Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Identifisering av Inositol fosfat eller Fosfoinositid samspill proteiner av affinitet kromatografi koplet til Western Blot eller Mass massespektrometri

Published: July 26, 2019 doi: 10.3791/59865
Automatic Translation
1
1Institute of Parasitology, McGill University

Summary

Denne protokollen fokuserer på identifisering av proteiner som binder til Inositol fosfater eller phosphoinositides. Den bruker affinitet kromatografi med biotinylated Inositol fosfater eller phosphoinositides som er immobilisert via streptavidin til agarose eller magnetiske perler. Inositol fosfat eller fosfoinositid bindende proteiner identifiseres av vestlig blotting eller masse massespektrometri.

Abstract

Inositol fosfater og phosphoinositides regulerer flere cellulære prosesser i Landplantenes, inkludert genuttrykk, vesicle smugling, signal Transduction, metabolisme og utvikling. Disse metabolitter utføre denne regulatoriske aktiviteten ved binding til proteiner, og dermed endre protein konformasjon, katalysator og/eller interaksjoner. Metoden beskrevet her bruker affinitet kromatografi koplet til masse massespektrometri eller vestlige blotting å identifisere proteiner som samhandler med Inositol fosfater eller phosphoinositides. Inositol fosfater eller phosphoinositides er kjemisk merket med biotin, som deretter fanges via streptavidin bøyd til agarose eller magnetiske perler. Proteiner er isolert av deres affinitet av binding til metabolitten, deretter eluert og identifisert av masse massespektrometri eller vestlig blotting. Metoden har en enkel arbeidsflyt som er følsom, ikke-radioaktivt, liposome, og passelig, støtter analyse av protein og metabolitten interaksjon med presisjon. Denne tilnærmingen kan brukes i etikett-fri eller i amino acid-merket kvantitative masse massespektrometri metoder for å identifisere protein-metabolitten interaksjoner i komplekse biologiske prøver eller ved hjelp av renset proteiner. Denne protokollen er optimalisert for analyse av proteiner fra Trypanosoma brucei, men det kan tilpasses til relaterte protozoan parasitter, gjær eller pattedyrceller.

Introduction

Inositol fosfater (IPS) og phosphoinositides (PIs) spiller en sentral rolle i eukaryote biologi gjennom regulering av cellulære prosesser som kontroll av genuttrykk1,2,3, vesicle smugling 4, signal Transduction5,6, metabolisme7,8,9og utvikling8,10. Den regulatoriske funksjon av disse metabolitter resultater fra deres evne til å samhandle med proteiner og dermed regulere protein funksjon. Ved binding av proteiner, kan IPs og PIs endre protein konformasjon11, katalysatorer aktivitet12, eller interaksjoner13 og dermed påvirker mobilnettet funksjon. IPS og PIs distribueres i flere subcellulære rom, for eksempel nucleus2,3,14,15, endoplasmatiske retikulum16,17, plasma membran1 og stoffer18, enten forbundet med proteiner3,19 eller med RNAs20.

Kløften av membranen-assosiert PI (4, 5) P2 ved fosfolipase C resulterer i utgivelsen av ins (1, 4, 5) P3, som kan fosforylert eller dephosphorylated av IP kinaser og phosphatases, henholdsvis. IPs er løselige molekyler som kan bindes til proteiner og utøver regulatoriske funksjoner. For eksempel ins (1, 4, 5) P3 i metazoan kan fungere som en andre Messenger ved binding til IP3 reseptorer, som induserer reseptor conformational endringer og dermed utgivelsen av ca2 + fra intracellulære butikker11. Ins (1, 3, 4, 5) P4 binder seg til Histone deacetylase komplekse og regulerer protein kompleks montering og aktivitet13. Andre eksempler på IPS forskriftsmessig funksjon inkluderer kontroll av kromatin organisasjon21, RNA transport22,23, RNA redigering24, og transkripsjon1,2,3 . I kontrast, PIs er ofte forbundet med rekruttering av proteiner til plasma membranen eller organelle membraner25. Men en voksende egenskap av PIs er evnen til å assosiere med proteiner i et ikke-membranous miljø3,15,19,26. Dette er tilfelle av den kjernefysiske reseptor steroidogenic faktor, som transcriptional kontrollfunksjonen er regulert av PI (3, 4, 5) P319, og Poly-A polymerase som enzymatisk aktivitet er regulert av kjernefysiske PI (4, 5) P226. En regulerende rolle for IPS og PIs har blitt vist i mange organismer, inkludert gjær22,27, pattedyrceller19,23, Drosophila10 og Worms28. Av betydning er rollen til disse metabolitter i trypanosomes, som skilt tidlig fra eukaryote avstamning. Disse metabolitter spiller en viktig rolle i Trypanosoma brucei transcriptional kontroll1,3, utvikling8, organelle kognitiv og protein trafikk29,30 , 31 andre , 32, og er også involvert i å kontrollere utvikling og smitte i patogener T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 og Plasmodium 5 andre priser , 37. herav, forståelse rollen av IPS og PIs inne trypanosomes kanskje hjelpe å belyse ny Biological funksjonen for disse molekyler og å identifisere romersk bedøve mål.

Det spesielle ved protein og IP eller PI bindende avhenger protein samspill domener og fosforylering staten Inositol13,38, selv om interaksjoner med lipid delen av PIs oppstår også19. Variasjonen av IPs og PIs og deres modifisere kinaser og phosphatases gir en fleksibel cellulær mekanisme for å kontrollere protein funksjon som er påvirket av metabolitten tilgjengelighet og overflod, den fosforylering tilstanden til Inositol, og protein affinitet av samspill1,3,13,38. Selv om noen protein domener er godt preget39,40,41, f. eks, pleckstrin homologi domene42 og SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domener43 ,44,45, noen proteiner samhandle med IPS eller PIs av mekanismer som forblir ukjent. For eksempel, hemmende-aktivator protein 1 (RAP1) av T. brucei mangler kanoniske PI-bindende domener, men SAMHANDLER med PI (3, 4, 5) P3 og kontroll transkripsjon av gener involvert i antigen variasjon3. Affinitet kromatografi og masse massespektrometri analyse av IP eller PI samhandler proteiner fra trypanosome, gjær eller pattedyrceller identifisert flere proteiner uten kjente IP-eller PI-bindende domener8,46, 47. dataene tyder på flere uncharacterized protein domener som binder til disse metabolitter. Derfor, identifisering av proteiner som samhandler med IP eller PIs kan avdekke romanen mekanismer av protein-metabolitten interaksjon og nye cellulære regulatoriske funksjoner for disse små molekyler.

Metoden beskrevet her sysselsetter affinitet kromatografi koplet til vestlige blotting eller masse massespektrometri å identifisere proteiner som binder til IPs eller PIs. Den bruker biotinylated IP-adresser eller behandlingsinstruksjoner som enten er krysskoblet til streptavidin som bøyes likt til agarose perler eller alternativt, tatt opp via streptavidin magnetiske perler (figur 1). Metoden gir en enkel arbeidsflyt som er følsom, ikke-radioaktivt, liposome og er egnet for å oppdage bindingen av proteiner fra celle lysater eller renset proteiner3 (figur 2). Metoden kan brukes i etikett-Free8,46 eller koplet til amino acid-merket kvantitative masse massespektrometri47 å identifisere IP eller PI-bindende proteiner fra komplekse biologiske prøver. Derfor er denne metoden et alternativ til de få metodene som er tilgjengelige for å studere samspillet av IPs eller PIs med cellulære proteiner og vil bidra til å forstå regulatoriske funksjon av disse metabolitter i trypanosomes og kanskje andre Landplantenes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. analyse av IP-eller PI-bindende proteiner av affinitet kromatografi og vestlig blotting

  1. Cellevekst, lyse og affinitet kromatografi
    1. Grow T. brucei celler til midten av loggen fase og overvåke celle levedyktighet og tetthet. Totalt 5,0 x 107 celler er tilstrekkelig for en bindende analysen.
      1. For blodbanen former, vokse celler i HMI-9 Media supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS) ved 37 ° c og 5% CO2. Hold celle tetthet mellom 8,0 x 105 til 1,6 x 106 celler/ml.
        Merk: tetthet høyere enn 1,8 x 106 celler/ml kan påvirke celle levedyktighet. Dobling-tiden av T. brucei 427 belastning dyrket in vitro er mellom 5,5 og 6,5 h.
      2. For procyclic former vokser celler i SDM-79 medium supplert med 10% FBS ved 27 ° c og holde celle tetthet mellom 1,0 x 107 og 3,0 x 107 celler/ml.
      3. For renset proteiner (f. eks, rekombinant proteiner), ta 0,5 til 1 mikrogram protein og fortynne i 450 μL av bindende buffer (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,2% 4-nonyl fenyl-polyetylen glykol, pH 7,4). Behold 5% av det fortynnede proteinet (input) for Western Blot-analyse. Fortsett til trinn 1.1.7.
    2. Sentrifuger celler ved 1 600 x g i 10 min ved romtemperatur (RT). Kast supernatanten.
      Merk: se trinn 2.1.2 for mer informasjon om sentrifugering av store kultur volumer.
    3. Forsiktig resuspend pellet i 10 mL av fosfat bufret saltvann pH 7,4 supplert med 6 mM glukose (PBS-G) og forvarmet til 37 ° c for å vaske cellene. Deretter sentrifuger cellene på 1 600 x g i 5 min ved RT. Gjenta prosedyren to ganger.
    4. Resuspend pellet i 1 mL PBS-G. Deretter overfører du volumet til et 1,5 mL rør og sentrifuger ved 1 600 x g i 5 min. kast supernatanten.
      Merk: celle pellets kan blinke frosset i flytende nitrogen og oppbevares ved-80 ° c eller flytende nitrogen.
    5. Resuspend pellet i 0,5 mL lyseringsbuffer (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol, pH 7,4) supplert med 1,5 x protease inhibitor cocktail og 1x fosfatase inhibitor cocktail (tabell over materialer) pre-kjølt i is for å lyse cellene. Ruge lysat i 10 min roterende ved 50 RPM ved 4 ° c.
      Merk: Dette er et kritisk trinn fordi proteiner kan svekkes hvis de ikke håndteres som indikert. Kontroller integriteten til protein lysat ved natrium natriumdodecylsulfat sulfat-polyakrylamid gel elektroforese (SDS/side) om nødvendig.
      FORSIKTIG: T-octylphenoxypolyethoxyethanol er giftig og kan forårsake hud-og øyeirritasjon. Bruk hansker, Eyeshield og faceshield beskyttelse.
    6. Sentrifuger lysat ved 14 000 x g i 10 min ved 4 ° c. Samle supernatanten i et nytt 1,5 mL rør for bindende analyser. Hold 5% av total lysat (input) for Western blotting analyse. Supernatanten inneholder parasitt proteiner utvunnet med lyseringsbuffer.
    7. Samle 50 μL av IPs eller PIs bøyd til agarose perler (dvs. 50 μL av slurry) eller 50 μL av agarose perler, og sentrifuger i 1 min ved 1 000 x g. Kast supernatanten og resuspend i 50 μL av bindings buffer for å likevekt perlene. Bruk ikke-bøyd perler som en kontroll. Bruk IP/PI-perler med forskjellig fosfat konfigurasjon inkludert ikke-fosforylert skjemaer for å kontrollere for løs interaksjoner.
    8. Tilsett 50 μL av IP-eller PI-perler til celle lysat eller renset proteiner (hver 1 mL av perlene inneholder 10 nmol av bøyd IPs eller PIs). Hold volumet av IP-eller PI-perler innen 10% av den totale lysat og om nødvendig, justere bindende reaksjons volum med bindende buffer.
      1. For konkurranse analyser, legge til bindende reaksjonen ulike konsentrasjoner av ikke-bøyd IPs eller PIs (f. eks 1-, 10-, 100-fold molar overflødig sammenlignet med IP-eller PI-perler).
    9. Ruge reaksjonen for 1 time, eller over natten, ved 4 ° c og roterer ved 50 RPM.
      Merk: bindende reaksjoner med renset proteiner kan gjøres på RT avhengig av stabiliteten av proteinet. Hvis du bruker IPs eller PIs bøyd til biotin bare gå videre til trinn 1.1.9.1, ellers går du til trinn 1.1.10.
      1. Tilsett 50 μL av streptavidin til magnetiske perler i bindings reaksjonen og ruge for 1 time ved 4 ° c ved 50 RPM.
    10. Sentrifuger blandingen i 1 min ved 1 000 x g ved 4 ° c. Fjern supernatanten (Flow-through) og holde pellet. Hold 5% av supernatanten for Western Blot analyse.
      Merk: Hvis du bruker magnetiske perler, Fjern supernatanter og utfør påfølgende vasker med et magnetisk stativ (centrifugations er ikke nødvendig).
    11. Tilsett 1 mL vaskebuffer (25 mM HEPES, 300 mM NaCl, 0,2% 4-nonyl fenyl-polyetylen-glykol, pH 7,4) og resuspend harpiks ved å trykke eller virvlende røret (ikke bruk en pipette fordi perler kan festes til pipette tips). Sentrifuger reaksjonen i 1 min ved 1 000 x g ved 4 ° c og kast supernatanten. Gjenta prosedyren for totalt fem vasker.
      FORSIKTIG: 4-nonyl fenyl-polyetylen-glykol er giftig og kan forårsake hud-og øyeirritasjon. Bruk hansker, Eyeshield og faceshield beskyttelse.
    12. Tilsett 50 μL av 2x Laemmli buffer supplert med 710 mM 2-mercaptoethanol til perlene og bland ved å trykke eller Vortex å eluere proteinene. Heat ved 95 ° c i 5 min, deretter sentrifuger for 10 000 x g for 1 min og samle supernatanten (inneholder eluert proteiner). Alternativt kan eluere proteiner med 8 M urea/100 mM Glycine pH 2,9 for å unngå å bruke SDS. Frys eluatet ved-80 ° c, ellers Fortsett til Western Blot analyse.
      FORSIKTIG: 2-mercaptoethanol er giftig og kan forårsake hud-, øye-og respirasjons irritasjoner. Bruk hansker og arbeid i den kjemiske panseret.
  2. Vestlig blotting analyse
    1. Bland 15 μL input (fra trinn 1.1.6) eller gjennomstrømning (fra trinn 1.1.10) prøver med 5 μL av 4X Laemmli buffer. Varme inn-og gjennomstrømnings prøver i 5 minutter ved 95 ° c. For prøver eluert i 8 M urea/100 mM Glycine pH 2,9, bland 15 μL av eluatet med 5 μL 4X Laemmli buffer, og varme i 5 minutter ved 95 ° c.
      Merk: dette trinnet er ikke nødvendig for prøver eluert i 2x Laemmli buffer.
    2. Last brønner på 4-20% SDS/side gel med 2,5 μL av input, 2,5 μL gjennomstrømning, og 20 μL av eluert prøver, og Last protein stigen i henhold til produsentens anbefaling.
      Merk: Velg gel% i henhold til Molekylvekten av proteinet av interesse.
    3. Kjør SDS/PAGE på 150 V for 30-45 min i å kjøre buffer, eller til den blå fargestoff av Laemmli buffer er på slutten av gelen.
      Merk: kjøretiden kan variere i henhold til laboratorieutstyr.
    4. Fjern gelen fra glass (eller plast) plater, og suge i overføring buffer i 15 min.
    5. Overfør proteinene til Polyvinylidene polyvinylidenfluorid (PVDF) membran eller nitrocellulose membran. Sug membraner og 3 mm filter papir i overføringsbuffer. Sett sammen en sandwich med tre ark med filter papir, nitrocellulose eller PVDF-membran, gel og ytterligere tre ark med filter papir. Pass på at ingen luftbobler er fanget i smørbrødet. Bruk en valse for å fjerne bobler om nødvendig. Sett membranen på bilderør og gel på anode IDen av kassetten.
      Merk: Kontroller membranen produsentens instruksjoner for informasjon om membran aktivering eller blot forberedelse.
    6. Plasser kassetten som inneholder smørbrødet, i overførings tanken med overføringsbuffer. Plasser tanken i en is bøtte eller ved 4 ° c (f.eks. i kjølerommet). Overfør proteiner ved 100 V for 1 time (strøm varierer mellom 200-400 mA). Alternativt kan du overføre over natten med en konstant strøm på 15 mA ved 4 ° c.
    7. Fjern membranen fra kassetten. Ruge membranen i 6% ikke-fett tørr melk fortynnet i PBS med 0,05% av polysorbat 20 (PBS-T), eller kompatibel blokkering løsning, for 1 h ved RT å blokkere membranen.
      Merk: før du blokkerer membranen, kan kvaliteten på overføringen kontrolleres ved hjelp av Ponceau S-flekken. Ruge membranen i 1 min i 15 mL Ponceau S, skyll i vann og Visualiser bånd.
    8. Fjern blokkering løsningen og ruge membranen for 1 t ved RT med 50 RPM rotasjon i primære antistoffer fortynnet i 6% ikke-fett tørr melk fortynnet i PBS-T. Alternativt, ruge membran over natten ved 4 ° c med 50 RPM rotasjon.
      Merk: tidspunktet for inkubasjons kan variere i henhold til kvaliteten på antistoffene; imidlertid vil de fleste antistoffer arbeide med incubations av 1-3 h ved RT. følg produsentens anbefaling for antistoffer konsentrasjon eller fortynning.
    9. Vask blot ved å incubating membranen i PBS-T i 5 minutter med 50 RPM rotasjon på RT. Gjenta prosedyren 3-5 ganger. Flere vasker kan være nødvendig avhengig av kvaliteten på antistoffer.
    10. Ruge membranen i pepperrot peroksidase (HRP)-bøyd sekundære antistoffer for 1 t ved RT i 6% ikke-fett tørr melk fortynnet i PBS-T med 50 RPM rotasjon.
      Merk: følg produsentens anbefaling for antistoffer konsentrasjon eller fortynning.
    11. Vask blot som indikert i trinn 1.2.9.
    12. Tilsett chemiluminiscerende substrat for å dekke membranen. Fjern overflødig substrat og ruge i 5 minutter ved RT i mørket.
      Merk: se produsentens anvisninger for anbefalinger om de kjemiluminescens reagensene.
    13. Fang chemiluminiscerende signalet ved hjelp av et kamerabasert Imager. Du kan også bruke en røntgen film til å ta opp det chemiluminiscerende signalet.

2. analyse av IP/PI-bindende proteiner av affinitet kromatografi og masse massespektrometri

  1. Cellevekst, lyse og affinitet kromatografi
    1. Grow T. brucei celler til midten av loggen fase og overvåke celle levedyktighet og tetthet.
      Merk: totalt 1,0 x 1010 celler er nok for to bindende analyser. Bruke færre celler enn angitt her kan påvirke påvisning av lav overflod proteiner av masse massespektrometri.
      1. For T. brucei blodbanen former, vokser celler på midten av loggen fase (8,0 x 105-1,6 x 106 celler/ml) i HMI-9 Media supplert med 10% FBS ved 37 ° c og med 5% co2. For 427 belastning, 5 L av kulturen vil gi 0,5-1,0 x 1010 celler. Overvåk celleveksten for å unngå tetthet høyere enn 1,8 x 106 celler/ml som kan påvirke celle levedyktighet. Hold cellekultur volumet til 1/10 av flasken volum; ellers vil veksten av cellene bli påvirket på grunn av dårlig lufting.
        Merk: 427 belastningen har en dobling tid på 5,5 til 6,5 h.
      2. For procyclic former vokser celler i SDM-79 medium supplert med 10% FBS ved 27 ° c og holde celle tetthet mellom 1,0 x 107 og 3,0 x 107 celler/ml. 500 mL kultur vil gi 0,5-1.5 x 1010 celler.
    2. Sentrifuger cellene ved 1 600 x g i 15 min ved RT. kast supernatanten og resuspend pellet i 200 ml av PBS-g forvarmet til 37 ° c. Bruk rund bunn sentrifugering rør (tabell av materialer) fordi T. brucei blodbanen form pellets er lett forstyrret når du bruker fast vinkel sentrifuge bremseskiver. Sentrifuger cellene igjen ved 1 600 x g i 5 min ved RT.
    3. Fjern supernatanten og resuspend pellet i 10 mL PBS-G. Sentrifuger cellene ved 1 600 x g i 5 min ved RT. Gjenta prosedyren og etter den siste vasken, kast supernatanten.
      Merk: pellets kan blinke frosset i flytende nitrogen og oppbevares ved-80 ° c eller flytende nitrogen.
    4. Resuspend cellen pellet i 5 mL av lyseringsbuffer pre-kjølt i is og supplert med 1,5 x protease inhibitor cocktail og 1x fosfatase inhibitor cocktail (tabell over materialer). Ruge lysat i 10 min ved 4 ° c roterende ved 50 RPM.
    5. Sentrifuger lysat ved 10 000 x g i 10 min ved 4 ° c. Samle supernatanten (solubilized proteiner) og fortynne det i 20 mL av bindende buffer.
    6. Samle 400 μL av IPs eller PIs bøyd til agarose perler (dvs. 400 μL av slurry) eller 400 μL av kontroll perler, og sentrifuger for 1 min ved 1 000 x g ved RT. kast supernatanten og resuspend i 400 μL av bindings buffer for å likevekt perlene. Bruk agarose perler som en negativ kontroll for å fastslå spesifikk berikelse av protein-metabolitten interaksjoner sammenlignet med løs interaksjoner (f. eks, proteiner som binder nonspecifically til perlene). Bruk IPs eller PIs med ulike fosfat konfigurasjoner inkludert ikke-fosforylert skjemaer for å kontrollere for løs interaksjoner på grunn av fosfat kostnader eller binding til biotin.
    7. Tilsett 400 μL av IP/PI-perler eller kontroll perler til 10 mL lysat og inkubert for 1 t, eller over natten, ved 4 ° c roterende ved 50 RPM. Hvis bruk av IPs eller PIs bøyes likt med biotin bare (uten perler) Fortsett til trinn 2.1.7.1, ellers gå videre til trinn 2.1.8.
      1. Tilsett 100 μL av streptavidin-bøyd på magnetiske perler og ruge for 1 time ved 4 ° c roterende ved 50 RPM.
    8. Sentrifuger bindings reaksjonen i 1 min ved 1 000 x g ved 4 ° c. Fjern supernatanten (Flow-through) og holde pellet. Hold 5% av supernatanten for Western Blot analyse.
    9. Tilsett 5 mL vaskebuffer til pellet, bland forsiktig ved å virvlende røret, og deretter sentrifuge i 1 min ved 1 000 x g ved 4 ° c. Kast supernatanten. Gjenta vasken fem ganger. Hvis du bruker magnetiske perler, samle supernatanter og utføre vasker med en magnetisk stativ (centrifugations er ikke nødvendig).
    10. Tilsett 50 μL av 2x Laemmli buffer (eller 8 M urea/100 mM Glycine pH 2,9, for å unngå å bruke SDS) til perlene og bland ved å trykke eller Vortex (unngå pipettering fordi perlene kan festes til pipette tips), og deretter varme ved 95 ° c i 5 min. sentrifuger for 10 000 x g i 1 min og samle supernatanten (eluert proteiner). Gjenta prosedyren to ganger for å samle sammen tre brøker.
    11. Frys eluatet ved-80 ° c, ellers separate proteiner i SDS/PAGE eller Behold løsningen for trypsinization og masse massespektrometri analyse.
  2. Trypsin fordøyelse av proteiner for masse massespektrometri
    Merk: to variasjoner av denne prosedyren er vist for Seksjon 2.2.1 (i gel) eller Seksjon 2.2.2 (i løsning) fordøyelse av proteiner. Protein lav bindende rør anbefales for å hindre tap av prøver. Rådfør deg med en analytisk kjemiker ved Proteomikk anlegget egnetheten av protokollen for prøver og masse spektrometer instrumenter tilgjengelig.
    1. In-gel trypsinization av proteiner
      1. Etter protein separasjon i SDS/PAGE, skyll en kort gel i vann med høy renhet. Overfør gelen til en ren glassplate. Avgiftsdirektoratet protein band med et rent blad og unngå å kutte ekstra gel utenfor band. Skjær gel brikkene i små biter (dvs. ca 1 mm firkant) og overføre dem til en 1 mL tube. Bruk en pipette tips om nødvendig, men sørg for at pipette spissen skylles i etanol før bruk.
        Merk: Bruk hansker for å unngå kontaminering med gelé. Gel brikker kan oppbevares ved-20 ° c.
      2. Tilsett 100 μL av høy-renhet eller høy ytelse væske kromatografi grade vann til rør for å skylle gel stykker. Kast vannet.
        1. For Coomassie eller ruthenium-baserte fluorescerende beiset gel biter, ruge gel brikkene i destaining løsning (25 mM NH4HCO3 i 50% acetonitril) for 1 t, deretter forkaste løsningen. Gjenta prosedyren til farging ikke er synlig.
          Merk: Forbered løsninger som inneholder NH4HCO3 ved fortynning fra en lagerløsning på 100 mm NH4HCO3, pH 7,8.
          FORSIKTIG: Acetonitril er et flyktig løsemiddel, brannfarlig og giftig. NH4HCO3 kan forårsake hud-eller øyeirritasjon. Bruk hansker og arbeid under en kjemisk hette.
        2. For sølvfargede gel-brikker, ruge gelé brikker i 50 μL av destaining løsning for sølv beis (15 mM K3[fe (CN)6], 50 mm na2S2O3) i vann i 30 min. kast oppløsningen og vask gel stykker med 200 μL av vann. Gjenta vask fem ganger eller til gel gul farge er ikke synlig.
          FORSIKTIG: K3[fe (CN)6] kan forårsake hud-eller øyeirritasjon. Bruk hansker.
      3. Tørke gelé bitene ved hjelp av 200 μL av acetonitril i 10 min ved RT. Deretter forkaste løsningen.
        Merk: dehydrert gel brikker er mindre i volum, ugjennomsiktig, og tacky. Hvis flere biter av gel er kombinert i ett rør, gjenta prosedyren for effektiv dehydrering av gel stykker.
      4. Tilsett 50 μL (eller nok volum til å dekke gel biter) av reduksjons løsning (10 mM dithiotreitol [DTT] i 100 mM NH4HCO3) og ruge ved 56 ° c for 1 time etterpå, Avkjøl rørene til RT og kast overskytende av reduksjons løsningen.
      5. Tilsett 50 μL (eller nok volum til å dekke gel-bitene) av alkylation oppløsning (50 mM iodoacetamide i 100 mM NH4HCO3) og ruge i 30 min ved RT i mørket. Etterpå, kast overskytende av alkylation løsning.
      6. Tørke gelé bitene med 200 μL av acetonitril i 10 min ved RT. Fjern acetonitril og fukt gelé bitene med 100 mM NH4HCO3 for 10 min ved RT.
      7. Tørke gel på nytt med 200 μL av acetonitril i 10 min ved RT og kast overflødig oppløsning.
      8. Tilsett 15 μL av masse massespektrometri grade Trypsin fortynnet i 50 mM NH4HCO3 buffer, eller nok volum til å dekke hydrert gel stykker og ruge for 4 t, eller over natten, ved 37 ° c. Hold totalt Trypsin beløp mellom 100 til 500 NG (eller 20 ng Trypsin/mikrogram protein).
      9. Avkjøl prøven til RT, og sentrifuger i 1 min ved 2 000 x g i en mikrosentrifugen. Tilsett 10-20 μL av 5% maursyre syre fortynnet i vann og ruge i 10 minutter ved RT.
        FORSIKTIG: maursyre yre er brannfarlig, etsende og giftig. Bruk hansker og arbeid under en kjemisk hette.
      10. Sentrifuger som indikert i trinn 2.2.1.9, deretter samle supernatanten (inneholder utpakkede peptider) til et annet rør. Tilsett 20 μL av 5% maursyre syre fortynnet i 50-60% acetonitril til røret og ruge i 10 min ved RT. samle ut peptid fraksjoner i samme tube.
      11. Tørk prøven i et vakuum konsentrat og Rekonstituer i 10 μL av 0,5% eddiksyre og 2% acetonitril for masse massespektrometri analyse. Sentrifuger og samle løsningen på bunnen av røret; lagringsløsning ved-20 ° c eller-80 ° c.
    2. I løsning trypsinization av proteiner
      1. Utløse proteiner for å redusere prøvevolum, avsaltingsspisser overlegne sammenlignet, og buffer utveksling. Tilsett seks bind med kjølt (-20 ° c) aceton til prøven, for eksempel 600 μL av aceton til 100 μL av prøve. Vortex og ruge ved-20 ° c i 15 min til 1 time. Løsningen vil slå skyet eller danne en utfelling.
        FORSIKTIG: aceton er giftig og brannfarlig. Bruk hansker og arbeid under en kjemisk hette.
      2. Sentrifuge prøver ved 4 ° c i 30 min. Dekanter aceton og lufttørke pellet i 15 min.
      3. Tilsett 10 μL av 6-8 M urea eller 1% SDS i 50 mM NH4HCO3 for å oppløse pellet og Vortex å blande. For større mengder proteiner (> 10 μg) kan du bruke opptil 20 μL oppløsnings buffer.
      4. Tilsett 5 μL av reduksjons løsning og Vortex. Snurr ned volumet med en mikrosentrifugen. Hvis prøvene er fortynnet i urea, deretter ruge for 1 time ved RT. Hvis prøvene fortynnes i SDS, inkubert i 1 time ved 56 ° c.
      5. Snurr ned volumet med en mikrosentrifugen. Tilsett 3 μL av alkylation oppløsning og Vortex. Deretter spinne volumet ned og ruge i mørket i 30 min ved RT.
      6. Tilsett 3 μL av reduksjons løsning for å nøytralisere reaksjonen. Sakte fortynne prøven til 1 M urea eller 0,05% SDS ved hjelp av 50 mM NH4HCO3.
        Merk: Trypsin fordøyelses buffer må ha vaskemiddel eller denaturant. Konsentrasjonsgrenser for denaturants er: 0,05% SDS; 0,1% oktyl) B-D-glucopyranoside; 0,1% 4-nonylphenyl-polyetylen-glykol; 0,1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol; 0,1% polysorbat 20; 0,1% 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate; < 1 M urea eller thiourea.
      7. Tilsett 5 μL av masse massespektrometri grade Trypsin fortynnet i 50 mM NH4HCO3 buffer og ruge for 4 t, eller over natten, ved 37 ° c. Hold totalt Trypsin beløp mellom 100 og 500 NG (eller 20 ng Trypsin/mikrogram protein).
      8. Avkjøl prøven til RT, og spinn volumet ned ved hjelp av en mikrosentrifugen. Tilsett 5% eddiksyre (eller 5% maursyre syre i 50% acetonitril) for å slukke reaksjonen.
      9. Tørk prøvene i et vakuum konsentratoren som indikert i trinn 2.2.1.11. Lagre prøver ved-80 ° c. Avsalte og konsentrere peptider ved hjelp av en reversert fase kolonne som C18 zip-tip og deretter analysere ved masse massespektrometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analyse av RAP1 og PI (3, 4, 5) P3 interaksjon ved affinitet kromatografi og vestlig blotting
Dette eksemplet illustrerer anvendelsen av denne metoden for å analysere bindingen av PIs av RAP1 fra T. brucei lysat eller ved rekombinant t. brucei RAP1 protein. Lysater av T. brucei blodbanen former som uttrykker HEMAGGLUTININ (ha)-Tagged RAP1 ble brukt i bindende analyser. RAP1 er et protein som er involvert i transcriptional kontroll av variant overflaten glykoprotein (VSG) gener3,48, som koder for overflate proteiner involvert i parasitten immune Evasion av antigen variasjon49. RAP1 samhandler innenfor et telomeric protein kompleks med phosphatidylinositol 5-fosfatase (PIP5Pase) enzym3, som også fungerer i kontroll av VSG gen transkripsjon1,3. RAP1 har et N-Terminal brystkreft 1 kar bok syl-Terminal (BRCT) domene som etterfølges av et myeloblastosis (myb) DNA-bindende domene og et C-terminal myb-lignende domene3,48. Men det mangler kanoniske PI bindende domener. Binding analysene ble utført med PIs som er ikke-fosforylert eller er fosforylert på ulike posisjoner i Inositol ringen, og med ikke-bøyd agarose perler. Western analyse viser at RAP1 binder fortrinnsvis til PI (3, 4, 5) P3-perler (Figur 3A), men det binder også i mindre grad til PI (4, 5) P2-perler. Men det gjorde ikke binde til andre PIs eller agarose perler. Fordi RAP1 er en del av en multiprotein kompleks3, dets interaksjon med noen PIs kan ikke være direkte og dermed resultater fra RAP1-ha interaksjon med andre cellulære proteiner som binder til PIs.

Derfor, for å teste om RAP1 binder direkte til PIs, en C-dødsmerket 6 ganger-hans rekombinant RAP1 (rRAP1) protein ble uttrykt og renset for homogenitet fra E. coli3. Proteinet ble brukt i bindende analyser med PI (3, 4, 5) P3-perler i nærvær av konkurrerende konsentrasjoner av PI (3, 4, 5) P3 eller PI (4, 5) P2. Western blotting viser at økende konsentrasjoner av PI (3, 4, 5) P3, men ikke PI (4, 5) P2 hemmer samspillet mellom rRAP1 med PI (3, 4, 5) P3 (Figur 3B). Videre tillegg av T. brucei renset PIP5Pase enzym til REAKSJONEN restaurert PI (3, 4, 5) P3-binding av rRAP1, som skyldes PIP5Pase defosforylering av gratis PI (3, 4, 5) P33 og dermed indikerer at fosforylering mønster av denne metabolitten er avgjørende for rRAP1 bindende. Derfor rRAP1 samhandler med PI (3, 4, 5) P3 som det gjør RAP1-HA fra T. brucei lysater. Videre viser dataene at binding av RAP1-HA fra lysat til PI (4, 5) P2 sannsynlige resultater fra RAP1 interaksjon med andre proteiner i komplekset (for eksempel PIP5Pase)3. Dataene illustrerer komplementaritet av bindende analyser med celle lysater og rekombinant proteiner. Det viser også nytten av konkurransedyktige bindende analyser for å bestemme spesifisitet av interaksjoner mellom proteiner og PIs.

Identifisering av ins (1, 4, 5) P3 bindende proteiner av affinitet kromatografi og masse massespektrometri
I dette eksempelet ble affinitet kromatografi etterfulgt av masse massespektrometri brukt til å identifisere T. brucei proteiner som binder til ins (1, 4, 5) P3; Derfor eksperimentet undersøkelser potensielle ins (1, 4, 5) P3 bindende proteiner fra T. brucei blodbanen former. T. brucei lysat ble inkubert med ins (1, 4, 5) P3 bøyd til agarose perler eller med ikke-bøyd perler (brukes som en kontroll), og bundet proteiner ble Eluert med Laemmli sample buffer. SDS/PAGE analyse viser berikelse i proteiner eluert fra ins (1, 4, 5) P3-perler i forhold til proteiner eluert fra kontroll agarose perler (Figur 4A). Masse massespektrometri analyse av eluert proteiner identifisert over 250 proteiner, hvorav 84 ble beriket med ins (1, 4, 5) P3 perler i forhold til kontroll perler (Figur 4B, fold endring [FC] ≥ 2, p < 0,05). Den berikelse av proteiner bundet til ins (1, 4, 5) P3 sammenlignet med kontroll perler samsvarer med protein signalet oppdages av SDS/PAGE. Dataene inkluderer proteiner som ble validert for å binde ins (1, 4, 5) P3 og proteiner som mekanismer for binding til ins (1, 4, 5) P3 er ukjent8. Videre er det ins (1, 4, 5) P3 bindende proteom skilte sterkt fra at av ins (1, 3, 4, 5) P4 og andre PIs8, noe som tyder på at noen av disse proteinene gjenkjenne spesifikke fosfat konfigurasjonen av ins (1, 4, 5) P3. Derfor, biotin-kodede ins (1, 4, 5) P3 kan brukes til affinitet kromatografi koplet til masse massespektrometri å identifisere proteiner som binder til ins (1, 4, 5) P3. Tilnærmingen kan utforskes for å identifisere proteiner som binder seg til andre IP eller PIs3,8,46,47.

Figure 1
Figur 1 -Affinitet reagenser for bindende analyser. (A) PI (3, 4, 5) P3 (øverst) og ins (1, 4, 5) P3 (nederst) som bøyes likt til biotin ved SN1 posisjon Inositol. I PI (3, 4, 5) P3, blir biotin bøyd til lipid-kjeden på SN1 posisjon Inositol, mens i ins (1, 4, 5) P3 biotin blir bøyd til fosfat i posisjon SN1. (B) ins (1, 4, 5) P3 er bøyd med biotin og fanges opp via binding til streptavidin bøyd til perler (f. eks, agarose eller magnetiske perler). Variasjoner av disse reagensene ved hjelp av tilpassede syntetisert Linkers som erstatter biotin er også mulig46. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Arbeidsflyten av protokoller beskriver fremgangsmåten for analyse av IP eller PI affinitet interaksjon med proteiner av T. brucei og påvisning av (A) vestlig blotting eller (B) masse massespektrometri. AC-WB, affinitet kromatografi og vestlig blotting; AC-MS, affinitet kromatografi og masse massespektrometri. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Binding av T. brucei RAP1 til phosphoinositides. (A) Lysater av T. brucei (5,0 x 107 parasitter) som uttrykker ha-Tagged RAP1 ble inkubert for 2 h ved 4 ° c med 50 ΜL av PIs (hver 1 ml agarose perler som inneholder 10 nmol av bøyd PIs) eller agarose (AG) perler. Bindings reaksjonen ble vasket og eluert med 2 x Laemmli prøve buffer og oppvarmet ved 95 ° c i 5 min. proteiner ble separert i 4-20% SDS/PAGE, overført til en PVDF-membran, og analysert med monoklonale antistoffer anti-HA (1:5000, fortynnet i 6% PBS-Milk) fulgte av anti-mus IgG-HRP (1:5000, fortynnet i 6% PBS-Milk), og oppdaget av kjemiluminescens. (B) en μg av rRAP1 var inkubert for 1 h ved RT med 50 ΜL av PI (3, 4, 5) P3-agarose perler i nærvær eller fravær av 5 til 50 μM Dioctanoylglycerol (DIC8) PI (3, 4, 5) P3, 20 til 50 ΜM diC8 PI (4, 5) P2 eller 50 ΜM diC8 PI (3, 4, 5) p3 og 250 ng PIP5Pase renset fra T. brucei blodbanen skjemaer3. Binding ble analysert av vestlige blotting med musen anti-His HRP monoklonale antistoffer (1:2000, fortynnet i 6% PBS-Milk) og utviklet av kjemiluminescens. Dette tallet har blitt modifisert fra Cestari et al.3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Affinitet kromatografi og masse massespektrometri analyse av T. brucei proteiner som binder til ins (1, 4, 5) P3. (A) 10% SDS/side analyse av T. brucei proteiner som binder til ins (1, 4, 5) P3-perler eller agarose perler. Lysater av 5,0 x 109 parasitter ble inkubert ved 4 ° c for 2 h med 400 ΜL av ins (1, 4, 5) P3 bøyd til agarose perler eller med agarose perler uten ins (1, 4, 5) P3 [1 ml perler inneholder 10 nmol av bøyd ins (1, 4, 5) P3]. Bindings reaksjonen ble vasket, eluert i 2 x Laemmli prøve buffer og kokt i 5 min ved 95 ° c. Proteiner ble separert i 10% SDS/side og farget med Coomassie farging (tabell over materialer). Pilspisser viser proteiner som er beriket i tillegg (1, 4, 5) P3-perler sammenlignet med agarose perler; sirkler indikere proteiner tilstede i begge ins (1, 4, 5) P3-perler og agarose perler, og braketten indikerer proteiner som er til stede i begge, men er beriket i ins (1, 4, 5) P3-perler sammenlignet med agarose perler. (B) dot-plot viser proteiner identifisert av masse massespektrometri som er beriket i ins (1, 4, 5) P3-perler i forhold til agarose perler. Berikelse definert av FC > 2 og p-Value < 0,05. Fire biologiske reproduserer ble brukt for agarose-perler AC-MS, og tre biologiske replikerer for IP3-perler AC-MS. fold-endring av proteiner identifisert i IP3-perler vs agarose-perler ble beregnet ved hjelp av peptid Spectra intensitet ved hjelp av MSstat50. Detaljerte resultater og liste over peptider er tilgjengelig8. Mass massespektrometri rådata er også tilgjengelig med identifikatoren PXD005907 gjennom ProteomeXchange Consortium via PRIDE partner depotet. Dette tallet har blitt modifisert fra Cestari et al.8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Identifisering av proteiner som binder til IPs eller PIs er avgjørende for å forstå cellulære funksjon av disse metabolitter. Affinitet kromatografi koplet til Western Blot eller masse massespektrometri gir en mulighet til å identifisere IP eller PI samspill proteiner og dermed få innsikt i sin regulatoriske funksjon. IPs eller PIs kjemisk merket [f. eks ins (1, 4, 5) P3 kjemisk knyttet til biotin] og krysskoblet til agarose perler via streptavidin eller fanget av streptavidin magnetiske perler tillater isolering av samspill proteiner som deretter kan identifiseres av massen massespektrometri eller Western Blot. Protokollene beskrevet her har blitt brukt til å identifisere proteiner fra T. brucei3,8 og pattedyrceller47 som binder til disse metabolitter. Varianter av tilnærmingen som bruker tilpassede koder (annet enn biotin) har også vært brukt i gjær46. En viktig faktor for denne tilnærmingen er bruk av kontroller for å diskriminere spesifikke fra ikke-spesifikke interaksjoner. Ikke-bøyd perler er en viktig kontroll, men ytterligere kontroller kan omfatte ikke-fosforylert PIs eller Inositol bøyd til perler3. IPS eller PIs med ulike fosfat kombinasjoner3,8 kan også brukes fordi proteinbinding til disse metabolitter kan innebære domener som diskriminerer fosfat konfigurasjonen av Inositol38, 39,40,41. I tillegg kan prøve kompleksitet påvirke følsomheten til tilnærmingen, og dermed redusere prøve kompleksiteten ved å prøve fraksjonering kan bidra til påvisning av lave mengder proteiner i cellen. Det er veletablerte protokoller for celle fraksjonering og isolering av mitokondrie51, Nucleus52, glycosome53og flagellum54,55 fra trypanosomes. Legg merke til at buffere og reagenser som brukes i subcellulære fraksjoneringer, kanskje må justeres for kompatibilitet med buffere og reagenser som brukes i denne protokollen. Spesielt identifisering av proteiner som binder til IPs eller PIs av affinitet kromatografi som indikert her avhenger av protein og metabolitten affinitet av interaksjon, og dermed proteiner som har en svak affinitet for IPs eller PIs kan ikke lett oppdages.

Analysen av IP eller PI interaksjon med proteiner fra celle lysat kan også resultere i identifisering av proteiner som ikke binder direkte til disse metabolitter, men som interaksjon resultater fra protein foreningen i komplekse med andre proteiner som binder til IPs eller PIs. Denne funksjonen er et eksempel på Figur 3A, der RAP1-ha fra T. brucei lysat ser ut til å binde til PI (3, 4, 5) P3-perler og PI (4, 5) P2-perler. Men bindende analyser med hans-kodede rRAP1 viser at dette proteinet binder seg til PI (3, 4, 5) P3 og ikke PI (4, 5) P23. Dette illustreres i Figur 3B, der konkurransedyktige analyser viser at gratis PI (3, 4, 5) P3 men ikke gratis PI (4, 5) P2 konkurrerer om rRAP1-hans interaksjon med PI (3, 4, 5) P3-perler. RAP1 tilsynelatende interaksjon med PI (4, 5) P2-perler skyldes RAP1 forening innenfor et kompleks med proteiner som binder PI (4, 5) P2 (f. eks PIP5Pase)3. Derfor kan bindende analyser fra celle lysater identifisere proteiner som binder direkte eller indirekte til IPs eller PIs. Spesielt, indirekte interaksjoner er forskjellig fra løs interaksjoner siden den tidligere kan ha en biologisk funksjon (i sammenheng med protein kompleks) som påvirker eller er påvirket av metabolitten binding. For eksempel, ins (1, 4, 5, 6) P4 binder seg til multi-delenhet co-hemmende deacetylase kompleks og styrer den komplekse forsamlingen og aktivitet13. Derfor er det viktig å validere IP/PI interaksjoner med proteiner. Validering av interaksjon kan innebære konkurranse analyser med et overskudd av IPS eller PIs (som i Figur 3B)3,8, mutasjoner av potensielle protein domener56, eller bruk av renset proteiner til bestemme direkte interaksjoner (Figur 3A, B)3.

Andre metoder for å studere protein og IP eller PI interaksjoner inkluderer binding av proteiner til radiolabeled IPs eller PIs, bruk IPs eller PIs bundet til hydrofobe membraner som matriser for protein fangst, eller binding av proteiner til PIs innlemmet i liposomer 42 for alle , 57 for alle , 58. viktigere, hvis protein interaksjon med PIs krever membran strukturer38, liposome-baserte analyser kan brukes som en komplementær tilnærming. Begrensninger av disse tilnærmingene inkluderer lav gjennomstrømning, lav følsomhet, den ukjente kjemiske orienteringen av IPs eller PIs forening til matriser58, eller bruk av radioaktive materialer42. Metoden som er beskrevet her er følsom, liposome, ikke-radioaktivt, og IP/PI-perler er kommersielt tilgjengelig, og dermed de ikke krever tilpasset kjemisk syntese. Videre er plasseringen av biotin knyttet til IPS eller PIs godt definert, og det kan også endres46,58, som tillater presis analyse av protein og metabolitten interaksjon. Metoden beskrevet her kan også kombineres med kvantitative masse massespektrometri tilnærminger som stabil isotop merking av aminosyrer i cellekultur (SILAC)47, som kan brukes til å identifisere dynamiske interaksjoner under ulike mobilnettet behandlinger eller forhold. Affinitet kromatografi koplet til Western Blot eller Mass massespektrometri har bidratt til å identifisere mange IP-eller PI-bindende proteiner fra T. brucei, pattedyrceller, og gjær3,8,46, 47, inkludert proteiner som ikke har karakterisert IP-eller PI-bindende domener, og det har også bidratt til identifisering av romanen bindende domener, f. eks, PI (3, 4, 5) P3 bindende domene47.

Overall, protokollene beskrevet her kan brukes til å kartlegge potensielle IP eller PI samspill proteiner fra T. brucei, og å studere molekylær interaksjon av proteiner med disse metabolitter. Protokollen kan enkelt tilpasses til å identifisere IP-eller PI-bindende proteiner fra andre encellede parasitter eller fra andre organismer som pattedyrceller47 og gjær46, og det vil bidra til å ytterligere forstå den biologiske funksjon av IPS og PIs i Landplantenes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Natural Sciences og engineering Research Council of Canada (NSERC, RGPIN-2019-04658); NSERC Discovery lanseringen supplement for tidlig karriere forskere (DGECR-2019-00081) og ved McGill University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma-Aldrich 650501 Ketone
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 Solvent 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MI Beckman Coulter Avanti J6-MI Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botles Sigma-Aldrich B1408 Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control Beads Echelon P-B000-1ml Affinity chromatography reagent - control
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT)  Bio-Rad 1610610 Reducing agent
Dynabeads M-270 Streptavidin ThermoFisher Scientific 65305 Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitors
Electrophoresis running buffer Bio-Rad 1610732 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning Life Sciences 430052 To centrifuge 10 mL cultures
Formic acid Sigma-Aldrich 106526 Acid
Glycine Sigma-Aldrich G7126 Amino acid
HMI-9 cell culture medium ThermoFisher Scientific ME110145P1 Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein Stain ThermoFisher Scientific 24615 Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads Echelon Q-B0145-1ml Affinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry Milk Thomas Scientific C837M64 Blocking reagent for Western blotting
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab Rotator Thomas Scientific 1159Z92 For binding assays
LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 13-698-793 Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) Sigma-Aldrich 21-3277 Detergent
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010031 Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescence ThermoFisher Scientific 32106 Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4906845001 Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP Beads Echelon P-B003a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP Beads Echelon P-B034a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8 Echelon P-3908-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP Beads Echelon P-B345a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP Beads Echelon P-B035a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP Beads Echelon P-B004a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8 Echelon P-4508-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP Beads Echelon P-B045a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP Beads Echelon P-B005a-1ml Affinity chromatography reagent 
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 702587 Potassium salt 
PtdIns PIP Beads Echelon P-B001-1ml Affinity chromatography reagent 
PVDF Membrane Bio-Rad 1620177 For Western blotting 
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5910 R Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 862010 Detergent
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 72049 Chemical 
SpeedVac Vacuum Concentrators ThermoFisher Scientific SPD120-115 Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture  ThermoFisher Scientific 159910 To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry Grade Promega V5280 Trypsin for protein digestion
Urea Sigma-Aldrich U5128 Denaturing reagent
Vortex Fisher Scientific 02-215-418 For mixing reactions
Western blotting transfer buffer Bio-Rad 1610734 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paper Sigma-Aldrich WHA3030861 Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M) Bio-Rad 1610710 Reducing agent
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561094 Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Protein loading buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
  2. Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D. A role for nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate kinase in transcriptional control. Science. 287 (5460), 2026-2029 (2000).
  3. Cestari, I., McLeland-Wieser, H., Stuart, K. Nuclear Phosphatidylinositol 5-Phosphatase Is Essential for Allelic Exclusion of Variant Surface Glycoprotein Genes in Trypanosomes. Molecular and Cellular Biology. 39 (3), (2019).
  4. Billcliff, P. G., et al. OCRL1 engages with the F-BAR protein pacsin 2 to promote biogenesis of membrane-trafficking intermediates. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 90-107 (2016).
  5. Brochet, M., et al. Phosphoinositide metabolism links cGMP-dependent protein kinase G to essential Ca(2)(+) signals at key decision points in the life cycle of malaria parasites. PLoS Biology. 12 (3), 1001806 (2014).
  6. Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Saiardi, A. The signaling role of inositol hexakisphosphate kinases (IP6Ks). Advances in Enzyme Regulation. 51 (1), 74-82 (2011).
  7. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  8. Cestari, I., Anupama, A., Stuart, K. Inositol polyphosphate multikinase regulation of Trypanosoma brucei life stage development. Molecular Biology of the Cell. 29 (9), 1137-1152 (2018).
  9. Bang, S., et al. AMP-activated protein kinase is physiologically regulated by inositol polyphosphate multikinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 616-620 (2012).
  10. Seeds, A. M., Tsui, M. M., Sunu, C., Spana, E. P., York, J. D. Inositol phosphate kinase 2 is required for imaginal disc development in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15660-15665 (2015).
  11. Hamada, K., Miyatake, H., Terauchi, A., Mikoshiba, K. IP3-mediated gating mechanism of the IP3 receptor revealed by mutagenesis and X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4661-4666 (2017).
  12. Watson, P. J., et al. Insights into the activation mechanism of class I HDAC complexes by inositol phosphates. Nature Communications. 7, 11262 (2016).
  13. Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2012).
  14. Irvine, R. F. Nuclear lipid signalling. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (5), 349-360 (2003).
  15. Sobol, M., et al. UBF complexes with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in nucleolar organizer regions regardless of ongoing RNA polymerase I activity. Nucleus. 4 (6), 478-486 (2013).
  16. Nascimbeni, A. C., et al. ER-plasma membrane contact sites contribute to autophagosome biogenesis by regulation of local PI3P synthesis. EMBO Journal. 36 (14), 2018-2033 (2017).
  17. Martin, K. L., Smith, T. K. The myo-inositol-1-phosphate synthase gene is essential in Trypanosoma brucei. Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 983-985 (2005).
  18. Matsu-ura, T., et al. Cytosolic inositol 1,4,5-trisphosphate dynamics during intracellular calcium oscillations in living cells. Journal of Cell Biology. 173 (5), 755-765 (2006).
  19. Blind, R. D., et al. The signaling phospholipid PIP3 creates a new interaction surface on the nuclear receptor SF-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (42), 15054-15059 (2014).
  20. Lin, A., et al. The LINK-A lncRNA interacts with PtdIns(3,4,5)P3 to hyperactivate AKT and confer resistance to AKT inhibitors. Nature Cell Biology. 19 (3), 238-251 (2017).
  21. Steger, D. J., Haswell, E. S., Miller, A. L., Wente, S. R., O'Shea, E. K. Regulation of chromatin remodeling by inositol polyphosphates. Science. 299 (5603), 114-116 (2003).
  22. York, J. D., Odom, A. R., Murphy, R., Ives, E. B., Wente, S. R. A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for efficient messenger RNA export. Science. 285 (5424), 96-100 (1999).
  23. Adams, R. L., Mason, A. C., Glass, L., Aditi,, Wente, S. R. Nup42 and IP6 coordinate Gle1 stimulation of Dbp5/DDX19B for mRNA export in yeast and human cells. Traffic. 18 (12), 776-790 (2017).
  24. Macbeth, M. R., et al. Inositol hexakisphosphate is bound in the ADAR2 core and required for RNA editing. Science. 309 (5740), 1534-1539 (2005).
  25. Dickson, E. J., Hille, B. Understanding phosphoinositides: rare, dynamic, and essential membrane phospholipids. Biochemical Journal. 476 (1), 1-23 (2019).
  26. Mellman, D. L., et al. A PtdIns4,5P2-regulated nuclear poly(A) polymerase controls expression of select mRNAs. Nature. 451 (7181), 1013-1017 (2008).
  27. Lee, Y. S., Mulugu, S., York, J. D., O'Shea, E. K. Regulation of a cyclin-CDK-CDK inhibitor complex by inositol pyrophosphates. Science. 316 (5821), 109-112 (2007).
  28. Nagy, A. I., et al. IP3 signalling regulates exogenous RNAi in Caenorhabditis elegans. EMBO Reports. 16 (3), 341-350 (2015).
  29. Hall, B. S., et al. TbVps34, the trypanosome orthologue of Vps34, is required for Golgi complex segregation. Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27600-27612 (2006).
  30. Rodgers, M. J., Albanesi, J. P., Phillips, M. A. Phosphatidylinositol 4-kinase III-beta is required for Golgi maintenance and cytokinesis in Trypanosoma brucei. Eukaryotic Cell. 6 (7), 1108-1118 (2007).
  31. Gilden, J. K., et al. The role of the PI(3,5)P2 kinase TbFab1 in endo/lysosomal trafficking in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 214, 52-61 (2017).
  32. Demmel, L., et al. The endocytic activity of the flagellar pocket in Trypanosoma brucei is regulated by an adjacent phosphatidylinositol phosphate kinase. Journal of Cell Science. 129 (11), 2285 (2016).
  33. Gimenez, A. M., et al. Phosphatidylinositol kinase activities in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology. 203 (1-2), 14-24 (2015).
  34. Hashimoto, M., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor regulates replication, differentiation, infectivity and virulence of the parasitic protist Trypanosoma cruzi. Molecular Microbiology. 87 (6), 1133-1150 (2013).
  35. Cestari, I., Haas, P., Moretti, N. S., Schenkman, S., Stuart, K. Chemogenetic Characterization of Inositol Phosphate Metabolic Pathway Reveals Druggable Enzymes for Targeting Kinetoplastid Parasites. Cell Chemical Biology. 23 (5), 608-617 (2016).
  36. Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. Journal of Biological Chemistry. 277 (29), 25870-25876 (2002).
  37. McNamara, C. W., et al. Targeting Plasmodium PI(4)K to eliminate malaria. Nature. 504 (7479), 248-253 (2013).
  38. Tresaugues, L., et al. Structural basis for phosphoinositide substrate recognition, catalysis, and membrane interactions in human inositol polyphosphate 5-phosphatases. Structure. 22 (5), 744-755 (2014).
  39. Varnai, P., et al. Quantifying lipid changes in various membrane compartments using lipid binding protein domains. Cell Calcium. 64, 72-82 (2017).
  40. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Letters. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  41. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains--their role in signalling and membrane trafficking. Current Biology. 11 (21), 882-893 (2001).
  42. Klarlund, J. K., et al. Signaling by phosphoinositide-3,4,5-trisphosphate through proteins containing pleckstrin and Sec7 homology domains. Science. 275 (5308), 1927-1930 (1997).
  43. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  44. Gerasimaite, R., et al. Inositol Pyrophosphate Specificity of the SPX-Dependent Polyphosphate Polymerase VTC. ACS Chemical Biology. 12 (3), 648-653 (2017).
  45. Potapenko, E., et al. 5-Diphosphoinositol pentakisphosphate (5-IP7) regulates phosphate release from acidocalcisomes and yeast vacuoles. Journal of Biological Chemistry. 293 (49), 19101-19112 (2018).
  46. Wu, M., Chong, L. S., Perlman, D. H., Resnick, A. C., Fiedler, D. Inositol polyphosphates intersect with signaling and metabolic networks via two distinct mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6757-6765 (2016).
  47. Jungmichel, S., et al. Specificity and commonality of the phosphoinositide-binding proteome analyzed by quantitative mass spectrometry. Cell Reports. 6 (3), 578-591 (2014).
  48. Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137 (1), 99-109 (2009).
  49. Cestari, I., Stuart, K. Transcriptional Regulation of Telomeric Expression Sites and Antigenic Variation in Trypanosomes. Current Genomics. 19 (2), 119-132 (2018).
  50. Clough, T., Thaminy, S., Ragg, S., Aebersold, R., Vitek, O. Statistical protein quantification and significance analysis in label-free LC-MS experiments with complex designs. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 6 (2012).
  51. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  52. DeGrasse, J. A., Chait, B. T., Field, M. C., Rout, M. P. High-yield isolation and subcellular proteomic characterization of nuclear and subnuclear structures from trypanosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 77-92 (2008).
  53. Opperdoes, F. R. A rapid method for the isolation of intact glycosomes from Trypanosoma brucei by Percoll -gradient centrifugation in a vertical rotor. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (3), 181-186 (1981).
  54. Pereira, N. M., de Souza, W., Machado, R. D., de Castro, F. T. Isolation and properties of flagella of trypanosomatids. The Journal of protozoology. 24 (4), 511-514 (1977).
  55. Subota, I., et al. Proteomic analysis of intact flagella of procyclic Trypanosoma brucei cells identifies novel flagellar proteins with unique sub-localization and dynamics. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (7), 1769-1786 (2014).
  56. Fukuda, M., Kojima, T., Kabayama, H., Mikoshiba, K. Mutation of the pleckstrin homology domain of Bruton's tyrosine kinase in immunodeficiency impaired inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate binding capacity. Journal of Biological Chemistry. 271 (48), 30303-30306 (1996).
  57. Knodler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. BioTechniques. 38 (6), (2005).
  58. Best, M. D. Global approaches for the elucidation of phosphoinositide-binding proteins. Chemistry and Physics of Lipids. 182, 19-28 (2014).

Tags

Denne måneden i JoVE Inositol fosfater phosphatidylinositol fosfoinositid protein interaksjon Trypanosoma metabolitter masse massespektrometri vestlig blotting affinitet kromatografi
Identifisering av Inositol fosfat eller Fosfoinositid samspill proteiner av affinitet kromatografi koplet til Western Blot eller Mass massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cestari, I. Identification of… More

Cestari, I. Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (149), e59865, doi:10.3791/59865 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter