprinnelig brukt av Steinberg et al.30 for unge mus (P14 – 21). LTD ble angivelig indusert av 30 CJS på 0,5 Hz ved RT i vill type lillehjernen. Men når 30 CJS ble brukt til voksen mus lillehjernen SKIVE (3-6 mnd) på rundt 30 ° c, no LTD ble indusert (figur 5a). I kontrast, når 90 CJS ble brukt, den vanlige amplitude av LTD ble observert (figur 5B)32. Igjen, somatiske depolarization alene (90 ganger på 0,5 Hz) induserer ikke LTD (figur 5B).

Figure 1
Figur 1: skjematisk illustrasjon av protokoller for å INDUSERE Ltd i PF-PC-synapse. (A) protokoll 1 CJ. 1 PF og 1 CF stimuli påføres samtidig 300 ganger ved 1 Hz (5 min) under gjeldende-klemme forhold. Elektrode for hel celle opptak inneholder K+-basert intern løsning. (B) protokoll 2 CJ. 2 PF og 1 CF stimuli påføres samtidig 300 ganger ved 1 Hz (5 min) under gjeldende-klemme tilstand. Elektroden inneholder K+-basert intern løsning. (C) protokoll 3 CJ. 2 PF og somatiske depolarization (-70 til 0 mV, 50 MS) brukes 180 ganger ved 1 Hz (3 min) under spennings-klemme tilstand, slik at den andre PF stimulans påføres samtidig med begynnelsen av somatiske depolarization. Elektroden inneholder cs+-basert intern løsning. (D). Protocol 4 CJ. 5 PF på 100 Hz og somatiske depolarization brukes 90 ganger ved 0,5 Hz (3 min) under spennings klemme tilstand, samtidig. Elektroden inneholder cs+-basert intern løsning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: spennings-eller strøm spor på PC-en under stimulering av forbindelse. (A) membran potensial spor elicited av protokollen 1 CJ. (B) membran potensial spor elicited av protokollen 2 CJ. (C) membran gjeldende spor elicited av protokollen 3 CJ. (D) membran gjeldende spor elicited av protokollen 4 CJ. Loddrette stolper = 10 mV (A og B), 1 nA (C og D). Horisontal bar = 20 MS. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: forholdet mellom spikelet av en kompleks pigg og Ltd-amplitude. (A) representative spor av en kompleks Spike elicited av protokoll 1. Pilene angir topper på spikelets (1 – 4). Scale bar = 20 mV. (B) forholdet mellom summen av amplituden til spikelets (1 – 4) og Ltd-amplitude (-ΔEPSC%) (r = 0,28, p > 0,5). (C) forholdet mellom summen av amplituden til spikelets (2 – 4) og Ltd-amplitude (r = 0,67, p > 0,1). (D) representative spor av differensiert komplekse pigger vist i A. piler indikerer topper av dVm/dt av spikelets. Skala bars = 5 MS, 50 V/s. (E) forholdet mellom produkter av cm og summen av MRR av spikelets (1 – 4) og AMPLITUDE av Ltd (-ΔEPSC%) (r = 0,18, p > 0,7). (F) forholdet mellom produktet av cm og summen av MRR av spikelets (2 – 4) og AMPLITUDE av Ltd (r = 0,36, p > 0,4). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: effekt av antall repetisjoner på Ltd-induksjon ved hjelp av protokoll-3 CJ. (A) svikt i Ltd induksjon av protokoll-3 CJ, repetisjon var 60 ved 1 Hz. Mean PF-EPSC amplitude registrert før og etter protokoll-3 CJ (svart kolonne nederst). PF-EPSC amplitude ble normalisert av de som er registrert før CJ. fylt symbol indikerer gjennomsnittlig EPSC amplitude. Feilfelt betegne SEM. innfelt: lagt PF-EPSC spor (øverst) ble registrert før (merket 1) og 25 – 29 min etter CJ-Stim utbruddet (merket 2). Hver spor representerer gjennomsnittet av 6 poster. Skala bars = 100 pA, 10 MS. (B) rødt symbol: Ltd indusert av protokollen 3 CJ, repetisjon var 180 ganger ved 1 Hz. blått symbol: ingen forbindelse stimulering men somatiske depolarization ble brukt 180 ganger ved 1 Hz. Ltd ble ikke indusert. Innfelt: lagt PF-EPSC spor (øverst) ble spilt inn før (merket 3) og 25 – 29 min etter CJ-Stim utbruddet (merket 4). Hver spor representerer gjennomsnittet av 6 poster. Skala bars = 100 pA, 10 MS. data vist i B er det samme som brukes i figur 3B i Yamaguchi et al.32. (C). Sammendrag plot of Mean PF-EPSC amplitude registrert i løpet av 25-29 min etter utbruddet av CJ. Depol: depolarization. Numerisk tegn i parentes representerer antall celler. x60 = 60 ganger, x180 = 180 ganger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: effekt av antall repetisjoner på Ltd-induksjon ved hjelp av protokoll 4 CJ. (A) svikt i Ltd induksjon av protokollen 4 CJ, repetisjon var 30 ganger på 0,5 Hz. Mean PF-EPSC amplitude registrert før og etter protokoll-4 CJ (svart kolonne på THR bunnen). Fylt symbol indikerer gjennomsnittlig EPSC amplitude. Feilfelt betegne SEM. innfelt: lagt PF-EPSC spor (øverst) ble registrert før (merket 1) og 25 – 29 min etter CJ-Stim utbruddet (merket 2). Hver spor representerer gjennomsnittet av 6 poster. Skala bars = 100 pA, 10 MS. (B) rødt symbol: Ltd indusert av protokoll 4 CJ., blått symbol: ingen forbindelse stimulering men somatiske depolarization ble brukt 180 ganger ved 0,5 Hz. Ltd ble ikke indusert. Innfelt: lagt PF-EPSC spor (øverst) ble spilt inn før (merket 3) og 25 – 29 min etter CJ-Stim utbruddet (merket 4). Skala bars = 100 pA, 10 MS. data vist i B er det samme som brukes i figur 4B i Yamaguchi et al. 32. (C). Sammendrag plot of Mean PF-EPSC amplitude registrert i løpet av 25-29 min etter utbruddet av CJ. Depol: depolarization. Numerisk tegn i parentes representerer antall celler. x30 = 30 ganger, x90 = 90 ganger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forskjeller mellom de fire protokollene

I LTD-inducing protokoller 1 og 2, CJS 300 ganger ved 1 Hz er tilstrekkelig til å indusere lillehjernen LTD. stimulering frekvensen av CF syntes å være i et fysiologisk område, fordi den komplekse Spike avfyring rate i våken voksen mus (P60) ble rapportert å være 1,25 Hz36. Men CF-stimulering alene forårsaket ikke langsiktig plastisitet i PF-CF-synapse, som brukt i protokoller 1 og 2 (Figur 4, figur 5), men CF-stimulering alene ved høyere frekvens indusert Ltd24. Formen på den komplekse pigg, elicited i protokoll 1, hadde også ingen signifikant sammenheng med LTD-amplitude (Figur 3). Kanskje formen på den komplekse Spike reflekterer gjennomsnittlig ca2 +-konsentrasjon, men ikke representerer den lokale ca2 +-konsentrasjonen i en branchlet der Ltd ble indusert.

Om PF stimulering, selv om 1 PF stimulering ble konvensjonelt brukt til å indusere lillehjernen Ltd26,27, hadde den granule cellen en tendens til å utløses i burst-modus i vivo37. Derfor flere aktiveringer av PF ville være bedre enn en enkelt PF stimulering å etterligne fysiologiske avfyring mønster, og det mGluR1 aktivisering avhengig av antall og hyppigheten av PF avfyring38. Således, protokollen-2 ville aktivere PKC flere intens enn protokollen-1 did. I noen muterte GluA2-mus (K882A) var det bare protokoll-2 som var tilstrekkelig til å indusere LTD sammenlignet med protokoll 132, noe som tyder på at en høyere konsentrasjon av aktivert PKC var nødvendig for å indusere Ltd for denne bestemte GluA2 mutasjon.

Flere stimuleringer av PF ville øke forekomsten av LTD-induksjon, men aktivering av en spennings avhengig ca2 +-kanal via CF-stimulering eller somatiske depolarization var fortsatt nødvendig. For å øke aktiveringen av en spennings avhengig ca2 +-kanal på PC-dendrit, der PF ble stimulert, var celle kroppen på PCen depolarisert under spenning-klemme forhold30. Når du bruker en cs+-basert intern løsning, input motstand økt markant32, antyder en økning i kabelen konstant. Følgelig vil antall aktiverte ca2 +-kanaler i det flate området på PC-dendrit økes. I noen GluA2 mutant mus (Δ7), 2PF stimulering + somatiske depolarization (protokoll 3) eller 5 PF stimulering + somatiske depolarization (protokoll 4) kunne indusere LTD. omvendt ble det ikke observert noe LTD-fenomen av protokoll 1 eller 2 stimulering. Det kan være at somatiske depolarization under spenning-klemme forhold med cs+-intern løsning aktivert spennings avhengig ca2 +-kanaler oppstår mer effektivt enn aktivering av CF-stimulering under gjeldende-klemme forhold med K+-basert intern løsning, og dette kan føre til en ikke-additiv økning i [ca2 +]i39 , og en påfølgende robust PKC som kreves for Ltd.

Mulig kompenserende mekanisme for LTD i genet manipulert dyr

Teoretisk studie forutsetter en alt-eller-ingen type aktivering av PKC upon LTD induksjon40, men i eksperimentelle resultater ved hjelp av noen genet-manipulert dyr som GluA2 knock-in mus viste at aktivering av PKC varierte avhengig Ltd induksjon protokollene32. Blant 4 forskjellige protokoller, den mest effektive induksjon protokollen for å aktivere PKC var protokoller 3 og 4, etterfulgt av protokollen 2 og det svakeste var protokoll 1. I genet-manipulert dyr, kompenserende mekanismer kan være årsaken LTD32. Slike kompenserende mekanismer kan ha lavere følsomhet for aktiverte PKC. Hvis ja, flere sett med LTD-inducing protokoller, inkludert en som kan aktivere PKC sterkere enn konvensjonelle protokoller, er nødvendig for å evaluere LTD induksjon evne i genet manipulert dyr. Selv om normal induksjon av LTD med cs+-basert intern løsning er rapportert i kulturperler PCer15 eller PCer i skiver30, en cs+-basert intern løsning er ikke fysiologisk. Men aktivering av en spennings avhengig ca2 +-kanal på en ekstern dendrit er vanskelig å bruke somatiske depolarization i stykket, på grunn av mulige mekaniske skader under forberedelse og opptak som kan føre til en reduksjon i lengde-konstant. Derfor, for å sikre aktivering av ca2 +-kanaler i PF-stimulerende dendrittiske regionen, er det nødvendig å bruke en protokoll som øker lengden-konstant ved hjelp av en cs+-intern løsning.

Andre eksperimentelle forhold

Andre faktorer bør også tas i betraktning når Synaptic plastisitet og dyr atferd er undersøkt parallelt som samsvarer med dyret alder og opptaks temperatur in vitro, fordi signal Transduction rate konstanter og reseptor smugling er svært temperaturfølsomme. Egentlig reduserte motor læring in vivo antall overflaten uttrykt AMPA-type glutamat reseptorer41 og størrelsen på asynkron mini-EPSC på PF-PC synapse42. Ideelt sett bør hele cellen patch klemme opptak gjøres ved 37 ° c, men en stabil langsiktig innspilling er vanskelig ved 37 ° c. Derfor ble alle elektrofysiologisk innspillinger i denne studien gjennomført på rundt 30 ° c. Selv om denne temperaturen er lavere enn fysiologisk temperatur, det fortsatt ville gi mer gunstige forhold for å sammenligne Synaptic egenskaper analysert in vitro med atferdsdata læring evne. Denne forskjellen i Innspillings temperaturer kan være en annen faktor for å få disse resultatene til å avvike fra forrige rapport26. I tillegg er vurdering av utholdenhet av passive membran egenskaper32 og iboende excitability43,44 også viktig i studiet av Synaptic plastisitet.

I konklusjonen, å undersøke årsakssammenheng mellom Synaptic plastisitet og dyr atferd i genet manipulert dyr, vurdering av Synaptic plastisitet in vitro ville kreve nøye kontroll av eksperimentelle forhold som bruker temperatur regulering og flere typer protokoller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker A. OBA for hennes teknisk assistanse. Denne forskningen ble delvis støttet av Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning (C) 17K01982 til K.Y.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier Molecular Devices-Axon Multiclamp 700B
Borosilicate glass capillary Sutter BF150-110-10
Digitizer Molecular Devices-Axon Digidata1322A
Electrode puller Sutter Model P-97
Isoflurane FUJIFILM Wako Pure Chemical 26675-46-7
Isolator A.M.P.I. ISOflex
Linear slicer Dosaka EM PRO7N
Microscope NIKON Eclipse E600FN
Peristaltic pump Gilson MP1 Single Channel Pump
Picrotoxin Sigma-Aldrich P1675
Pure water maker Merck-Millipore MilliQ 7000
Software for experiment Molecular probe-Axon pClamp 10
Software for statistics KyensLab KyPlot 5.0
Stimulator WPI DS8000
Temperature controller Warner TC-324B
Tetrodotoxin Tocris 1078

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eccles, J. C., Ito, M., Szentagothai, J. The Cerebellum as a Neuronal Machine. , Springer. New York. (1967).
  2. Marr, D. A theory of cerebellar cortex. Journal of Physiology. 202 (2), 437-470 (1969).
  3. Albus, J. S. Theory of cerebellar function. Mathematical Biosciences. 10 (1), 25-61 (1971).
  4. Maekawa, K., Simpson, J. I. Climbing fiber responses evoked in vestibulocerebellum of rabbit from visual system. Journal of Neurophysiology. 36 (4), 649-666 (1973).
  5. Ito, M., Shiida, T., Yagi, N., Yamamoto, M. Visual influence on rabbit horizontal vestibulo-ocular reflex presumably effected via the cerebellar flocculus. Brain Research. 65 (1), 170-174 (1974).
  6. Ghelarducci, B., Ito, M., Yagi, N. Impulse discharge from flocculus Purkinje cells of alert rabbits during visual stimulation combined with horizontal head rotation. Brain Research. 87 (1), 66-72 (1975).
  7. Robinson, D. A. Adaptive gain control of vestibulo-ocular reflex by the cerebellum. Journal of Neurophysiology. 39 (5), 954-969 (1976).
  8. Gilbert, P. F. C., Thach, W. T. Purkinje cell activity during motor learning. Brain Research. 128 (2), 309-328 (1977).
  9. Ito, M., Sakurai, M., Tongroach, P. Climbing fibre induced depression of both mossy fibre responsiveness and glutamate sensitivity of cerebellar Purkinje cells. Journal of Physiology. 324, 113-134 (1982).
  10. Ito, M., Kano, M. Long-lasting depression of parallel fiber-Purkinje cell transmission induced by conjunctive stimulation of parallel fibers and climbing fibers in the cerebellar cortex. Neuroscience Letters. 33 (3), 253-258 (1982).
  11. Ekerot, C. F., Kano, M. Long-term depression of parallel fibre synapses following stimulation of climbing fibres. Brain Research. 342 (2), 357-360 (1985).
  12. Sakurai, M. Synaptic modification of parallel fibre-Purkinje cell transmission in in vitro guinea-pig cerebellar slices. Journal of Physiology. 394, 462-480 (1987).
  13. Hirano, T. Depression and potentiation of the synaptic transmission between a granule cell and a Purkinje cell in rat cerebellar culture. Neuroscience Letters. 119 (2), 141-144 (1990).
  14. Linden, D. J. A long-term depression of AMPA currents in cultured cerebellar purkinje neurons. Neuron. 7 (1), 81-89 (1991).
  15. Linden, D. J., Connor, J. A. Participation of postsynaptic PKC in cerebellar long-term depression in culture. Science. 254 (5038), 1656-1659 (1991).
  16. Ito, M. Cerebellar long-term depression: characterization, signal transduction and functional roles. Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).
  17. Ito, M. The molecular organization of cerebellar long-term depression. Nature Reviews Neuroscience. 3, 896-902 (2002).
  18. Ito, M., Jastreboff, P. J., Miyashita, Y. Specific effects of unilateral lesions in the flocculus upon eye movements in albino rabbits. Experimental Brain Research. 45 (1-2), 233-242 (1982).
  19. Nagao, S. Effects of vestibulocerebellar lesion upon dynamic characteristics and adaptation of vestibulo-ocular and optokinetic responses in pigmented rabbits. Experimental Brain Research. 53 (1), 36-46 (1983).
  20. Watanabe, E. Neuronal events correlated with long-term adaptation of the horizontal vestibulo-ocular reflex in the primate flocculus. Brain Research. 297 (1), 169-174 (1984).
  21. van Neerven, J., Pompeiano, O., Collewijn, H. Effects of GABAergic and noradrenergic injections into the cerebellar flocculus on vestibulo-ocular reflexes in the rabbit. Progress in Brain Research. 88, 485-497 (1991).
  22. Ito, M. Mechanism of motor learning in the cerebellum. Brain Research. 886, 237-245 (2000).
  23. De Schutter, E. Cerebellar long-term depression might normalize excitation of Purkinje cells: a hypothesis. Trends in Neurosciences. 18 (7), 291-295 (1995).
  24. Hansel, C., Linden, D. J. Long-term depression of the cerebellar climbing fiber-Purkinje neuron synapse. Neuron. 26 (2), 473-482 (2000).
  25. Safo, P., Regehr, W. G. Timing dependence of the induction of cerebellar LTD. Neuropharmacology. 54 (1), 213-218 (2007).
  26. Schonewille, M., et al. Reevaluating the role of LTD in cerebellar motor learning. Neuron. 70 (1), 43-500 (2011).
  27. Karachot, L., Kado, T. R., Ito, M. Stimulus parameters for induction of long-term depression in in vitro rat Purkinje cells. Neuroscience Research. 21 (2), 161-168 (1994).
  28. Hartell, N. A. Induction of cerebellar long-term depression requires activation of glutamate metabotropic receptors. Neuroreport. 5, 913-916 (1994).
  29. Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell. 79, 377-388 (1994).
  30. Steinberg, J. P., et al. Targeted in vivo mutations of the AMPA receptor subunit GluR2 and its interacting protein PICK1 eliminate cerebellar long-term depression. Neuron. 46 (6), 845-860 (2006).
  31. Koekkoek, S. K., et al. Deletion of FMR1 in Purkinje cells enhances parallel fiber LTD, enlarges spines, and attenuates cerebellar eyelid conditioning in Fragile X syndrome. Neuron. 47 (3), 339-352 (2005).
  32. Yamaguchi, K., Itohara, S., Ito, M. Reassessment of long-term depression in cerebellar Purkinje cells in mice carrying mutated GluA2 C terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 10192-10197 (2016).
  33. De Schutter, E., Bower, J. M. An active membrane model of the cerebellar Purkinje cell II. Simulation of synaptic responses. Journal of Neurophysiology. 71 (1), 401-419 (1994).
  34. Swensen, A. M., Bean, B. Ionic mechanisms of burst firing in dissociated Purkinje neurons. Journal of Neuroscience. 23 (29), 9650-9663 (2003).
  35. Fukuda, J., Kameyama, M., Yamaguchi, K. Breakdown of cytoskeletal filaments selectively reduces Na and Ca spikes in cultured mammal neurones. Nature. 294 (5836), 82-85 (1981).
  36. Arancillo, M., White, J. J., Lin, T., Stay, T. L., Silltoe, R. V. In vivo analysis of Purkinje cell firing properties during postnatal mouse development. Journal of Neurophysiology. 113, 578-591 (2015).
  37. Ishikawa, T., Shimuta, M., Häusser, M. Multimodal sensory integration in single cerebellar granule cell in vivo. eLife. 4, e12916 (2015).
  38. Tempia, F., Minlaci, M. C., Anchisi, D., Strata, P. Postsynaptic current mediated by metabotropic glutamate receptors in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neurophysiology. 80, 520-528 (1998).
  39. Wang, S. S., Denk, W., Häusser, M. Coincidence detection in single dendritic spines mediated by calcium release. Nature Neuroscience. 3, 1266-1273 (2000).
  40. Kuroda, S., Schweighofer, N., Kawato, M. Exploration of signal transduction pathways in cerebellar long-term depression by kinetic simulation. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5693-5702 (2001).
  41. Wang, W., et al. Distinct cerebellar engrams in short-term and long-term motor learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), E188-E193 (2014).
  42. Inoshita, T., Hirano, T. Occurrence of long-term depression in the cerebellar flocculus during adaptation of optokinetic response. eLife. 27, 36209 (2018).
  43. Belmeguenai, A., et al. Intrinsic plasticity complements long-term potentiation in parallel fiber input gain control in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neuroscience. 30 (41), 13630-13643 (2010).
  44. Ohtsuki, G., Piochon, C., Adelman, J. P., Hansel, C. SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 75, 108-120 (2012).

Tags

Nevrovitenskap Synaptic plastisitet LTD hjerne skive hele-celle-opptak mus Purkinje celle lillehjernen parallell fiber klatring fiber
Vurdering av lang tids depresjon induksjon i voksen lillehjernen skiver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of … More

Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices. J. Vis. Exp. (152), e59859, doi:10.3791/59859 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter