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Neuroscience

Avaliação da indução de depressão em longo prazo em fatias Cerebelares adultas

Published: October 16, 2019 doi: 10.3791/59859
Automatic Translation
1, 2
1Laboratory for Behavioral Genetics, Center for Brain Science, RIKEN, 2Senior Adviser's Office, Center for Brain Science, RIKEN

Summary

Em alguns animais gene-manipulados, usar um único protocolo pode não induzir o LTD em pilhas Cerebelares de Purkinje, e pode haver uma discrepância entre o LTD e a aprendizagem do motor. Os protocolos múltiplos são necessários avaliar a LTD-indução em animais gene-manipulados. Os protocolos padrão são mostrados.

Abstract

A plasticidade sináptica fornece um mecanismo de aprendizado e memória. Para a aprendizagem do motor cerebelar, a depressão a longo prazo (Ltd) de transmissões sináptica das fibras paralelas (PF) às pilhas de Purkinje (PC) é considerada a base para a aprendizagem do motor, e as deficiências do Ltd e da aprendizagem do motor são observadas em vários animais manipulados por genes. Conjuntos de aprendizagem motora comum, como a adaptação do reflexo optocinético (okr), o reflexo vestibular-ocular (VOR) e o teste de do foram utilizados para avaliação da capacidade de aprendizagem motora. Entretanto, os resultados obtidos dos camundongos Knock-in modificados no término do GluA2-carboxy demonstraram a adaptação normal do VOR e do OKR, apesar da falta de PF-LTD. Nesse relatório, a indução do LTD foi tentada somente usando um tipo de protocolo da estimulação na temperatura ambiente. Assim, as condições para induzir o LTD cerebelar foram exploradas nos mesmos mutantes do Knock-in que usam vários protocolos na temperatura fisiológica próxima. Finalmente, nós encontramos protocolos da estimulação, por que LTD poderia ser induzida nestes ratos gene-manipulados. Neste estudo, um conjunto de protocolos é proposto para avaliar a indução de LTD, o que permitirá um exame mais preciso da relação causal entre o LTD e a aprendizagem motora. Em conclusão, as condições experimentais são cruciais na avaliação de LTD em camundongos manipulados por genes.

Introduction

A organização sináptica das redes neuronais elaboradas do córtex cerebelar, composta por PCs, interneurônios de camada molecular (cesta e células esteladas), células de Golgi, PFs de células de grânulos, fibras Mossy e fibras de escalada (CFs), foram elucidados em termos de excitação/inibição e divergência/convergência, e o diagrama de circuitos bem organizados sugeriu que o cerebelo é uma "máquina neuronal"1, embora não houvesse anteriormente nenhuma idéia sobre a finalidade desta "máquina". Posteriormente, a Marr propôs que a entrada de PFs em PCs constitua uma rede de aprendizagem associativa de camada tripla2. Ele também sugeriu que cada CF transmite uma instrução cerebral para o movimento elementar2. Ele assumiu que a ativação simultânea de PFs e CF melhoraria a atividade da sinapse PF-PC, e causava potenciação a longo prazo (LTP) da sinapse PF-PC. Por outro lado, a Albus assumiu que a ativação síncrona de PFs e CF resultou em LTD nas sinapses PF-PC3. Ambos os estudos acima interpretam o cerebelo como um dispositivo original da memória, a incorporação de que na rede cortical cerebelar conduz à formação do modelo da máquina da aprendizagem do modelo de Marr-Albus.

Seguindo estas predições teóricas, duas linhas de evidência sugerem a presença de plasticidade sináptica no cerebelo. A primeira linha de evidência foi sugerida pela organização anatômica do floculus; aqui as vias MF de origem de órgãos vestibulares e vias CF de origem retiniana convergem nos PCs4. Este teste padrão original da convergência sugere que uma plasticidade sináptica que ocorre no flocculus cause a adaptação notável do reflexo vestíbulo-ocular. Segundo, a gravação da resposta dos PCs no floculado e o lesioning do floculus também apoiaram a hipótese acima de5,6,7. Além disso, o padrão de descarga do PC durante a adaptação do movimento da mão de um macaco8 apoiou a hipótese da plasticidade sináptica, especialmente a hipótese de Albus Ltd-3.

Para determinar a natureza da plasticidade sináptica diretamente, a estimulação conjuntivo repetida (CJS) de um pacote de PFS e o CF que inervam especificamente o PC in vivo foi mostrado para induzir o Ltd para a eficácia da transmissão do PF-PC sinapses9, 10,11. Nas explorações subseqüentes in vitro usando uma fatia cerebelar12 e PCes cultivados, a conjunção da estimulação cocultivada da pilha do grânulo e da estimulação da pilha verde-oliva13 ou a conjunção do glutamato após aplicado e somático despolarização14,15causou Ltd . O mecanismo de transdução de sinal subjacente à indução Ltd também foi intensivamente investigado por meio de preparações in vitro16,17.

As adaptações do VOR e do OKR foram usadas frequentemente para a avaliação quantitativa de efeitos da gene-manipulação na aprendizagem do motor cerebelar, porque o córtice vestibule-cerebelar foi provado ser a origem essencial na aprendizagem adaptativa do VOR18 ,19,20 e o okr19,21 a correlação entre a falha da indução do Ltd e o prejuízo da aprendizagem motora comportamental foi tomada como a evidência que Ltd desempenha um papel essencial no motor mecanismos de aprendizagem22. Essas visões são coletivamente referidas como a hipótese de Ltd de aprendizagem motora, ou hipótese de Marr-Albus-Ito23,24,25,26.

A aprendizagem adaptativa do movimento ocular foi mensurada por protocolos semelhantes, enquanto várias condições experimentais foram utilizadas para induzir o Ltd na preparação da fatia27,28,29,30,31 . Recentemente, Schonewille et al.26 relataram que alguns camundongos manipulados por genes demonstraram aprendizagem motora normal, mas as fatias Cerebelares não mostraram o Ltd e, assim, concluíram que a Ltd não era essencial para a aprendizagem motora. Entretanto, a indução de LTD foi tentada somente usando um tipo de protocolo na temperatura ambiente. Daqui, nós usamos diversos tipos de protocolos LTD-induzindo condições da gravação em torno de 30 ° c, e nós confirmamos que o LTD estêve induzido confiantemente nos ratos gene-manipulados usando estes protocolos em temperaturas physiological próximas32.

No entanto, permanecem algumas questões sobre as propriedades básicas da estimulação conjuntiva. O primeiro é a relação entre a forma do pico complexo e a amplitude de LTD. Em segundo lugar, em conjunto com a PF-estimulação e a despolarização somática, se o número de estímulos utilizados era necessário ou não era elusivo. No presente estudo, essas questões foram investigadas com camundongos tipo Wild (WT).

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Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê RIKEN sobre o cuidado e uso de animais em experimentos. Os camundongos foram mantidos na instalação animal do centro de RIKEN para a ciência do cérebro temperatura bem controlada (23 – 25 ° c) e umidade (45% – 65%) Condições. Foram utilizados camundongos do peso masculino e feminino (C57BL/6, 3 – 6 meses).

1. preparação de soluções utilizadas nos experimentos

Nota: Todas as soluções devem ser feitas em água ultrapura livre de metais (resistividade > 18,2 MΩ) e outras impurezas (carbono orgânico total (TOC) < 5,0 ppb). O líquido cerebrospinal artificial de trabalho (ACSF) para cortar-corte e a gravação são feitos recentemente no dia da experiência de um estoque de 10 vezes (X10) de ACSF. Bubble as soluções com 5% CO2/95% o2 gás mistura antes de usar. O pH do ACSF é ajustado para 7,4 ± 0,1, e a osmolaridade é ajustada 315 ± 5 mOsm/kg adicionando água ultrapura.

  1. Prepare o estoque 10x de ACSF contendo 1250 mM de NaCl, 30 mM KCl, 12,5 mM NaH2po4e 260 mm NaHCO3. Esta solução pode ser armazenada a 4 ° c.
  2. Prepare o trabalho ACSF contendo 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl1,2mm mg2so4, 1,25 mm NaH2po4, 26 mm NaHCO3 e 20 mm glicose.
    1. Em primeiro lugar, adicionar 1 mL de 2 M CaCl2 solução seguida de 1 ml de 1 m mg2so4 solução em torno de 800 ml de água ultrapura, para evitar a precipitação. Em seguida, adicione 100 mL de 10x ACSF e glicose. Finalmente, compo a um volume total de 1.000 ml adicionando a água ultrapura.
  3. Prepare 3,3% de agar para manuseio cerebral. Dissolva 1 g de agar em 30 mL de solução de NaCl a 0,9% e aqueça-o num microondas até ferver. Mexa para misturar, em seguida, despeje-o em uma caixa de plástico estéril de 4 cm x 10 cm e deixe solidificar. Guarde a placa de agar (~8 mm de espessura) num frigorífico.
  4. Prepare a solução interna.
    1. Prepare a solução interna baseada em K+contendo 60 mm kcl, 60 mm k-gluconato, 0,3 mm EGTA, 4 mm MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mm GTP e 30 mm hepes (pH 7,2).
      Nota: Baixa concentração (0,3 mM) de EGTA, um lento CA2 +-chelator, é adicionado ao quelato possivelmente contaminado CA2 + em água pura, mas esta baixa concentração de EGTA na solução interna nunca bloqueia a indução de Ltd (Figura 3, Figura 4, Figura 5) durante a gravação de células inteiras. A pressão osmótica medida é 285 mOsm/kg.
    2. Prepare a solução interna baseada em cs+contendo 60 mm de cscl, 46 mm D-gluconato, cloreto de tetraetilamónio de 27 mm (Tea-CL), 0,3 mm EGTA, 4 mm MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mm GTP e 30 mm hepes (pH 7,2, ajustado usando CsOH).
      Nota: Cs+ bloqueia os canais K dependentes de tensão e melhora as condições de fixação do espaço em dendritos remotos, aumentando o comprimento-constante. A pressão osmótica medida é 285 mOsm/kg.
    3. Prepare 200 μL de alíquotas das soluções e armazene a-30 ° c.

2. dissecção e corte cerebral

  1. Chill e oxigenar 2 50 mL copos de ACSF no gelo até que a temperatura é menor do que 4 ° c. Adicionar 50 μL de tetrodotoxina (TTX, 1 mM) em um dos copos gelados de ACSF e reservá-lo para corte de fatias. Para obter a fatia cerebelar do rato reservando a habilidade indutora de LTD, a adição de TTX ao ACSF normal é necessária.
  2. Resfriar a bandeja de amostra de metal preenchendo uma área de banho de gelo da câmara de corte com gelo.
  3. Despeje 1 mL de isoflurano em um frasco de anestesia (~1000 ml), em seguida, coloque um mouse nele por 30 – 45 s. Certifique-se de que o rato está profundamente anestesiado confirmando a sua incapacidade de responder à estimulação mecânica.
  4. Decapitar o rato usando tesouras cirúrgicas. Segure a cabeça e corte a pele superficial ao longo da linha média usando uma tesoura oftalmológica. Puxe a pele segurando com os dedos para expor amplamente a superfície do crânio.
  5. Corte o crânio horizontalmente ao longo de uma linha do furo spinocerebellar principal apenas acima da orelha e do olho usando uma tesoura oftalmológico. Corte o crânio ao longo de uma linha acima dos dois olhos e retire para isolar o crânio.
  6. Corte o cérebro no meio do encéfalo usando um bisturi, em seguida, isolar a parte caudal do cérebro, incluindo o cerebelo do crânio. Mergulhe-o em uma taça gelada de ACSF. Geralmente, o tempo total da decapitação à imersão do bloco do cérebro na Taça pre-refrigerada de ACSF deve ser menos do que 60 s.
  7. A posição da tubulação de borbulhagem deve ser ajustada de modo a para não agitar o bloco do cérebro no béquer. Danos mecânicos podem causar inchaço da fatia durante a gravação. Deixe-o por pelo menos 7 min e deixe o cérebro esfriar.
  8. Para aparar o bloco cerebral, corte uma peça de agar retangular (2 cm x 2 cm) de uma grande placa de agar (4 cm x 10 cm, armazenada a 4 ° c) e coloque-a em um papel de filtro para absorver o excesso de líquido.
  9. Gire a parte de agar de cabeça para baixo no papel de filtro e coloque a peça de agar em um papel de filtro em uma bandeja de amostra de metal pré-refrigerada (16 cm x 20 cm). Pegar o bloco de cérebro usando uma espátula e absorver o líquido excessivo em torno dele com um pedaço de papel de filtro.
  10. Monte o bloco do cérebro no bloco do agar usando a colagem (adesivo imediato do cianoacrilato médico). Certifique-se de anexar o fundo (lado ventral) do bloco cerebral para o agar.
  11. Corte o hemisfério direito com uma lâmina. Certifique-se de que o lado do plano de corte seja o mais paralelo possível ao plano dendrítico do PC, pois este lado está anexado à superfície da bandeja de amostra. Corte e retire o outro lado do hemisfério. Em seguida, cortar o cérebro entre o colliculi superior e inferior, e cortar a medula espinhal.
  12. Cole o lado direito do cerebelo cortado com o bloco de agar na bandeja de amostra pré-refrigerada. Espalhe o excesso de cola em torno do cerebelo com a parte plana de uma espátula, para evitar o excesso de cola de anexar à superfície cerebelar. Incline a bandeja de metal e despeje ACSF a fim de fixar a cola e lavar o excesso de cola.

3. corte cerebral

  1. Orientar a amostra de tal forma que o lado dorsal do cerebelo está na parte da frente. Despeje o corte gelo-frio ACSF, contendo 1 μM TTX, suficiente para mergulhar o cerebelo completamente. Coloque um tubo de gás no ACSF e comece a borbulhar com O2/co2 mistura de gás.
  2. Remova o Mater do do arachnoid usando um pinça fino binóculos. Corte o pedúnculo cerebelar com uma lâmina, e remova o tronco cerebral e o bloco de agar. Gire a bandeja 180 °, de modo que a superfície dorsal do cerebelo enfrenta um Razorblade.
  3. Defina a lâmina e ajuste o primeiro local de corte. Defina os parâmetros de corte do do para o seguinte: amplitude para 5,5, frequência para 85 Hz, velocidade para 3 – 4 e espessura de fatia para 300 μm.
  4. Transfira a fatia cerebelar em uma nylon-rede em uma incubadora acrílica e mergulhe a fatia completamente no ACSF oxigenado. A incubadora deve ser coloc em um água-banho que mantenha uma temperatura em 26 ° c.
  5. Armazene as fatias por pelo menos 1 h para permitir a recuperação do dano durante a fatiagem.

4. gravação da remendo-braçadeira da inteiro-pilha

Nota: Uma gravação da remendo-braçadeira exige o seguinte equipamento: um microscópio ereto com óptica infravermelha do contraste da interferência diferencial (IR-DIC), um amplificador da remendo-braçadeira, digitador dos dados, stimulator digital, isolador, computador, software para a aquisição de dados e análise, manipulator motorizado, plataforma do microscópio, tabela da isolação da vibração, gaiola de Faraday, sistema de aquecimento da solução, bombas peristáltica e extrator do elétrodo.

  1. Adicionar o (0,1 mm) para ACSF e resolvê-lo usando ultra-sonication por 3 min.
  2. Perfuse uma câmara de gravação com a Picrotoxina contendo, O2-co2-saturado ACSF na taxa de 2 ml/min. manter a temperatura da câmara de gravação em torno de 30 ° c.
  3. Faça um eletrodo de gravação puxando um vidro de borosilicato capilar com filamento (diâmetro externo = 1,5 mm) usando um extrator com 4 degraus. A ponta-diâmetro deve ser em torno de 1 μm.
  4. Faça um elétrodo de estimulação puxando o mesmo capilar usando o extrator com 2 etapas, a seguir quebre para produzir uma ponta fina golpeando a ponta de encontro a um bloco do ferro um microscópio binocular. O diâmetro final deve ser de 3 – 5 μm.
  5. Transfira a fatia cerebelar para a câmara de gravação e fixe-a com um peso pt com fios de nylon. Encha um eletrodo estimulante com ACSF.
  6. Para a estimulação dos PFs, coloc o elétrodo de estimulação na superfície da camada molecular, em torno de 50 μm longe da camada da pilha de Purkinje.
  7. Para a estimulação do CF, coloc o elétrodo de estimulação na parte inferior da camada da pilha de Purkinje (etapas 5,3, 5,4).
  8. Filtrar K+-based ou cs+-based solução interna com um filtro de 0,45 μm. Use uma microcarregadeira para encher um eletrodo de gravação com 8 μL de solução interna.
  9. Aplique uma fraca pressão positiva no eletrodo de gravação antes de mergulhá-la no ACSF. Sua resistência deve ser 2 – 4 MΩ e o potencial juncional líquido deve ser corrigido.
  10. Aproxime o corpo sadio, brilhante da pilha do PC com o elétrodo da gravação. Empurre a superfície da pilha de Purkinje ligeiramente, pare de aplicar a pressão positiva, a seguir aplique a pressão negativa até formar um selo do giga-ohm. Em seguida, estabeleça a configuração da célula inteira usando pressão negativa.
  11. Segure o potencial de membrana em-70 mV, e aplique-2 mV pulso (duração, 100 ms) em 0,1 Hz para monitorar a resistência de entrada, resistência da série e capacitância de entrada, continuamente. Não use a compensação de resistência da série. Descarte os dados quando a resistência da série varia em mais de 15%.

5. indução de LTD

  1. Estimular a camada molecular com um pulso (duração, 0,1 ms). Identifique as correntes pós-sinápticas PF-excitatórias (EPSC) aplicando um estímulo de pulso duplo (intervalo interspike (ISI) de 50 ms). O PF-EPSC deve apresentar facilitação de pulso pareado e aumento gradual da amplitude em relação ao aumento da intensidade de estimulação.
  2. Registre a resposta de teste do PF-EPSC aplicando um único pulso em 0,1 Hz. Ajuste a intensidade do estímulo de modo que a amplitude evocada de EPSC seja em torno de 200 pA. Evite a contaminação da corrente através do canal iônico dependente da voltagem.
  3. Estimular a FC na parte inferior da camada de células de Purkinje, e identificar o EPSC eliciado pela ativação CF (aplicando um estímulo de pulso duplo). O CF-EPSC deve mostrar a depressão do pulso emparelhado e uma maneira All-or-None de acordo com o aumento na intensidade da estimulação. Para a indução do LTD, um único estímulo deve ser usado.
  4. Protocolo de indução de LTD 1
    1. Usando um eletrodo contendo solução interna baseada em K+condições de aperto atual, aplique um único estímulo PF e um único estímulo CF simultaneamente a 1 Hz por 5 min (300 pulsos) (Figura 1a).
  5. Protocolo de indução de LTD 2
    1. Usando uma solução interna com base em K+contendo eletrodo condições de aperto atual, aplique duplo PF-ESTÍMULOS (ISI de 50 ms) e único estímulo CF, pois o segundo estímulo PF é coincidente com estímulos CF a 1 Hz por 5 min (Figura 1b).
  6. Protocolo de indução de LTD 3
    1. Usando um elétrodo que contem a solução interna de cs+-based condições da tensão-braçadeira, aplique um PF-estímulo dobro (ISI de 50 ms) e uma única tensão-etapa despolarizantes (-70 a 0 MV, 50 ms) ao soma em 1 Hertz por 3 minutos, de modo que o segundo PF-estímulo seja equivalente ao início da etapa de tensão despolarizante (Figura 1C).
  7. LTD-induzindo Protocol-4
    1. Usando um elétrodo que contem a solução interna de cs+-based condições da tensão-braçadeira, aplique os PF-estímulos (5x em 100 hertz) e uma única tensão-etapa despolarizantes (-70 a 0 milivolt, 50 ms) ao soma em 0,5 hertz por 3 minutos, simultaneamente (Figura 1D ).

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Representative Results

Quatro protocolos foram utilizados neste estudo para induzir o cerebelar LTD. Nos dois primeiros protocolos (protocolo 1 e 2), aplicou-se a conjunção da PF-estimulação e a CF-estimulação condições de aperto atual. Nos outros dois protocolos (protocolo 3 e 4), a despolarização somática foi substituída para a CF-estimulação condições da tensão-braçadeira. Os traços de tensão ou traços de corrente durante a estimulação conjuntiva foram comparados (Figura 2).

A junção de 1 PF-estimulação e 1 CF-estimulação condições da corrente-braçadeira (protocolo-1) foram usadas convencionalmente para a preparação26,27da fatia. A forma do pico complexo eliciado pelo CJ foi semelhante àquela eliciada pelo CF-estímulo sozinho, com o primeiro spikelet íngreme seguido por 2 a 3 espiguetas (Figura 2a). Um ponto complexo similarmente dado forma foi observado durante a estimulação com protocolo 2, a saber, 1 PF-estimulação foi seguida 50 ms mais tarde por um segundo PF-e CF-estimulação conjuntivo (Figura 2b). condições de tensão-braçadeira usando uma solução interna baseada em cs+, foi aplicada a conjunção de uma estimulação 2 PF e a despolarização somática (protocolo 3) (Figura 2C). A primeira PF-estimulação foi seguida 50 ms mais tarde por uma aplicação concomitante de uma segunda PF-estimulação e despolarização somática. Uma corrente interna foi eliciada sobre a despolarização somática de-70 a 0 milivolt. Uma corrente da cauda foi evocada igualmente após o repolarization. Às vezes, a geração repetitiva de uma corrente interna foi observada, o que refletiria a atividade de CA-Spike na região dendrítica remota, onde o potencial de membrana não foi apertado suficientemente, apesar de usar uma solução interna baseada em cs+( Figura 2C). Por fim, 5 estímulos PF em 100 Hz foram administrados simultaneamente com a despolarização somática condições de tensão-braçadeira (protocolo 4). Outra vez, a geração repetitiva de correntes internas foi eliciada durante a despolarização e uma corrente da cauda foi eliciada após a repolarização. A cronometragem da geração repetitiva da corrente interna não foi sincronizada com os PF-estímulos (Figura 2D). Às vezes, a geração repetitiva da corrente interna continuou após a repolarização.

Quanto para ao LTD induzido por protocolos-1 e-2, a redução do EPSC-amplitude medida durante os 25-min após o início de CJ foi dispersada sobre uma escala relativamente larga32. Comparado com a forma estável do PF-EPSP, a forma de espiga complexa foi bastante variável de célula para célula. Porque os espiguetas em um ponto complexo refletiram o CA2 +-a ativação33da canaleta, a forma de um ponto complexo, tal como a amplitude ou o inclinação dos espiguetas, afetando a amplitude do Ltd foi examinada com o ponto complexo eliciado pelo Protocolo 1. Como a forma dos picos complexos eliciados pelo protocolo 2 foram contaminados com o PF-EPSP, não analisamos esses dados. Em primeiro lugar, a soma de todas as espiguetas (1 – 4)-amplitude foi correlacionada com a amplitude do LTD (-ΔEPSC%) (Figura 3A, B). O coeficiente de correlação (r) foi de 0,28, mas não foi estatisticamente significante (p > 0,5). Porque espiguetas 2 – 4 continha mais do CA2 +-componente34, a soma do spikelet (2 – 4)-amplitude foi correlacionada com o Ltd-amplitude. A correlação pareceu ser mais forte (r = 0,67), mas ainda não estatisticamente significante (p > 0,1) (Figura 3C). Em seguida, calculou-se o valor máximo de dVm/DT (taxa máxima de ascensão [MRR]) de cada espigueta (Figura 3D), pois o produto da capacitância da membrana (cm) e DVM/DT reflete aproximadamente as correntes de membrana35. A correlação entre o produto do cm e a soma de MRRs de espiguetas (1 – 4) e a amplitude-LTD foi examinada (Figura 3E), e r foi 0,18 (p > 0,9). A correlação entre o produto do cm e a soma do MRR de espiguetas (2 – 4) mostrou um r ligeiramente mais forte (0,36), mas não foi significante (p > 0 .6) (Figura 3F).

condições da braçadeira da tensão, o protocolo 3 com 180 CJS induziu eficientemente LTD (Figura 4B)32. No entanto, se um número menor de estímulos pode efetivamente induzir LTD permanece desconhecido. Assim, 60 CJS foram aplicados em 1 Hz por 1 min. em torno de 10 min após CJ, a amplitude de EPSC foi suprimida, entretanto, recuperou em 15 minutos após CJ-início. Isso sugere que 60 vezes CJS em 1 Hz foi insuficiente para induzir LTD (figura 4a). Além disso, a repetição da despolarização somática isoladamente (180 vezes) não induziu a LTD (Figura 4B)32.

O protocolo 4 foi originalmente utilizado por Steinberg et al.30 para camundongos jovens (P14 – 21). LTD foi supostamente induzida por 30 CJS em 0,5 Hz em RT no cerebelo tipo selvagem. Entretanto, quando 30 CJS foram aplicados à fatia cerebelar dos ratos adultos (3 – 6 meses) em torno de 30 ° c, nenhum LTD foi induzido (Figura 5a). Em contrapartida, quando 90 CJS foram aplicados, observou-se a amplitude usual de LTD (Figura 5b)32. Novamente, a despolarização somática isolada (90 vezes a 0,5 Hz) não induziu a LTD (Figura 5b).

Figure 1
Figura 1: ilustração esquemática dos protocolos para induzir o Ltd na sinapse PF-PC. (A) protocolo 1 CJ. 1 PF e 1 estímulo CF são aplicados simultaneamente 300 vezes a 1 Hz (5 min) condições de aperto atual. O elétrodo para a gravação da inteiro-pilha contem K+-baseou a solução interna. (B) os estímulos do protocolo 2 CJ. 2 PF e 1 CF são aplicados simultaneamente 300 vezes a 1 Hz (5 min) a condição de pinça atual. O elétrodo contem a solução interna K+-based. (C) protocolo 3 CJ. 2 PF e despolarização somática (-70 a 0 mV, 50 ms) são aplicados 180 vezes a 1 Hz (3 min) condição de braçadeira de tensão, de modo que o segundo estímulo PF seja aplicado simultaneamente com o início da despolarização somática. Eletrodo contém solução interna baseada em cs+. (D). protocolo 4 CJ. 5 PF em 100 Hz e despolarização somática são aplicados 90 vezes em 0,5 Hz (3 min) condição de tensão-braçadeira, simultaneamente. Eletrodo contém solução interna baseada em cs+. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: tensão ou traços atuais do PC durante a estimulação da conjunção. (A) rastreamento de potencial de membrana eliciado pelo Protocolo 1 CJ. (B) rastreamento de potencial de membrana eliciado pelo protocolo 2 CJ. (C) traço da corrente de membrana eliciado pelo protocolo 3 CJ. (D) traço atual da membrana eliciado pelo protocolo 4 CJ. Barras verticais = 10 mV (A e B), 1 nA (C e D). Barra horizontal = 20 ms. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: relação entre a espigueta de um pico complexo e a amplitude do Ltd. (A) traço representativo de um ponto complexo eliciado pelo Protocolo 1. As setas indicam picos de espiguetas (1 – 4). Barra de escala = 20 mV. (B) relação entre a soma da amplitude das espiguetas (1 – 4) e da amplitude Ltd (-ΔEPSC%) (r = 0,28, p > 0,5). (C) relação entre a soma da amplitude das espiguetas (2 – 4) e a amplitude do Ltd (r = 0,67, p > 0,1). (D) traço representativo de picos complexos diferenciados mostrados em A. setas indicam picos de DVm/DT de espiguetas. Barras de escala = 5 ms, 50 V/s. (e) relação entre os produtos do cm e a soma do MRR de espiguetas (1 – 4) e amplitude de Ltd (-ΔEPSC%) (r = 0,18, p > 0,7). (F) relação entre o produto do cm e a soma do MRR de espiguetas (2 – 4) e amplitude de Ltd (r = 0,36, p > 0,4). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: efeito do número de repetições em Ltd-Induction usando o protocolo-3 CJ. (A) falha da indução de Ltd pelo protocolo-3 CJ, a repetição foi de 60 a 1 Hz. média da amplitude do PF-EPSC registrada antes e após o protocolo-3 CJ (coluna preta na parte inferior). A amplitude de PF-EPSC foi normalizada por aqueles gravados antes de CJ. o símbolo enchido indica a amplitude média de EPSC. As barras de erro denotam SEM. Inset: os traços superimpostos de PF-EPSC (parte superior) foram gravados antes (marcado 1) e 25 – 29 minutos após o início de CJ-Stim (marcado 2). Cada traço representa a média de 6 registros. Barras de escala = 100 pA, 10 ms. (B) símbolo vermelho: Ltd induzida pelo protocolo 3 CJ, a repetição foi 180 vezes em 1 Hz. símbolo azul: nenhuma estimulação da conjunção mas a despolarização somática foi aplicada 180 vezes em 1 hertz. o Ltd não foi induzido. Inset: os traços superpostos do PF-EPSC (parte superior) foram gravados antes (marcados 3) e 25 – 29 minutos após o início de CJ-Stim (marcado 4). Cada traço representa a média de 6 registros. Barras de escala = 100 pA, 10 ms. os dados mostrados em B são os mesmos utilizados na Figura 3B de Yamaguchi et al.32. (C). parcela sumária da amplitude média de PF-EPSC registrada durante 25 – 29 minutos após o início de CJ. DEPOL: despolarização. O carácter numérico entre parênteses representa o número de células. X60 = 60 vezes, X180 = 180 vezes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: efeito do número de repetições em Ltd-Induction utilizando o protocolo 4 CJ. (A) falha da indução do Ltd pelo protocolo 4 CJ, a repetição foi 30 vezes em 0,5 Hz. média da amplitude PF-EPSC registrada antes e após o protocolo-4 CJ (coluna preta na parte inferior do thr). O símbolo enchido indica a amplitude média de EPSC. As barras de erro denotam SEM. Inset: os traços superimpostos de PF-EPSC (parte superior) foram gravados antes (marcado 1) e 25 – 29 minutos após o início de CJ-Stim (marcado 2). Cada traço representa a média de 6 registros. Barras de escala = 100 pA, 10 ms. (B) símbolo vermelho: Ltd induzida pelo protocolo 4 CJ., símbolo azul: nenhuma estimulação da conjunção mas a despolarização somática foi aplicada 180 vezes em 0,5 Hz. Ltd não foi induzida. Inset: os traços superpostos do PF-EPSC (parte superior) foram gravados antes (marcados 3) e 25 – 29 minutos após o início de CJ-Stim (marcado 4). Barras de escala = 100 pA, 10 ms. os dados mostrados em B são os mesmos utilizados na Figura 4B de Yamaguchi et al. 32. (C). Parcela sumária da amplitude média de PF-EPSC registrada durante 25 – 29 minutos após o início de CJ. DEPOL: despolarização. O carácter numérico entre parênteses representa o número de células. X30 = 30 vezes, = 90 vezes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Diferenças entre os quatro protocolos

Nos protocolos de indução de LTD 1 e 2, CJS 300 vezes em 1 Hz é suficiente para induzir cerebelar LTD. a frequência de estimulação da FC pareceu estar em uma faixa fisiológica, pois a taxa de queima de espiga complexa em camundongos adultos alertas ("") foi relatada como sendo 1,25 Hz36. No entanto, a estimulação da FC isoladamente não ocasionou a plasticidade a longo prazo na sinapse PF-CF, conforme utilizado nos protocolos 1 e 2 (Figura 4, Figura 5), embora a CF-estimulação isoladamente em maior frequência induzida pela ltd24. A forma do pico complexo, eliciado no protocolo 1, também não teve relação significativa com a amplitude-LTD (Figura 3). Talvez a forma do pico complexo reflita a média CA2 +-concentração, mas não representava o CA local2 +-concentração em um branchlet onde Ltd foi induzida.

Em relação à estimulação PF, embora 1 PF estimulação foi convencionalmente utilizado para induzir cerebelar Ltd26,27, a célula do grânulo tendiam a disparar em modo burst in vivo37. Conseqüentemente, as ativações múltiplas do picofarad seriam melhores do que uma única estimulação do picofarad para imitar o teste padrão fisiológico do acendimento, e a ativação mGluR1 dependeu do número e da freqüência de disparar38do picofarad. Assim, o protocolo-2 ativaria PKC mais intensivamente do que o protocolo-1. Em alguns ratos GluA2 mutado do Knock-in (K882A), somente Protocol-2 era suficiente para induzir o Ltd em comparação com o protocolo 132, sugerindo que uma concentração mais elevada de PKC ativado estêve exigida para induzir o Ltd para esta mutação GluA2 particular.

As estimulações múltiplas do PF aumentariam a incidência do LTD-Induction, mas a ativação de uma tensão dependente CA2 +-canaleta através da CF-estimulação ou da despolarização somática era ainda exigida. A fim de aumentar a ativação de uma tensão-dependente CA2 +-canal no DENDRITE PC, onde o PF foi estimulado, o corpo da célula do PC foi despolarizado tensão-braçadeira condições30. Ao usar uma solução interna baseada em cs+, a resistência de entrada aumentou marcadamente32, sugerindo um aumento na constante do cabo. Consequentemente, o número de canais ativados de CA2 +na área distal do dendrito do PC seria aumentado. Em alguns camundongos mutantes GluA2 (Δ7), estimulação 2PF + despolarização somática (protocolo 3) ou 5 estimulação PF + despolarização somática (protocolo 4) poderia induzir LTD. Inversamente, nenhum fenômeno de LTD foi observado pelo Protocolo 1 ou 2 estimulação. Pode ser que a despolarização somática condições da tensão-braçadeira com cs+-a solução interna ativou a tensão-dependente CA2 +-os canais ocorrem mais eficazmente do que a ativação pelo CF-estimulação circunstâncias da atual-braçadeira com K+-based solução interna, e isso pode causar um aumento não-aditivo em [Ca2 +]em39 e um subsequente robusto PKC-ativação necessária para Ltd.

Possível mecanismo compensatório para LTD em animais manipulados por genes

O estudo teórico supõe uma ativação do tipo All-or-None de PKC em cima da indução LTD40, mas em resultados experimentais usando alguns animais gene-manipulados tais como GluA2 Knock-in os ratos demonstraram que a ativação de PKC variou dependendo da indução de Ltd protocolos32. Entre 4 protocolos diferentes, o protocolo de indução mais efetivo para ativação do PKC foram os protocolos 3 e 4, seguidos pelo protocolo 2 e o mais fraco foi o protocolo 1. Em animais manipulados por genes, os mecanismos compensatórios podem estar causando LTD32. Tais mecanismos compensatórios podem ter menor sensibilidade ao PKC ativado. Se assim for, vários conjuntos de protocolos de indução LTD, incluindo um que pode ativar PKC mais forte do que os protocolos convencionais, é necessário para avaliar a capacidade de indução LTD em animais manipulados por genes. Embora a indução normal de LTD com a solução interna baseada em cs+seja relatada em PCs cultivados15 ou PCs em fatias30, uma solução interna baseada em cs+não é fisiológica. No entanto, a ativação de um canal CA2 +dependente de tensão em um dendrito remoto é difícil usando a despolarização somática na fatia, devido aos possíveis danos mecânicos durante a preparação e gravação que podem causar uma diminuição na comprimento-constante. Assim, para garantir a ativação de CA2 +-canais na região dendrítica estimulando a PF, é necessário usar um protocolo que aumenta a duração-constante usando uma solução cs+-Internal.

Outras condições experimentais

Outros fatores também devem ser levados em consideração quando a plasticidade sináptica e o comportamento animal são examinados paralelamente, como a correspondência entre a idade animal e a temperatura de gravação in vitro, pois as constantes da taxa de transdução de sinal e o tráfico de receptores são altamente sensíveis à temperatura. Na verdade, a aprendizagem motora in vivo reduziu o número de receptores de glutamato tipo GABA expressos em superfície41 e o tamanho do mini-EPSC assíncrono na sinapse PF-PC42. Idealmente, a gravação da braçadeira de remendo da todo-pilha deve ser feita no ° c 37, entretanto, uma gravação a longo prazo estável é difícil em 37 ° c. Assim, todas as gravações eletrofisiológicas deste estudo foram realizadas em torno de 30 ° c. Embora esta temperatura seja mais baixa do que a temperatura fisiológica, ainda proporcionaria condições mais favoráveis para comparar as propriedades sinápticas analisadas in vitro com a capacidade de aprendizagem comportamental. Essa diferença nas temperaturas de gravação pode ser outro fator para fazer com que esses resultados sejam diferentes do relatório anterior26. Além disso, a avaliação da constância das propriedades da membrana passiva32 e a excitabilidade intrínseca43,44 também é importante no estudo da plasticidade sináptica.

Concluindo, para investigar a relação causal entre a plasticidade sináptica e o comportamento animal em animais manipulados por genes, a avaliação da plasticidade sináptica in vitro exigiria um controle cuidadoso das condições experimentais, como a utilização da temperatura regulamentação e vários tipos de protocolos.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos A A. Oba por sua assistência técnica. Esta pesquisa foi parcialmente apoiada por Grant-in-Aid para pesquisa científica (C) 17K01982 para KY

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier Molecular Devices-Axon Multiclamp 700B
Borosilicate glass capillary Sutter BF150-110-10
Digitizer Molecular Devices-Axon Digidata1322A
Electrode puller Sutter Model P-97
Isoflurane FUJIFILM Wako Pure Chemical 26675-46-7
Isolator A.M.P.I. ISOflex
Linear slicer Dosaka EM PRO7N
Microscope NIKON Eclipse E600FN
Peristaltic pump Gilson MP1 Single Channel Pump
Picrotoxin Sigma-Aldrich P1675
Pure water maker Merck-Millipore MilliQ 7000
Software for experiment Molecular probe-Axon pClamp 10
Software for statistics KyensLab KyPlot 5.0
Stimulator WPI DS8000
Temperature controller Warner TC-324B
Tetrodotoxin Tocris 1078

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References

  1. Eccles, J. C., Ito, M., Szentagothai, J. The Cerebellum as a Neuronal Machine. , Springer. New York. (1967).
  2. Marr, D. A theory of cerebellar cortex. Journal of Physiology. 202 (2), 437-470 (1969).
  3. Albus, J. S. Theory of cerebellar function. Mathematical Biosciences. 10 (1), 25-61 (1971).
  4. Maekawa, K., Simpson, J. I. Climbing fiber responses evoked in vestibulocerebellum of rabbit from visual system. Journal of Neurophysiology. 36 (4), 649-666 (1973).
  5. Ito, M., Shiida, T., Yagi, N., Yamamoto, M. Visual influence on rabbit horizontal vestibulo-ocular reflex presumably effected via the cerebellar flocculus. Brain Research. 65 (1), 170-174 (1974).
  6. Ghelarducci, B., Ito, M., Yagi, N. Impulse discharge from flocculus Purkinje cells of alert rabbits during visual stimulation combined with horizontal head rotation. Brain Research. 87 (1), 66-72 (1975).
  7. Robinson, D. A. Adaptive gain control of vestibulo-ocular reflex by the cerebellum. Journal of Neurophysiology. 39 (5), 954-969 (1976).
  8. Gilbert, P. F. C., Thach, W. T. Purkinje cell activity during motor learning. Brain Research. 128 (2), 309-328 (1977).
  9. Ito, M., Sakurai, M., Tongroach, P. Climbing fibre induced depression of both mossy fibre responsiveness and glutamate sensitivity of cerebellar Purkinje cells. Journal of Physiology. 324, 113-134 (1982).
  10. Ito, M., Kano, M. Long-lasting depression of parallel fiber-Purkinje cell transmission induced by conjunctive stimulation of parallel fibers and climbing fibers in the cerebellar cortex. Neuroscience Letters. 33 (3), 253-258 (1982).
  11. Ekerot, C. F., Kano, M. Long-term depression of parallel fibre synapses following stimulation of climbing fibres. Brain Research. 342 (2), 357-360 (1985).
  12. Sakurai, M. Synaptic modification of parallel fibre-Purkinje cell transmission in in vitro guinea-pig cerebellar slices. Journal of Physiology. 394, 462-480 (1987).
  13. Hirano, T. Depression and potentiation of the synaptic transmission between a granule cell and a Purkinje cell in rat cerebellar culture. Neuroscience Letters. 119 (2), 141-144 (1990).
  14. Linden, D. J. A long-term depression of AMPA currents in cultured cerebellar purkinje neurons. Neuron. 7 (1), 81-89 (1991).
  15. Linden, D. J., Connor, J. A. Participation of postsynaptic PKC in cerebellar long-term depression in culture. Science. 254 (5038), 1656-1659 (1991).
  16. Ito, M. Cerebellar long-term depression: characterization, signal transduction and functional roles. Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).
  17. Ito, M. The molecular organization of cerebellar long-term depression. Nature Reviews Neuroscience. 3, 896-902 (2002).
  18. Ito, M., Jastreboff, P. J., Miyashita, Y. Specific effects of unilateral lesions in the flocculus upon eye movements in albino rabbits. Experimental Brain Research. 45 (1-2), 233-242 (1982).
  19. Nagao, S. Effects of vestibulocerebellar lesion upon dynamic characteristics and adaptation of vestibulo-ocular and optokinetic responses in pigmented rabbits. Experimental Brain Research. 53 (1), 36-46 (1983).
  20. Watanabe, E. Neuronal events correlated with long-term adaptation of the horizontal vestibulo-ocular reflex in the primate flocculus. Brain Research. 297 (1), 169-174 (1984).
  21. van Neerven, J., Pompeiano, O., Collewijn, H. Effects of GABAergic and noradrenergic injections into the cerebellar flocculus on vestibulo-ocular reflexes in the rabbit. Progress in Brain Research. 88, 485-497 (1991).
  22. Ito, M. Mechanism of motor learning in the cerebellum. Brain Research. 886, 237-245 (2000).
  23. De Schutter, E. Cerebellar long-term depression might normalize excitation of Purkinje cells: a hypothesis. Trends in Neurosciences. 18 (7), 291-295 (1995).
  24. Hansel, C., Linden, D. J. Long-term depression of the cerebellar climbing fiber-Purkinje neuron synapse. Neuron. 26 (2), 473-482 (2000).
  25. Safo, P., Regehr, W. G. Timing dependence of the induction of cerebellar LTD. Neuropharmacology. 54 (1), 213-218 (2007).
  26. Schonewille, M., et al. Reevaluating the role of LTD in cerebellar motor learning. Neuron. 70 (1), 43-500 (2011).
  27. Karachot, L., Kado, T. R., Ito, M. Stimulus parameters for induction of long-term depression in in vitro rat Purkinje cells. Neuroscience Research. 21 (2), 161-168 (1994).
  28. Hartell, N. A. Induction of cerebellar long-term depression requires activation of glutamate metabotropic receptors. Neuroreport. 5, 913-916 (1994).
  29. Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell. 79, 377-388 (1994).
  30. Steinberg, J. P., et al. Targeted in vivo mutations of the AMPA receptor subunit GluR2 and its interacting protein PICK1 eliminate cerebellar long-term depression. Neuron. 46 (6), 845-860 (2006).
  31. Koekkoek, S. K., et al. Deletion of FMR1 in Purkinje cells enhances parallel fiber LTD, enlarges spines, and attenuates cerebellar eyelid conditioning in Fragile X syndrome. Neuron. 47 (3), 339-352 (2005).
  32. Yamaguchi, K., Itohara, S., Ito, M. Reassessment of long-term depression in cerebellar Purkinje cells in mice carrying mutated GluA2 C terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 10192-10197 (2016).
  33. De Schutter, E., Bower, J. M. An active membrane model of the cerebellar Purkinje cell II. Simulation of synaptic responses. Journal of Neurophysiology. 71 (1), 401-419 (1994).
  34. Swensen, A. M., Bean, B. Ionic mechanisms of burst firing in dissociated Purkinje neurons. Journal of Neuroscience. 23 (29), 9650-9663 (2003).
  35. Fukuda, J., Kameyama, M., Yamaguchi, K. Breakdown of cytoskeletal filaments selectively reduces Na and Ca spikes in cultured mammal neurones. Nature. 294 (5836), 82-85 (1981).
  36. Arancillo, M., White, J. J., Lin, T., Stay, T. L., Silltoe, R. V. In vivo analysis of Purkinje cell firing properties during postnatal mouse development. Journal of Neurophysiology. 113, 578-591 (2015).
  37. Ishikawa, T., Shimuta, M., Häusser, M. Multimodal sensory integration in single cerebellar granule cell in vivo. eLife. 4, e12916 (2015).
  38. Tempia, F., Minlaci, M. C., Anchisi, D., Strata, P. Postsynaptic current mediated by metabotropic glutamate receptors in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neurophysiology. 80, 520-528 (1998).
  39. Wang, S. S., Denk, W., Häusser, M. Coincidence detection in single dendritic spines mediated by calcium release. Nature Neuroscience. 3, 1266-1273 (2000).
  40. Kuroda, S., Schweighofer, N., Kawato, M. Exploration of signal transduction pathways in cerebellar long-term depression by kinetic simulation. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5693-5702 (2001).
  41. Wang, W., et al. Distinct cerebellar engrams in short-term and long-term motor learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), E188-E193 (2014).
  42. Inoshita, T., Hirano, T. Occurrence of long-term depression in the cerebellar flocculus during adaptation of optokinetic response. eLife. 27, 36209 (2018).
  43. Belmeguenai, A., et al. Intrinsic plasticity complements long-term potentiation in parallel fiber input gain control in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neuroscience. 30 (41), 13630-13643 (2010).
  44. Ohtsuki, G., Piochon, C., Adelman, J. P., Hansel, C. SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 75, 108-120 (2012).

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Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices. J. Vis. Exp. (152), e59859, doi:10.3791/59859 (2019).

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