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Biochemistry

एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी द्वारा इनोसिटोल फॉस्फेट या फॉस्फोइनोसिटाइड इंटरैक्टिंग प्रोटीन की पहचान पश्चिमी ब्लॉट या मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए जोड़ा गया

Published: July 26, 2019 doi: 10.3791/59865
Automatic Translation
1
1Institute of Parasitology, McGill University

Summary

यह प्रोटोकॉल प्रोटीन की पहचान पर केंद्रित है जो इनोसिटोल फॉस्फेट या फॉस्फोइनोसिटिड को बांधता है। यह biotinylated inositol फॉस्फेट या फॉस्फोइनोसिटाइड्स कि streptavidin के माध्यम से agarose या चुंबकीय मोती के लिए स्थिर कर रहे हैं के साथ आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करता है. इनोसिटोल फॉस्फेट या फॉस्फोइनोसिटाइड बाइंडिंग प्रोटीन पश्चिमी सोख्ता या मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचाने जाते हैं।

Abstract

इनोसिटोल फॉस्फेट और फॉस्फोइनोसिटाइड्स यूकैरियोट में कई सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित करते हैं, जिनमें जीन अभिव्यक्ति, आशय की तस्करी, सिग्नल ट्रांसडक्शन, चयापचय और विकास शामिल हैं। ये चयापचय प्रोटीन के लिए बाध्यकारी द्वारा इस नियामक गतिविधि प्रदर्शन, जिससे प्रोटीन रचना बदलने, उत्प्रेरक गतिविधि, और / यहाँ वर्णित विधि आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करता है जो बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री या पश्चिमी सोख्ता प्रोटीन की पहचान करने के लिए युग्मित है जो इनोसिटोल फॉस्फेट या फॉस्फोइनोसिटाइड्स के साथ बातचीत करते हैं। Inositol फॉस्फेट या फॉस्फोइनोसिटाइड्स रासायनिक बायोटिन के साथ टैग किए गए हैं, जो तब स्ट्रेप्टाविडिन के माध्यम से कब्जा कर लिया जाता है agarose या चुंबकीय मोती के लिए संयुग्मी. प्रोटीन मेटाबोलाइट के लिए बाध्यकारी की उनकी आत्मीयता से अलग कर रहे हैं, तो eluted और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री या पश्चिमी सोख्ता द्वारा की पहचान की. विधि संवेदनशील है कि एक सरल कार्यप्रवाह है, गैर रेडियोएक्टिव, liposome मुक्त, और अनुकूलन, प्रोटीन के विश्लेषण का समर्थन और परिशुद्धता के साथ चयापचय बातचीत. इस दृष्टिकोण लेबल मुक्त में या एमिनो एसिड लेबल मात्रात्मक जन स्पेक्ट्रोमेट्री तरीकों में इस्तेमाल किया जा सकता है जटिल जैविक नमूनों में प्रोटीन मेटाबोलाइट बातचीत की पहचान या शुद्ध प्रोटीन का उपयोग कर. इस प्रोटोकॉल Trypanosoma bruceiसे प्रोटीन के विश्लेषण के लिए अनुकूलित है, लेकिन यह संबंधित प्रोटोजोअन परजीवी, खमीर या स्तनधारी कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Introduction

इनोसिटोल फॉस्फेट (आईपी) और फॉस्फोइनोसिटाइड्स (पीआई) सेलुलर प्रक्रियाओं के विनियमन के माध्यम से यूकैरियोट जीव विज्ञान में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं जैसे जीन अभिव्यक्ति1,2,3, vesicle तस्करी का नियंत्रण 4, सिग्नल ट्रांसडक्शन5,6, चयापचय7,8,9, और विकास8,10. इन चयापचयों के नियामक समारोह प्रोटीन के साथ बातचीत करने की क्षमता से परिणाम और इस प्रकार प्रोटीन समारोह को विनियमित. प्रोटीन द्वारा बाध्यकारी पर, आईपी और पी आई प्रोटीन रचना11, उत्प्रेरक गतिविधि12, या बातचीत13 बदल सकते हैं और इसलिए सेलुलर समारोह को प्रभावित. आईपी और पी आई कई उपकोशिक डिब्बों में वितरित किए जाते हैं, जैसे नाभिक2,3,14,15, एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलम16,17प्लाज्मा झिल्ली1 और cytosol18, या तो प्रोटीन के साथ जुड़े3,19 या RNAs20के साथ .

स्फुरदोलिपि ज द्वारा झिल्ली से संबद्ध पीआई(4,5)P2 का क्लीवेज इन्स (1,4,5)P3 की रिहाई में होता है, जो क्रमशः IP काइनेस और फॉस्फेटद्वारा फॉस्फोरोइलेट या डेफॉस्फोरिलेट किया जा सकता है। आईपी घुलनशील अणु हैं जो प्रोटीन के लिए बाध्य कर सकते हैं और नियामक कार्यों को लागू कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, मेटाज़ोआन में Ins(1,4,5)P3 IP3 रिसेप्टर्स के लिए बाध्यकारी द्वारा एक दूसरे दूत के रूप में कार्य कर सकते हैं, जो रिसेप्टर conformational परिवर्तन लाती है और इस प्रकार Ca2 + intracellular भंडार से जारी11. Ins(1,3,4,5)P4 histone deacetylase परिसर के लिए बांधता है और प्रोटीन जटिल विधानसभा और गतिविधि13को नियंत्रित करता है. आईपी नियामक समारोह के अन्य उदाहरणों में क्रोमैटिन संगठन21, आरएनए परिवहन22,23, आरएनए संपादन24, और प्रतिलेखन1, 2,3का नियंत्रण शामिल है . इसके विपरीत, PIs अक्सर प्लाज्मा झिल्ली या organelle झिल्ली25के लिए प्रोटीन की भर्ती के साथ जुड़े रहे हैं. तथापि, पी आई एस की उभरती हुई संपत्ति एक गैर झिल्लीदार वातावरण3,15,19,26में प्रोटीन के साथ संबद्ध करने की क्षमता है. यह परमाणु रिसेप्टर steroidogenic कारक का मामला है, जो प्रतिलेखन नियंत्रण समारोह PI द्वारा विनियमित है(3,4,5)P319, और पाली-A polymerase जो एंजाइमी गतिविधि परमाणु PI(4,5)P226द्वारा विनियमित है. आई पी एस और पी आई के लिए एक विनियामक भूमिका खमीर22,27,स्तनधारी कोशिकाओं19,23, ड्रोसोफिला10 और कृमि28सहित कई जीवों में दिखाई गई है . महत्व का trypanosomes में इन चयापचयों की भूमिका है, जो यूकैरियोटिक वंश से जल्दी diverged. ये चयापचयों Trypanosoma brucei प्रतिलेखन नियंत्रण1,3,विकास8, organelle जीवजनन और प्रोटीन यातायात29,30 में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं , 31 , 32, और रोगजनकों में विकास और संक्रमण को नियंत्रित करने में भी शामिल हैं टी क्रुजी33,34,35,टॉक्सोप्लाज्मा36 और प्लाज्मोडियम 5 , 37.अतः ट्राइपानोसोम में आईपी और पी आई की भूमिका को समझने से इन अणुओं के लिए नए जैविक कार्य को स्पष्ट करने और नवीन औषध लक्ष्यों की पहचान करने में मदद मिल सकती है।

प्रोटीन और आईपी या पीआई बाइंडिंग की विशिष्टता प्रोटीन इंटरैक्टिंग डोमेन और इनोसिटॉल13,38की फॉस्फोरिलेशन स्थिति पर निर्भर करती है,हालांकि पी आई के लिपिड भाग के साथ बातचीत भी19होती है . आईपी और पी आई की विविधता और उनके संशोधित kinases और फॉस्फेटप्रोटीन प्रोटीन समारोह है जो चयापचय उपलब्धता और बहुतायत से प्रभावित है को नियंत्रित करने के लिए एक लचीला सेलुलर तंत्र प्रदान करता है, inositol के फॉस्फोरिलेशन राज्य, और प्रोटीन बातचीत की समानता1,3,13,38. हालांकि कुछ प्रोटीन डोमेन अच्छी तरह से विशेषता रहे हैं39,40,41, उदा, pleckstrin homology डोमेन42 और SPX (एसYG1/ ,44,45, कुछ प्रोटीन आईपी या पी आईपी के साथ बातचीत तंत्र है कि अज्ञात रहते हैं. उदाहरण के लिए, टी ब्रूसी के दमनकारी-सक्रियक प्रोटीन 1 (RAP1) में विहित पीआई-बाइंडिंग डोमेन का अभाव है, लेकिन पीआई (3,4,5)P3 के साथ सूचना का आदान-प्रसार और एंटीजेनिक भिन्नता3में शामिल जीनों के नियंत्रण प्रतिलेखन । एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री आईपी या पीआई के आदान-प्राप्त प्रोटीन trypanosome, खमीर, या स्तनधारी कोशिकाओं से बातचीत प्रोटीन ज्ञात आईपी के बिना कई प्रोटीन की पहचान की- या पीआई बाध्यकारी डोमेन8,46, 47. डेटा अतिरिक्त असामान्य प्रोटीन डोमेन का सुझाव देते हैं जो इन चयापचयों से बांधते हैं। इसलिए, आईपी या पीआई के साथ बातचीत करने वाले प्रोटीन की पहचान इन छोटे अणुओं के लिए प्रोटीन-मेटाबोलाइट इंटरैक्शन और नए सेलुलर नियामक कार्यों के उपन्यास तंत्र को प्रकट कर सकती है।

यहाँ वर्णित विधि आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी पश्चिमी ब्लॉटिंग या मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए मिलकर प्रोटीन है कि आईपी या पीआई के लिए बाध्य की पहचान करने के लिए कार्यरत हैं. यह biotinylated आईपी या पी आई का उपयोग करता है कि या तो पार से जुड़े हैं streptavidin संयुग्मी करने के लिए agarose मोती या वैकल्पिक रूप से, streptavidin-संयोजित चुंबकीय मोती के माध्यम से कब्जा कर लिया (चित्र 1). विधि एक सरल कार्यप्रवाह है कि संवेदनशील, गैर रेडियोसक्रिय, liposome मुक्त है और सेल lysates या शुद्ध प्रोटीन3 से प्रोटीन की बाध्यकारी का पता लगाने के लिए उपयुक्त है प्रदान करता है (चित्र2). विधि लेबल मुक्त8मेंइस्तेमाल किया जा सकता ,46 या एमिनो एसिड के लिए युग्मित मात्रात्मक जन स्पेक्ट्रोमेट्री47 जटिल जैविक नमूनों से आईपी या पीआई बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करने के लिए. इसलिए, यह विधि सेलुलर प्रोटीन के साथ आईपी या पी आई की बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध कुछ तरीकों के लिए एक विकल्प है और trypanosomes और शायद अन्य यूकैरियोट में इन चयापचयों के नियामक समारोह को समझने में मदद मिलेगी।

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Protocol

1. आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी और पश्चिमी सोख्ता द्वारा आईपी- या पीआई बाध्यकारी प्रोटीन का विश्लेषण

  1. सेल विकास, lysis और आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी
    1. मध्य लॉग चरण के लिए टी brucei कोशिकाओं हो जाओ और सेल व्यवहार्यता और घनत्व की निगरानी. कुल 5.0 x 107 कोशिकाओं को एक बाध्यकारी परख के लिए पर्याप्त है.
      1. खून के रूपों के लिए, HMI-9 मीडिया में कोशिकाओं को बढ़ने के साथ पूरक 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) पर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2. सेल घनत्व 8.0 x 105 से 1.6 x 106 सेल/
        नोट: घनत्व 1.8 x 106 कोशिकाओं/एमएल से अधिक सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है। टी ब्रूसी 427 इन विट्रो में उगने वाले तनाव का दोहरीकरण समय 5.5 और 6.5 एच के बीच है।
      2. प्रोसाइक्लिक रूपों के लिए, एसडीएम-79 मध्यम में कोशिकाओं को 27 डिग्री सेल्सियस पर 10% एफबीएस के साथ पूरक विकसित करें और सेल घनत्व को 1.0 x 107 और 3.0 x 107 कोशिकाओं/
      3. शुद्ध प्रोटीन (उदाहरण के लिए, रिकॉमबिनेंट प्रोटीन) के लिए, 0.5 से 1 डिग्री प्रोटीन ले और बाध्यकारी बफर के 450 डिग्री एल में पतला (25 एमएम HEPES, 150 एमएम NaCl, 0.2% 4-nonyl फेनिल-एथिलीन पॉली ग्लाइकोल, पीएच 7.4). पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए पतला प्रोटीन (इनपुट) का 5% रखें। चरण 1.1.7 पर आगे बढ़ें.
    2. कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए 1,600 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं। महादलित को त्याग दें।
      नोट: बड़ी संस्कृति वॉल्यूम के centrifugation पर अतिरिक्त जानकारी के लिए चरण 2.1.2 देखें।
    3. 6 एमएम ग्लूकोज (पीबीएस-जी) के साथ पूरक फॉस्फेट बफर नमकीन पीएच 7.4 के 10 एमएल में गोली को धीरे से पुन: स्फूर्त करें और कोशिकाओं को धोने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-गर्म किया गया है। फिर, आरटी पर 5 मिनट के लिए 1,600 x g पर कोशिकाओं को अपकेंद्रण. प्रक्रिया को दो बार दोहराएं।
    4. पीबीएस-जी के 1 एमएल में गोली को फिर से स्थगित करें। फिर, मात्रा को 1.5 एमएल ट्यूब और अपकेंद्रित्र को 1,600 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए स्थानांतरित करें। सुपरनेंट को त्याग दें।
      नोट: सेल छर्रों तरल नाइट्रोजन में जमे हुए फ्लैश किया जा सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस या तरल नाइट्रोजन पर संग्रहीत किया जाता है।
    5. 0.5 एमएल lysis बफर (25 एमएम HEPES, 150 mM NaCl, 1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol, पीएच 7.4) 1.5x प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल और 1x फॉस्फेट अवरोध करनेवाला कॉकटेल (सामग्रीकीतालिका) के साथ पूरक में गोली resuspend कोशिकाओं lyse. 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 आरपीएम पर घूर्णन 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट lysate।
      नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि प्रोटीन नीचा कर सकते हैं अगर नहीं के रूप में संकेत संभाला. यदि आवश्यक हो तो सोडियम डोडिसिल सल्फेट-पॉलीऐक्रिलमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (एसडीएस/पेज) द्वारा प्रोटीन lysate की अखंडता की जाँच करें।
      चेतावनी: टी-ऑक्टाइलफेनॉक्सीपॉलीएथॉक्सीथेनोल विषाक्त है और त्वचा और आंखों में जलन पैदा कर सकता है। दस्ताने, eyeshield और faceshield संरक्षण का प्रयोग करें.
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर lysate सेंट्रीफ्यूज। अधिनांत को बाइंडिंग परख के लिए एक नया 1.5 एमएल ट्यूब में ले लीजिए। पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण के लिए कुल lysate (इनपुट) का 5% रखें। अधिनांत में lysis बफर के साथ निकाले गए परजीवी प्रोटीन होते हैं।
    7. आईपी या पीआईपी के 50 डिग्री सेल्सियस को इकट्ठा करने के लिए agarose मोती (यानी, 50 $ एल घोल के) या agarose मोती के 50 $L, और 1000 x ग्रामपर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रण . अधिनात को त्यागें तथा 50 डिग्री सेल्सियस में बंधन बफर के साथ-साथ मोतियों को बराबर ी हटा दें। एक नियंत्रण के रूप में गैर-संयोजित मोती का उपयोग करें। विशिष्ट इंटरैक्शन को नियंत्रित करने के लिए गैर-फॉस्फोरिलेट प्रपत्र ों सहित विभिन्न फॉस्फेट कॉन्फ़िगरेशन के साथ IP/PI-beads का उपयोग करें।
    8. सेल lysate या शुद्ध प्रोटीन के लिए आईपी- या पीआई मोती के 50 डिग्री एल जोड़ें (प्रत्येक 1 एमएल मोती के संयुग्मी आईपी या पीआई के 10 nmol शामिल हैं)। कुल lysate के 10% के भीतर आईपी- या PI-beads की मात्रा रखें और यदि आवश्यक हो, बाइंडिंग बफर के साथ बाध्यकारी प्रतिक्रिया मात्रा को समायोजित.
      1. प्रतियोगिता assays के लिए, बाध्यकारी प्रतिक्रिया गैर-संयोजित आईपी या पी आई के विभिन्न सांद्रता में जोड़ें (जैसे, 1-, 10,10-, 100 गुना मोलर अतिरिक्त आईपी या पीआई मोती की तुलना में).
    9. 1 ज, या रात भर, 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें और 50 आरपीएम पर घूर्णन करें।
      नोट: शुद्ध प्रोटीन के साथ बंधन प्रतिक्रियाओं आरटी प्रोटीन की स्थिरता के आधार पर किया जा सकता है. यदि आईपी या पीआईपी का उपयोग कर biotin के लिए संयुग्मी केवल चरण 1.1.9.1 पर आगे बढ़ें, अन्यथा 1.1.10 कदम पर आगे बढ़ें.
      1. 50 आरपीएम पर घूर्णन 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए बाध्यकारी प्रतिक्रिया और इनक्यूबेट के लिए चुंबकीय मोती के लिए स्ट्रप्टाविडिन-संयोजित 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
    10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 000 x g पर 1 मिनट के लिए मिश्रण सेंट्रीफ्यूज। supernatant निकालें (प्रवाह के माध्यम से) और गोली रखने के लिए. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए supernatant के 5% रखें.
      नोट: यदि चुंबकीय मोती का उपयोग कर, supernatants को हटाने और एक चुंबकीय स्टैंड का उपयोग कर बाद washes प्रदर्शन (centrifugations आवश्यक नहीं हैं).
    11. कपड़े धोने बफर के 1 एमएल जोड़ें (25 एमएम HEPES, 300 m M NaCl, 0.2% 4-nonyl फ़ेनिल-पॉलीथीन ग्लाइकोल, पीएच 7.4) और नल या घूमता द्वारा राल को फिर से निलंबित (एक पाइपेट का उपयोग नहीं करते क्योंकि मोती पिपेट युक्तियाँ करने के लिए संलग्न कर सकते हैं). 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 000 x g पर 1 मिनट के लिए प्रतिक्रिया को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनेंट को त्याग दें। कुल पांच washes के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ.
      चेतावनी: 4-nonyl फेनिल-पॉलीथीन ग्लाइकोल विषाक्त है और त्वचा और आंखों में जलन पैदा कर सकता है. दस्ताने, eyeshield और faceshield संरक्षण का प्रयोग करें.
    12. 2x Laemli बफर के 50 डिग्री एल मोती के लिए 710 मिमी 2-mercaptoethanol के साथ पूरक जोड़ें और दोहन या प्रोटीन elute करने के लिए भंवर द्वारा मिश्रण। 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी, फिर 1 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम के लिए अपकेंद्रित्र और supernatant इकट्ठा (एलिट प्रोटीन शामिल). वैकल्पिक रूप से, एसडीएस का उपयोग करने से बचने के लिए 8 एम यूरिया/100 एमएम ग्लिसिन पीएच 2.9 के साथ एल्यूट प्रोटीन। -80 डिग्री सेल्सियस पर eluate फ्रीज, अन्यथा पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें।
      चेतावनी: 2-mercaptoethanol विषाक्त है और त्वचा, आंख और सांस की irritations पैदा कर सकता है. दस्ताने का प्रयोग करें और रासायनिक हुड में काम करते हैं।
  2. पश्चिमी सोख्ता विश् लेषण
    1. इनपुट के 15 डिग्री सेल्सियस मिलाएं (चरण 1.1.6 से) या प्रवाह के माध्यम से (चरण 1.1.10 से) 4x Laemli बफर के 5 डिग्री एल के साथ नमूने. गर्मी इनपुट और प्रवाह के माध्यम से नमूने 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए। 8 एम यूरिया/100 एम ग्लाइसिन पीएच 2.9 में दिए गए नमूनों के लिए, 15 डिग्री सेल्सियस एल्यूएट को 4x लैमली बफर के 5 डिग्री एल के साथ मिलाएं, और 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए गर्मी।
      नोट: यह चरण 2x Laemli बफर में eluted नमूने के लिए आवश्यक नहीं है।
    2. इनपुट के 2.5 डिग्री एल के साथ 4-20% एसडीएस/पेज जेल के लोड कुओं, 2.5 $L प्रवाह के माध्यम से, और एलuted नमूनों के 20 $L, और निर्माता की सिफारिश के अनुसार लोड प्रोटीन सीढ़ी।
      नोट: ब्याज की प्रोटीन के आणविक वजन के अनुसार जेल% चुनें.
    3. चलाने SDS/PAGE पर 150 V के लिए 30-45 मिनट बफर चल रहा है, या Laemli बफर के नीले रंग जेल के अंत में है जब तक.
      नोट: चलाने के समय प्रयोगशाला उपकरणों के अनुसार भिन्न हो सकते हैं.
    4. कांच (या प्लास्टिक) प्लेटों से जेल निकालें, और 15 मिनट के लिए स्थानांतरण बफर में लेना।
    5. प्रोटीन को पॉलीविनाइलिडेन डाइफ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली या नाइट्रोसेलुलोस झिल्ली में स्थानांतरित करें। स्थानांतरण बफर में झिल्ली और 3 मिमी फिल्टर कागज सोख। फिल्टर पेपर, नाइट्रोसेलुलोस या PVDF झिल्ली, जेल, और फिल्टर पेपर के एक अतिरिक्त तीन चादरें के तीन चादरें के साथ एक सैंडविच इकट्ठा। सुनिश्चित करें कि कोई हवा बुलबुले सैंडविच में फंस रहे हैं. यदि आवश्यक हो तो बुलबुले को हटाने के लिए एक रोलर का उपयोग करें। कैथोड पर झिल्ली और कैसेट के एनोड पक्ष पर जेल सेट करें.
      नोट: झिल्ली सक्रियण या दाग तैयारी पर जानकारी के लिए झिल्ली निर्माता के निर्देशों की जाँच करें।
    6. हस्तांतरण बफर के साथ हस्तांतरण टैंक में सैंडविच युक्त कैसेट प्लेस. एक बर्फ बाल्टी में या 4 डिग्री सेल्सियस (उदा., ठंडे कमरे में) पर टैंक रखें। 1 h के लिए 100 V पर स्थानांतरण प्रोटीन (वर्तमान 200-400 लेकिन के बीच भिन्न होता है). वैकल्पिक रूप से, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 लेकिन की एक निरंतर धारा पर रात भर स्थानांतरण।
    7. कैसेट से झिल्ली निकालें. झिल्ली को ब्लॉक करने के लिए आरटी में 1 एच के लिए, पॉलीसोर्बेट 20 (पीबीएस-टी) के 0.05% के साथ पीबीएस में पतला 6% गैर वसा वाले सूखे दूध में झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
      नोट: झिल्ली को अवरुद्ध करने से पहले, स्थानांतरण की गुणवत्ता को Ponceau S दाग का उपयोग करके जाँचा जा सकता है। Ponceau एस के 15 एमएल में 1 मिनट के लिए झिल्ली को इनक्यूबेट करें, पानी में कुल्ला और बैंड कल्पना।
    8. अवरुद्ध समाधान निकालें और पीबीएस-टी में पतला 6% गैर वसा शुष्क दूध में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी में 50 आरपीएम रोटेशन के साथ आरटी में 1 एच के लिए झिल्ली को इनक्यूबेट करें। वैकल्पिक रूप से, 50 आरपीएम रोटेशन के साथ रात 4 डिग्री सेल्सियस पर झिल्ली इनक्यूबेट करें।
      नोट: ऊष्मायन का समय एंटीबॉडी की गुणवत्ता के अनुसार भिन्न हो सकता है; हालांकि, अधिकांश एंटीबॉडी आरटी में 1-3 एच की ऊष्मायन के साथ काम करेंगे। एंटीबॉडी एकाग्रता या कमजोर पड़ने के लिए निर्माता की सिफारिश का पालन करें।
    9. आरटी पर 50 आरपीएम रोटेशन के साथ 5 मिनट के लिए पीबीएस-टी में झिल्ली को इनक्यूबेट करके दाग को धोएं। प्रक्रिया को 3-5 बार दोहराएं। एंटीबॉडी की गुणवत्ता के आधार पर अधिक washes की जरूरत हो सकती है.
    10. बीबीएस-टी में पतला 6% गैर वसा वाले सूखे दूध में आरटी में 1 एच के लिए घोड़े की तरह peroxidase (एचआरपी) में झिल्ली को इनक्यूबेट करें 50 आरपीएम रोटेशन के साथ।
      नोट: एंटीबॉडी एकाग्रता या कमजोर पड़ने के लिए निर्माता की सिफारिश का पालन करें।
    11. चरण 1.2.9 में दर्शाए गए दाग को धो लें।
    12. झिल्ली को कवर करने के लिए केमिल्यूमिनेंट सब्सट्रेट जोड़ें। अंधेरे में आरटी पर 5 मिनट के लिए सब्सट्रेट और इनक्यूबेट की अतिरिक्त निकालें।
      नोट: chemiluminscence अभिकर्मकों पर अनुशंसाएँ के लिए निर्माता के निर्देशों की जाँच करें।
    13. कैमरा-आधारित इमेजर का उपयोग करके केमिल्लुमिनसेंट सिग्नल कैप्चर करें। वैकल्पिक रूप से, एक एक्स-रे फिल्म का उपयोग करने के लिए chemiluminescent संकेत पर कब्जा.

2. आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा आईपी/पीआई-बाध्यकारी प्रोटीन का विश्लेषण

  1. सेल विकास, lysis और आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी
    1. मध्य लॉग चरण के लिए टी brucei कोशिकाओं हो जाओ और सेल व्यवहार्यता और घनत्व की निगरानी.
      नोट: 1.0 x 1010 कोशिकाओं की कुल दो बाध्यकारी assays के लिए पर्याप्त है. यहाँ संकेत से कम कोशिकाओं का उपयोग बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा कम बहुतायत प्रोटीन का पता लगाने को प्रभावित कर सकते हैं.
      1. टी brucei खून रूपों के लिए, मध्य लॉग चरण में कोशिकाओं को विकसित (8.0 x 105-1.6 x 106 कोशिकाओं / 427 तनाव के लिए, संस्कृति के 5 एल 0.5-1.0 x 1010 कोशिकाओं उपज होगी. 1.8 x 106 कोशिकाओं/एमएल से अधिक घनत्व से बचने के लिए सेल वृद्धि की निगरानी करें जो सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकती है। सेल कल्चर वॉल्यूम को फ्लास्क वॉल्यूम के 1/10 पर रखें; अन्यथा, कोशिकाओं की विकास दर खराब वातन के कारण प्रभावित होगी।
        नोट: 427 तनाव 5.5-6.5 एच के एक दोहरीकरण समय है.
      2. प्रोसाइक्लिक रूपों के लिए, एसडीएम-79 मध्यम में कोशिकाओं को 27 डिग्री सेल्सियस पर 10% एफबीएस के साथ पूरक विकसित करें और सेल घनत्व को 1.0 x 107 और 3.0 x 107 कोशिकाओं/ संस्कृति के 500 एमएल 0.5-1.5 x 1010 कोशिकाओं उपज होगी.
    2. आरटी पर 15 मिनट के लिए 1,600 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और पीबीएस-जी के 200 एमएल में गोली को 37 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गरम करें। गोल तल सेंट्रीफ्यूगेशन ट्यूब (सामग्री की तालिका) का प्रयोग करें क्योंकि टी ब्रूसी खून के रूप छर्रों को स्थिर कोण सेंट्रीफ्यूज रोटर का उपयोग करते समय आसानी से परेशान कर रहे हैं। आरटी में 5 मिनट के लिए 1,600 x ग्राम पर कोशिकाओं को फिर से सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. सुपरनेंट निकालें और पीबीएस-जी के 10 एमएल में गोली को फिर से शुरू करें। आरटी. प्रक्रिया को दोहराएँ पर 5 मिनट के लिए 1,600 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और अंतिम धोने के बाद, सुपरनेंट को त्याग दें।
      नोट: गोली तरल नाइट्रोजन में जमे हुए फ्लैश हो सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस या तरल नाइट्रोजन पर संग्रहीत किया जाता है।
    4. बर्फ में lysis बफर पूर्व chilled के 5 एमएल में सेल गोली resuspend और 1.5x प्रोटीज अवरोधकरनेवाला कॉकटेल और 1x फॉस्फेट अवरोध करनेवाला कॉकटेल (सामग्री की तालिका)केसाथ पूरक. 50 आरपीएम पर घूर्णन 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए lysate इनक्यूबेट।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर lysate सेंट्रीफ्यूज। सुपरनेटेंट (सोलुबिलाइज्ड प्रोटीन) को एकत्र करें और इसे बाइंडिंग बफर के 20 एमएल में पतला कर दें।
    6. आईपी या पीआईपी के 400 $L को इकट्ठा करें जो कि एग्रोस मोती (यानी, 400 डिग्री सेल्सियस घोल) या नियंत्रण मोती के 400 डिग्री सेल्सियस के लिए, और 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज को 1 000 x ग्राम पर आर टी पर छोड़ दें और 400 $L में बफर के 400 डिग्री एल में फिर से लागू करें। विशिष्ट इंटरैक्शन की तुलना में प्रोटीन-मेटाबोलाइट इंटरैक्शन के विशिष्ट संवर्धन को निर्धारित करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में agarose मोती का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, प्रोटीन जो विशेष रूप से मोती से बांधते हैं)। फॉस्फेट शुल्क या बायोटिन के लिए बाइंडिंग के कारण विशिष्ट बातचीत के लिए नियंत्रित करने के लिए गैर-फॉस्फोरिलेटाइज्ड रूपों सहित विभिन्न फॉस्फेट विन्यास वाले आईपी या पी आई का उपयोग करें।
    7. IP/PI-beads के 400 $L जोड़ें या 10 एमएल lysate में मोती को नियंत्रित करें और 1 h, या रात भर के लिए incubated, 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 आरपीएम पर घूर्णन। यदि आईपी या पीआईपी का उपयोग केवल biotin के साथ संयुग्मी (बिना मोती) चरण 2.1.7.1 करने के लिए आगे बढ़ना, अन्यथा 2.1.8 कदम पर आगे बढ़ें.
      1. चुंबकीय मोती के लिए 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और 50 आरपीएम पर घूर्णन 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 000 x g पर 1 मिनट के लिए बाइंडिंग अभिक्रिया को केंद्रमेंत करें। supernatant निकालें (प्रवाह के माध्यम से) और गोली रखने के लिए. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए supernatant के 5% रखें.
    9. गोली के लिए बफर धोने के 5 एमएल जोड़ें, धीरे ट्यूब घूमता द्वारा मिश्रण, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 000 x g पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। महादलित को त्याग दें। धोने को पांच बार दोहराएं। यदि चुंबकीय मोती का उपयोग कर, supernatants इकट्ठा करने और एक चुंबकीय स्टैंड का उपयोग कर washes प्रदर्शन (केन्द्रीकरण आवश्यक नहीं हैं).
    10. 2x Laemli बफर के 50 डिग्री एल जोड़ें (या 8 एम यूरिया/100 मिमी ग्लिसिन पीएच 2.9, एसडीएस का उपयोग करने से बचने के लिए) मोती के लिए और दोहन या भंवर द्वारा मिश्रण (avoid pipeting क्योंकि मोती पाइपेट युक्तियाँ करने के लिए संलग्न कर सकते हैं), और फिर 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी के लिए 5 मिनट सेंट सेंट के लिए 10,000 ग्राम के लिए 1 मिनट और supernatant इकट्ठा (कथित प्रोटीन). तीन भिन्नों की कुल एकत्रित करने के लिए दो बार प्रक्रिया दोहराएँ।
    11. -80 डिग्री सेल्सियस पर एल्यूएट फ्रीज करें, अन्यथा एसडीएस/पेज में प्रोटीन को अलग करें या ट्रिप्सिनाइजेशन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए समाधान में रखें।
  2. मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए प्रोटीन के ट्रिप्सिन पाचन
    नोट: इस प्रक्रिया के दो रूपों अनुभाग 2.2.1 (जेल में) या अनुभाग 2.2.2 (समाधान में) प्रोटीन के पाचन के लिए दिखाए जाते हैं. प्रोटीन कम बाध्यकारी ट्यूब नमूना नुकसान को रोकने के लिए सिफारिश कर रहे हैं. प्रोटीओमिक्स सुविधा में एक विश्लेषणात्मक रसायनज्ञ के साथ परामर्श नमूने और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर उपलब्ध उपकरणों के लिए प्रोटोकॉल की उपयुक्तता।
    1. प्रोटीन के इन-जेल ट्रिप्सिनाइजेशन
      1. SDS/PAGE में प्रोटीन जुदाई के बाद, संक्षेप में उच्च शुद्धता के पानी में जेल कुल्ला. जेल को साफ कांच की प्लेट पर स्थानांतरित करें। एक साफ ब्लेड के साथ प्रोटीन बैंड उत्पादित और बैंड के बाहर अतिरिक्त जेल काटने से बचें. जेल के टुकड़ों को छोटे टुकड़ों में काटें (यानी, लगभग 1 मिमी वर्ग) और उन्हें 1 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। यदि आवश्यक हो तो एक पिपेट टिप का उपयोग करें, लेकिन सुनिश्चित करें कि पाइपेट टिप उपयोग करने से पहले इथेनॉल में कुल्ला है।
        नोट: जेल संदूषण से बचने के लिए दस्ताने का प्रयोग करें। जेल के टुकड़े -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      2. जेल के टुकड़े कुल्ला करने के लिए ट्यूबों के लिए उच्च शुद्धता या उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी ग्रेड पानी के 100 $L जोड़ें। पानी छोड़ दें।
        1. Coomasie या रूथीनियम आधारित फ्लोरोसेंट दाग जेल टुकड़े के लिए, destaining समाधान में जेल टुकड़े इनक्यूबेट (25 एम एम एनएच4HCO3 में 50% एसीटोनिट्रिल) 1 ज के लिए, तो समाधान को त्यागें। प्रक्रिया दोहराएँ जब तक धुंधला दिखाई नहीं देता है.
          नोट: 100 मीटर एनएच4एचसीओ3, पीएच 7.8 परएक स्टॉक समाधान से कमजोर पड़ने से एनएच4HCO 3 युक्त समाधान तैयार करें।
          चेतावनी: एसीटोनिट्रिल एक अस्थिर विलायक, ज्वलनशील और विषाक्त है। एनएच4एचसीओ3 त्वचा या आंखों में जलन पैदा कर सकता है। दस्ताने का प्रयोग करें और एक रासायनिक हुड के तहत काम करते हैं।
        2. चांदी के दाग वाले जेल के टुकड़ों के लिए, चांदी के दाग के लिए 50 डिग्री सेल्सियस में जेल के टुकड़े (15 एमएम के3[सीएन)6$, 50 एमएम ना2एस2ओ3) 30 मिनट के लिए पानी में। समाधान को छोड़ दें और 200एल के साथ जेल के टुकड़े धोएं। पानी की. पांच बार या जेल पीले रंग दिखाई नहीं देता है जब तक धोने दोहराएँ.
          चेतावनी: K3[Fe (CN)6] त्वचा या आंख जलन पैदा कर सकता है. दस्ताने का प्रयोग करें.
      3. आरटी में 10 मिनट के लिए एसीटोनिट्रिल के 200 $L का उपयोग करजेल टुकड़ों को निर्जलित करें। उसके बाद, समाधान छोड़ दें।
        नोट: निर्जलित जेल टुकड़े मात्रा में छोटे हैं, अपारदर्शी, और चिपचिपा. यदि जेल के कई टुकड़े एक ट्यूब में संयुक्त कर रहे हैं, जेल टुकड़े के कुशल निर्जलीकरण के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ.
      4. 50 डिग्री सेल्सियस (या जेल के टुकड़ों को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा) को कम करने के समाधान (10 एमएम dithiothreitol [DTT] 100 m एनएच4HCO3में जोड़ें और 56 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट 1 एच. बाद में, ट्यूबों को शांत करें और समाधान को कम करने की अतिरिक्त छूट दें।
      5. 50 डिग्री सेल्सियस (या जेल के टुकड़े को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा) alkylation समाधान (50 एमएम iodoacetamide में 100 m एनएच4HCO3) जोड़ें और अंधेरे में आरटी में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। बाद में, ऐल्किलन समाधान की अधिकता को त्याग दें।
      6. आरटी में 10 मिनट के लिए एसीटोनिट्रिल के 200 $एल के साथ जेल के टुकड़े को निर्जलित करें। एसीटोनिट्रिल निकालें और आरटी में 10 मिनट के लिए 10 मिनट के लिए जेल के टुकड़े को 100 एमएम एनएच4एचसीओ3 के साथ हाइड्रेट करें।
      7. आरटी पर 10 मिनट के लिए एसीटोनिट्रिल के 200 $L के साथ जेल के टुकड़े को फिर से हाइड्रेट करें और समाधान की अतिरिक्त राशि को त्याग दें।
      8. 50 एमएम एनएच4एचसीओ3 बफर में पतला मास स्पेक्ट्रोमेट्री ग्रेड ट्रिप्सिन के 15 डिग्री एल जोड़ें, या 4 एच के लिए हाइड्रेटेड जेल टुकड़े और इनक्यूबेट को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा 37 डिग्री सेल्सियस पर। 100 से 500 एनजी (या 20 एनजी ट्रिप्सिन/जेडजी प्रोटीन) के बीच कुल ट्रिप्सिन मात्रा में रखें।
      9. आरटी के लिए नमूना ठंडा, और एक microcentrifuge में 2,000 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. पानी में पतला 5% फोरमिक एसिड का 10-20 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और आरटी में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
        चेतावनी: Formic एसिड ज्वलनशील, संक्षारक और विषाक्त है. दस्ताने का प्रयोग करें और एक रासायनिक हुड के तहत काम करते हैं।
      10. के रूप में कदम 2.2.1.9 में संकेत दिया सेंट्रीफ्यूज, तो supernatant इकट्ठा (एक अलग ट्यूब के लिए निकाले पेप्टाइड्स contain). जोड़ें 20 $L 5% formic एसिड में पतला 50-60% एसीटोनिट्रिल ट्यूब के लिए और आर टी पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट. एक ही ट्यूब में निकाले पेप्टाइड भिन्नों एकत्र.
      11. एक वैक्यूम concentrator में नमूना सूखी और में पुनर्गठन 0.5% एसिटिक एसिड और 2% एसीटोनिट्रिल मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए. सेंट्रीफ्यूज और ट्यूब के तल पर समाधान इकट्ठा; -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर समाधान।
    2. प्रोटीन के समाधान trypsinization में
      1. प्रोटीन की पूर्वनिर्धारित नमूना मात्रा को कम करने के लिए, desalting, और बफर विनिमय. नमूने के लिए ठंडा (-20 डिग्री सेल्सियस) एसीटोन के छह संस्करणों जोड़ें, उदा., एसीटोन के 600 डिग्री एल नमूने के 100 डिग्री एल करने के लिए। भंवर और 15 मिनट से 1 एच के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। समाधान बादल बारी या एक वेग के रूप में होगा.
        चेतावनी: एसीटोन विषाक्त और ज्वलनशील है। दस्ताने का प्रयोग करें और एक रासायनिक हुड के तहत काम करते हैं।
      2. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज के नमूने एसीटोन को निष्क्रिय करें और 15 मिनट के लिए गोली को हवा में सुखाएं।
      3. गोली और भंवर मिश्रण करने के लिए भंग करने के लिए 50 मीटर एनएच4एचसीओ3 में 6-8 एम यूरिया या 1% एसडीएस के 10 डिग्री एल जोड़ें। प्रोटीन की बड़ी मात्रा के लिए (gt; 10 डिग्री), विघटन बफर के 20 डिग्री एल तक का उपयोग करें.
      4. समाधान और भंवर को कम करने के 5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. एक microcentrifuge का उपयोग कर मात्रा नीचे स्पिन. यदि यूरिया में नमूने पतला हो जाते हैं, तो आरटी में 1 एच के लिए इनक्यूबेट करें। यदि एसडीएस में नमूने पतला हो जाते हैं, तो 56 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट किया जाता है।
      5. एक microcentrifuge का उपयोग कर मात्रा नीचे स्पिन. एल्किलेशन समाधान और भंवर के 3 डिग्री एल जोड़ें। फिर, मात्रा नीचे स्पिन और आरटी में 30 मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट।
      6. अभिक्रिया को निष्प्रभावी करने के लिए विलयन को कम करने के 3 डिग्री एल को जोड़ें। 50 मीटर एनएच4एचसीओ3का उपयोग करके नमूना को धीरे - धीरे 1 एम यूरिया या 0.05% एसडीएस को पतला किया जा सकता है ।
        नोट: Trypsin पाचन बफर डिटर्जेंट या विकृत होना चाहिए. विकृतियों के लिए एकाग्रता सीमा हैं: 0.05% एसडीएस; 0.1% ऑक्टिल बी-डी-ग्लूकोपीरानोसाइड; 0.1% 4-नोनिलिफेनिल-पॉलीथीन ग्लाइकोल; 0.1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol; 0.1% पॉलीसमोरबेट 20; 0.1% 3-$(3-cholamidopropyl)dimethylamono]-1-propanesulfonet; 1 एम यूरिया या थाइयूरिया।
      7. 50 एमएम एनएच4एचसीओ3 बफर और इनक्यूबेट में 5 डिग्री सेल्सियस द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री ग्रेड ट्रिप्सिन पतला जोड़ें, या रात में, 37 डिग्री सेल्सियस पर। 100 और 500 एनजी (या 20 एनजी ट्रिप्सिन/जेडजी प्रोटीन) के बीच कुल ट्रिप्सिन मात्रा रखें।
      8. आरटी के लिए नमूना शांत, और एक microcentrifuge का उपयोग कर मात्रा नीचे स्पिन. प्रतिक्रिया को शमन करने के लिए 5% एसिटिक एसिड (या 5% फोरमिक एसिड 50% एसीटोनिट्रिल में जोड़ें)।
      9. 2.2.1.11 चरण में दर्शाई गई वैक्यूम कंथाकार में नमूनों को सुखा लें। -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें। Desalt और ध्यान केंद्रित पेप्टाइड्स ऐसे C18 ज़िप टिप के रूप में एक उलट चरण स्तंभ का उपयोग कर और फिर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण.

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Representative Results

आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी और पश्चिमी सोख्ता द्वारा RAP1 और PI(3,4,5)P3 बातचीत का विश्लेषण
यह उदाहरण T. brucei lysate से या पुनः संयोजक T. brucei RAP1 प्रोटीन द्वारा P1 की बाइंडिंग का विश्लेषण करने के लिए इस विधि का अनुप्रयोग दिखाता है। टी ब्रूसी खून रूपों के Lysates कि hemaglutinin (हा) टैग ्ड की गई RAP1 व्यक्त बंधन assays में इस्तेमाल किया गया. आरएपी1 एक ऐसा प्रोटीन है जो भिन्न सतह ग्लाइकोप्रोटीन (वीएसजी) जीन3,48के प्रतिक्रिप्टिक नियंत्रण में शामिल है,जो एंटीजेनिक भिन्नता49द्वारा परजीवी प्रतिरक्षा चोरी में शामिल सतह प्रोटीन के लिए सांकेतिक रूप में आता है . RAP1 फॉस्फेटीलिनोसिटोल 5-फॉस्फेटेस (PIP5Pase) एंजाइम3के साथ एक टेलोमेरिक प्रोटीन परिसर के भीतर सूचना का आदान-इन करता है, जो वी एस जी जीन प्रतिलेखन1,3के नियंत्रण में भी कार्य करता है। RAP1 एक एन-टर्मिनल स्तन कैंसर 1 carboxyl-टर्मिनल (BRCT) डोमेन है जो एक myeloblastosis (myb) डीएनए बाध्यकारी डोमेन और एक सी-टर्मिनल myb की तरह डोमेन3,48द्वारा पीछा किया जाता है. हालांकि, यह विहित PI बाइंडिंग डोमेन का अभाव है। बंधन परख PIs के साथ प्रदर्शन किया गया है कि गैर phosphorylated हैं या inositol अंगूठी के विभिन्न पदों पर फॉस्फोरिनलेटेड हैं, और गैर संयोजित agarose मोती के साथ. पश्चिमी विश्लेषण से पता चलता है कि RAP1 वरीयता PI(3,4,5)P3-beads (चित्र 3A)के लिए बांधता है, लेकिन यह भी PI(4,5)P2-beads के लिए एक हद तक बाध्य करता है। हालांकि, यह किसी भी अन्य PIs या agarose मोती के लिए बाध्य नहीं किया. क्योंकि RAP1 एक multiprotein जटिल का हिस्सा है3, कुछ PIs के साथ अपनी बातचीत प्रत्यक्ष नहीं हो सकता है और इस प्रकार अन्य सेलुलर प्रोटीन है कि PIs के लिए बाध्य के साथ RAP1-हा बातचीत से परिणाम.

इसलिए, परीक्षण करने के लिए कि क्या RAP1 सीधे PIs को बांधता है, एक सी-टर्मिनलटैग 6x-उसके रिकॉमबिनेंट RAP1 (rRAP1) प्रोटीन व्यक्त किया गया था और ई. कोलाई3से एकरूपता के लिए शुद्ध. प्रोटीन PI(3,4,5)P3-beads के साथ संबंधी assays में पीआई (3,4,5)P3 या PI(4,5)P2 की प्रतिस्पर्धा सांद्रता की उपस्थिति में इस्तेमाल किया गया था. पश्चिमी सोख्ता यह दर्शाता है कि PI(3,4,5)P3 की बढ़ती सांद्रता, लेकिन PI(4,5)P2 PI(3,4,5)P3 (चित्र 3ठ) के साथ rRAP1 की अन्योन्यक्रिया को रोकता है। इसके अलावा, प्रतिक्रिया के लिए टी ब्रूसी शुद्ध PIP5Pase एंजाइम के अलावा बहाल पीआई (3,4,5)P3 rRAP1 द्वारा बाध्यकारी है, जो मुक्त PI(3,4,5)P33 के PIP5Pasde dephosphorylation के कारण है और इस तरह इंगित करता है कि इस के फॉस्फोरिलेशन पैटर्न मेटाबोलाइट rRAP1 बाइंडिंग के लिए आवश्यक है। इसलिए, RRAP1 PI(3,4,5)P3 के साथ सूचना का आदान-प्राप्त करता है क्योंकि यह टी ब्रूसी lysates से RAP1-HA करता है। इसके अलावा, डेटा बताते हैं कि RAP1-HA की बाध्यकारी lysate से PI(4,5)P2 संभावना आरएएपी1 परिसर में अन्य प्रोटीन के साथ बातचीत से परिणाम (जैसे, PIP5Pase)3. डेटा सेल lysates और पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ बाध्यकारी assays की पूरकता वर्णन. यह भी प्रोटीन और PIs के बीच बातचीत की विशिष्टता निर्धारित करने के लिए प्रतिस्पर्धी बाध्यकारी assays की उपयोगिता से पता चलता है.

आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा Ins(1,4,5)P3 बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान
इस उदाहरण में, एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी के बाद मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग टी ब्रूसी प्रोटीन की पहचान करने के लिए किया गया था जो इन्स(1,4,5)P3 से बांधते हैं; इसलिए, प्रयोग सर्वेक्षण संभावित Ins(1,4,5)P3 टी brucei खून रूपों से बाध्यकारी प्रोटीन. टी ब्रूसी lysate Ins(1,4,5)P3 के साथ incubated किया गया था के साथ agarose मोती या गैर संयोजित मोती के साथ (एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया), और बाध्य प्रोटीन Laemli नमूना बफर के साथ eluted थे. SDS/PAGE विश्लेषण से पता चलता है कि नियंत्रण से प्राप्त प्रोटीनकी तुलना में Ins(1,4,5)P3-beads से प्राप्त प्रोटीनमें वृद्धि होती है (चित्र 4क)। 250 से अधिक प्रोटीनों की पहचान किए गए प्रोटीनों के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण, जिनमें से 84 को नियंत्रित मोती की तुलना में Ins(1,4,5)P3 मोती के साथ समृद्ध किया गया था (चित्र4बी, गुना परिवर्तन [एफसी] 2, p और lt; 0.05). इन्स(1,4,5)P3 को नियंत्रित करने की तुलना में प्रोटीन का संवर्धन एसडीएस/पेज द्वारा पता लगाए गए प्रोटीन संकेत से संबंधित है। डेटा में ऐसे प्रोटीन शामिल हैं जिन्हें इन्स(1,4,5)P3 और प्रोटीन को बांधने के लिए मान्य किया गया था जो इन्स(1,4,5)P3 के लिए बाध्यकारी तंत्र अज्ञात8हैं। इसके अलावा, Ins(1,4,5)P3 बाइंडिंग प्रोटीओम इन्स (1,3,4,5)P4 और अन्य PIs8से बहुत भिन्न था, जो यह बताता है कि इनमें से कुछ प्रोटीन इन्स (1,4,5)P3 के विशिष्ट फॉस्फेट कॉन्फ़िगरेशन को पहचानते हैं। अतः बायोटिन-टैग्ड इन्स(1,4,5)P3 का उपयोग एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी के लिए किया जा सकता है जो बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर प्रोटीन की पहचान करता है जो इन्स(1,4,5)P3 को बांधते हैं। अन्य आईपी या पीआई3,8,46,47के लिए बाध्य प्रोटीन की पहचान करने के लिए दृष्टिकोण का पता लगाया जा सकता है .

Figure 1
चित्र 1 : बाध्यकारी assays के लिए एफ़िनिटी अभिकर्मकों. (ए) पीआई (3,4,5) पी3 (ऊपर) और इन्स (1,4,5) पी 3 (नीचे) inositol की sn1 स्थिति पर बायोटिन के लिए संयुग्मी। पीआई(3,4,5)P3 में, बायोटिन को इनोसिटॉल की sn1 स्थिति पर लिपिड श्रृंखला में संयोजित किया जाता है, जबकि इन्स (1,4,5)P3 में बायोटिन को स्थिति sn1 पर फॉस्फेट के लिए संयुग्मी किया जाता है। (B) Ins(1,4,5)P3 biotin के साथ जुड़ा हुआ है और मोती (उदा., agarose या चुंबकीय मोती) के लिए streptavidin संयुग्मी के लिए बाध्यकारी के माध्यम से कब्जा कर लिया है। इन अभिकर्मकों के परिवर्तन कस्टम संश्लेषित लिंकर का उपयोग करते हैं जो बायोटिन को प्रतिस्थापित करते हैं , यह भी संभवहै 46. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : प्रोटोकॉल के कार्यप्रवाह टी brucei के प्रोटीन के साथ आईपी या पीआई आत्मीयता बातचीत के विश्लेषण के लिए कदम का वर्णन करता है और पता लगाने द्वारा (A) पश्चिमी blotting या (बी) मास स्पेक्ट्रोमेट्री. एसी-डब्ल्यूबी, आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी और पश्चिमी सोख्ता; एसी-एमएस, आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : फॉस्फोइनोसिटाइड्स के लिए टी ब्रूसी RAP1 का बंधन। (ए ) टी ब्रूसी (5.0 x 107 परजीवी) जो हा-टैग किए गए RAP1 को पी आई के 50 डिग्री एल के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए इनक्यूबेट किया गया था (प्रत्येक 1 एमएल agarose मोती जिसमें संयुग्मी PIs के 10 nmol) या agarose (Ag) मोती. बाध्यकारी प्रतिक्रिया धोया गया था और 2 x Laemli नमूना बफर के साथ eluted और 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म. प्रोटीन 4-20% एसडीएस /पेज में अलग किया गया, एक PVDF झिल्ली को स्थानांतरित कर दिया, और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विरोधी एचए के साथ जांच (1:5,000, 6% पीबीएस-दूध में पतला) पीछा किया विरोधी माउस IgG-HRP द्वारा (1:5,000, 6% पीबीएस-दूध में पतला), और chemiluminscence द्वारा पता चला. (B) आर आर ए आर पी 1 का एक $g को आरटी में 1 ज के लिए पी आई (3,4,5) पी 3-अगारोस मोती की उपस्थिति या अनुपस्थिति में 5 से 50 डिग्री सेल्सियस की उपस्थिति या अनुपस्थिति में शामिल किया गया था (diC8) PI(3,4,5)P3, 20 से 50 डिग्री सेल्सियस diC8 PI(4,5)P2, या 50 डिग्री सेल्सियस diC8 PI(3,4,5)P3 और 250 एनजी PIP5Pase शुद्ध से टी brucei खून रूपों3| बंधन माउस विरोधी के साथ पश्चिमी blotting द्वारा विश्लेषण किया गया था-His HRP monoclonal एंटीबॉडी (1:2,000, 6% पीबीएस-दूध में पतला) और chemiluminescence द्वारा विकसित. यह आंकड़ा Cestari एट अल3 से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण टी ब्रूसी प्रोटीन है कि इन्स (1,4,5)P3 करने के लिए बाध्य. (क) 10% एसडीएस/पेज विश्लेषण टी ब्रूसी प्रोटीन जो इन्स (1,4,5) पी 3-बीड्स या अग्रोस मोती से बांधते हैं। 5.0 x 109 परजीवी के Lysates Ins(1,4,5)P3 के 400 $L के साथ 2 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किए गए थे(1,4,5)P3 को agarose मोती के साथ या इन्स (1,4,5)P3 के बिना agarose मोती के साथ शामिल किया गया बाध्यकारी प्रतिक्रिया धोया गया था, 2 एक्स Laemli नमूना बफर में eluted और 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए उबला हुआ. प्रोटीन 10% एसडीएस/पेज में अलग किए गए थे और कोमासी धुंधला (सामग्री की तालिका) के साथ दाग दिया गया था। एरोहेड्स प्रोटीन दिखाते हैं जो इन्स(1,4,5)P3-beads में एग्रोस मोती की तुलना में समृद्ध होते हैं; वृत्त दोनों में मौजूद प्रोटीन ों को इंगित करते हैं (1,4,5)P3-beads और agarose मोती, और ब्रैकेट प्रोटीन है कि दोनों में मौजूद हैं इंगित करता है, लेकिन Ins(1,4,5)P3-beads में समृद्ध कर रहे हैं agarose मोती की तुलना में. (बी) डॉट-प्लाट में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचाने गए प्रोटीनों को दिखाया गया है जो इन्स (1,4,5) पी3-बीड्स में समृद्ध होते हैं। संवर्धन एफसी द्वारा परिभाषित 2 और p-value;lt;0.05. चार जैविक प्रतिकृतियां agarose-beads एसी-एमएस के लिए इस्तेमाल किया गया, और आईपी 3 मोती एसी-एमएस के लिए तीन जैविक प्रतिकृतियां. गुना IP3-beads बनाम agarose-beads में पहचान प्रोटीन के परिवर्तन MSstat50का उपयोग कर पेप्टाइड स्पेक्ट्रा तीव्रता का उपयोग कर गणना की गई थी। विस्तृत परिणाम और पेप्टाइड्स की सूची उपलब्ध हैं8. मास स्पेक्ट्रोमेट्री कच्चे डेटा भी PRIDE साथी भंडार के माध्यम से ProteomeXchange कंसोर्टियम के माध्यम से पहचानकर्ता PX005907 के साथ उपलब्ध है. यह आंकड़ा Cestari एट अल से संशोधित किया गयाहै 8. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रोटीन की पहचान है कि आईपी या पी आई के लिए बाध्य इन चयापचयों के सेलुलर समारोह को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी पश्चिमी दाग या मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर आईपी या पीआई बातचीत प्रोटीन की पहचान करने का अवसर प्रदान करता है और इसलिए उनके नियामक समारोह पर अंतर्दृष्टि प्राप्त करता है। आईपी या पीआईपी रासायनिक टैग [उदा., Ins(1,4,5)P3 रासायनिक biotin से जुड़ा हुआ है और streptavidin के माध्यम से agarose मोती के लिए crosslinked या streptavidin चुंबकीय मोती द्वारा कब्जा कर लिया है जो तब बड़े पैमाने पर द्वारा पहचाना जा सकता है बातचीत प्रोटीन के अलगाव की अनुमति देता है स्पेक्ट्रोमेट्री या पश्चिमी धब्बा. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल टी ब्रूसी3,8 और स्तनधारी कोशिकाओं47 से प्रोटीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि इन चयापचयों के लिए बाध्य. दृष्टिकोण है कि अनुकूलित टैग का उपयोग करता है की भिन्नता (बायोटिन के अलावा) भी खमीर46में इस्तेमाल किया गया है. इस दृष्टिकोण के लिए एक महत्वपूर्ण विचार गैर-विशिष्ट बातचीत से विशिष्ट भेदभाव करने के लिए नियंत्रण का उपयोग है. गैर-संयोजित मोती एक आवश्यक नियंत्रण हैं, लेकिन अतिरिक्त नियंत्रण में गैर-फॉस्फोरिलेट पी आई या इनोसिटोल संयुग्मी को मोती3शामिल हो सकते हैं। आईपी या विभिन्न फॉस्फेट संयोजन के साथ पी आईपी3,8 भी इस्तेमाल किया जा सकता है क्योंकि इन चयापचयों के लिए प्रोटीन बाध्यकारी डोमेन है कि inositol38के फॉस्फेट विन्यास भेदभाव शामिल हो सकता है, 39,40,41. इसके अतिरिक्त, नमूना जटिलता दृष्टिकोण की संवेदनशीलता को प्रभावित कर सकते हैं, और इसलिए नमूना भिन्नीकरण द्वारा नमूना जटिलता को कम करने सेल में कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन का पता लगाने में मदद मिल सकती है. कोशिका प्रभाजन और माइटोकोन्ड्रिऑन51के पृथक्करण के लिए सुस्थापित प्रोटोकॉल हैं, नाभिक52,ग्लाइकोसोम53, और फ्लेमेलम54,55 trypanosomes से. ध्यान दें कि उपकोशिकीय भिन्नाओं में उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स और अभिकर्मकों को इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स और अभिकर्मकों के साथ संगतता के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है. विशेष रूप से, प्रोटीन की पहचान है कि आईपी या पी आई के लिए बाध्य आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा के रूप में यहाँ संकेत दिया प्रोटीन और बातचीत के चयापचय संबंध पर निर्भर करता है, और इस प्रकार प्रोटीन जो आईपी या PIs के लिए एक कमजोर संबंध है आसानी से पता नहीं लगाया जा सकता है.

सेल lysate से प्रोटीन के साथ आईपी या पीआई बातचीत के विश्लेषण भी प्रोटीन है कि इन चयापचयों के लिए सीधे बाध्य नहीं की पहचान में परिणाम हो सकता है, लेकिन जो अन्य प्रोटीन है कि आईपी के लिए बाध्य के साथ जटिल में प्रोटीन एसोसिएशन से बातचीत परिणाम या पी.आई.आई. यह सुविधा चित्र 3 Aमें उदाहरण है, जिसमें RAP1-HA से टी ब्रूसी lysate PI(3,4,5)P3-beads और PI(4,5)P2-beads के लिए बाध्य करने के लिए प्रकट होता है। हालांकि, उसकी टैग rRAP1 के साथ बाध्यकारी assays पता चलता है कि इस प्रोटीन PI(3,4,5)P3 और नहीं PI(4,5)P23के लिए बांधता है. यह चित्र 3खमें दिखाया गया है, जिसमें प्रतिस्पर्धी परख दिखाते हैं कि मुक्त PI(3,4,5)P3 लेकिन मुक्त PI(4,5)P2 RRAP1-पीआई (3,4,5)P3-beads के साथ उसकी बातचीत के लिए प्रतिस्पर्धा करता है। RAP1 PI(4,5)P2-beads के साथ लग बातचीत प्रोटीन के साथ एक जटिल के भीतर RAP1 संघ के कारण है कि PI(4,5)P2 बाँध (उदा., PIP5Pase)3. अतः कोशिका lysates से बाध्यकारी assays प्रोटीन है कि आईपी या PIs के लिए प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से बाँध की पहचान कर सकते हैं. विशेष रूप से, अप्रत्यक्ष बातचीत विशिष्ट बातचीत से अलग कर रहे हैं के बाद से पूर्व एक जैविक समारोह हो सकता है (प्रोटीन परिसर के संदर्भ में) कि प्रभावित करता है या चयापचय बंधन से प्रभावित है. उदाहरण के लिए, Ins(1,4,5,6)P4 बहु-उपइकाई सह-दबाव deacetylase परिसर के लिए बाइंड कर देता है और जटिल विधानसभा और गतिविधि13को नियंत्रित करता है। इसलिए, प्रोटीन के साथ आईपी/पीआई इंटरैक्शन को मान्य करना आवश्यक है। अन्योन्यक्रिया के सत्यापन में आईपी या पी आई की अधिकता के साथ प्रतियोगिता परख शामिल हो सकती है (जैसा कि चित्र 3ख)3,8, संभावित प्रोटीन डोमेन56के उत्परिवर्तन , या शुद्ध प्रोटीन के उपयोग के लिए प्रत्यक्ष अन्योन्यक्रिया निर्धारित करना (चित्र 3A,B)3.

प्रोटीन और आईपी या पीआई बातचीत का अध्ययन करने के लिए अन्य तरीकों में रेडियो लेबल वाले आईपी या पीआई के लिए प्रोटीन की बाइंडिंग, प्रोटीन कैप्चर के लिए मैट्रिक्स के रूप में हाइड्रोफोबिक झिल्ली के लिए बाध्य आईपी या पीआईपी का उपयोग, या लिपोसोम में शामिल पीपोसोम में शामिल पीओपी के लिए प्रोटीन की बाइंडिंग शामिल है। 42 , 57 , 58. महत्वपूर्ण बात यह है कि यदि PIs के साथ प्रोटीन बातचीत झिल्ली संरचनाओं की आवश्यकताहै 38,liposome आधारित परख एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इन दृष्टिकोणों की सीमाओं में कम थ्रूपुट, कम संवेदनशीलता, आईपी या पी आई एस एसोसिएशन के अज्ञात रासायनिक अभिविन्यास58, या रेडियोधर्मी सामग्री का उपयोग42शामिल हैं . यहाँ वर्णित विधि संवेदनशील है, liposome मुक्त, गैर-रेडियोसक्रिय, और आईपी / पीआई मोती व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, और इस प्रकार वे अनुकूलित रासायनिक संश्लेषण की आवश्यकता नहीं है. इसके अलावा, आईपी या पीआई से जुड़े बायोटिन की स्थिति अच्छी तरह से परिभाषित है, और इसे46,58,जो प्रोटीन और मेटाबोलाइट बातचीत के सटीक विश्लेषण की अनुमति देता है, को भी संशोधित किया जा सकता है। यहाँ वर्णित विधि भी सेल संस्कृति में एमिनो एसिड के स्थिर आइसोटोप लेबलिंग के रूप में मात्रात्मक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री दृष्टिकोण के साथ जोड़ा जा सकता है (SILAC)47, जो विभिन्न सेलुलर के तहत गतिशील बातचीत की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता उपचार या शर्तें। एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी पश्चिमी दाग या मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर टी ब्रूसी, स्तनधारी कोशिकाओं, और खमीर 3,8,46, से कई आईपी या पीआई बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करने में मदद मिली है 47, प्रोटीन है कि आईपी या पीआई बाध्यकारी डोमेन की विशेषता नहीं है सहित, और यह भी उपन्यास बाध्यकारी डोमेन की पहचान में मदद मिली है, उदा., PI(3,4,5)P3 बाध्यकारी डोमेन47.

कुल मिलाकर, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल टी bruceiसे संभावित आईपी या पीआई बातचीत प्रोटीन सर्वेक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और इन चयापचयों के साथ प्रोटीन की आणविक बातचीत का अध्ययन करने के लिए. प्रोटोकॉल आसानी से अन्य unicellular परजीवी से या स्तनधारी कोशिकाओं47 और खमीर46जैसे अन्य जीवों से आईपी या पीआई बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है , और यह आईपी के जैविक समारोह को और अधिक समझने में मदद मिलेगी और यूकैरियोटमें पी.आई.एस.

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Disclosures

लेखक के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एनएसईआरसी, RGPIN-2019-04658) द्वारा समर्थित किया गया था; NSERC डिस्कवरी लॉन्च अनुपूरक प्रारंभिक कैरियर शोधकर्ताओं के लिए (DGECR-2019-00081) और McGill विश्वविद्यालय द्वारा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma-Aldrich 650501 Ketone
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 Solvent 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MI Beckman Coulter Avanti J6-MI Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botles Sigma-Aldrich B1408 Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control Beads Echelon P-B000-1ml Affinity chromatography reagent - control
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT)  Bio-Rad 1610610 Reducing agent
Dynabeads M-270 Streptavidin ThermoFisher Scientific 65305 Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitors
Electrophoresis running buffer Bio-Rad 1610732 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning Life Sciences 430052 To centrifuge 10 mL cultures
Formic acid Sigma-Aldrich 106526 Acid
Glycine Sigma-Aldrich G7126 Amino acid
HMI-9 cell culture medium ThermoFisher Scientific ME110145P1 Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein Stain ThermoFisher Scientific 24615 Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads Echelon Q-B0145-1ml Affinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry Milk Thomas Scientific C837M64 Blocking reagent for Western blotting
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab Rotator Thomas Scientific 1159Z92 For binding assays
LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 13-698-793 Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) Sigma-Aldrich 21-3277 Detergent
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010031 Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescence ThermoFisher Scientific 32106 Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4906845001 Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP Beads Echelon P-B003a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP Beads Echelon P-B034a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8 Echelon P-3908-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP Beads Echelon P-B345a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP Beads Echelon P-B035a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP Beads Echelon P-B004a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8 Echelon P-4508-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP Beads Echelon P-B045a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP Beads Echelon P-B005a-1ml Affinity chromatography reagent 
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 702587 Potassium salt 
PtdIns PIP Beads Echelon P-B001-1ml Affinity chromatography reagent 
PVDF Membrane Bio-Rad 1620177 For Western blotting 
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5910 R Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 862010 Detergent
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 72049 Chemical 
SpeedVac Vacuum Concentrators ThermoFisher Scientific SPD120-115 Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture  ThermoFisher Scientific 159910 To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry Grade Promega V5280 Trypsin for protein digestion
Urea Sigma-Aldrich U5128 Denaturing reagent
Vortex Fisher Scientific 02-215-418 For mixing reactions
Western blotting transfer buffer Bio-Rad 1610734 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paper Sigma-Aldrich WHA3030861 Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M) Bio-Rad 1610710 Reducing agent
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561094 Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Protein loading buffer

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Cestari, I. Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (149), e59865, doi:10.3791/59865 (2019).

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