Summary
Her præsenterer vi en protokol til at generere høj kvalitet, storstilet transkriptomer data af enkeltceller fra isolerede menneskelige pancreas Holme ved hjælp af en dråbe baseret mikrofluidisk enkelt celle RNA sekventering teknologi.
Abstract
Pancreasøer består af endokrine celler med karakteristiske hormon udtryks mønstre. De endokrine celler viser funktionelle forskelle som reaktion på normale og patologiske tilstande. Målet med denne protokol er at generere høj kvalitet, storstilet transkriptomer data for hver endokrine celletype med brug af en dråbe baseret mikrofluidisk enkelt celle RNA sekventering teknologi. Sådanne data kan udnyttes til at opbygge genekspressions profilen for hver endokrine celletype under normale eller specifikke forhold. Processen kræver omhyggelig håndtering, nøjagtig måling og streng kvalitetskontrol. I denne protokol beskriver vi detaljerede trin for humane pancreasislets dissociation, sekvensering og dataanalyse. De repræsentative resultater af ca. 20.000 humane enkelt-ø-celler viser, at protokollen er blevet gennemført korrekt.
Introduction
Pancreasislets frigive endokrine hormoner til at regulere blodsukkerniveauet. Fem endokrine celletyper, der adskiller sig funktionelt og morfologisk, er involveret i denne væsentlige rolle: α-celler producerer Glucagon, β-celler insulin, δ-celler somatostatin, PP celler Pankreatisk polypeptid, og ε-celler Ghrelin1. Genekspression profilering er en nyttig metode til at karakterisere de endokrine celler under normale eller specifikke forhold. Historisk set blev hele øen gen Expression profilering genereret ved hjælp af microarray og næste generations RNA-sekvensering2,3,4,5,6,7 , 8. selv om hele øen transkriptomet er informativt at identificere de orgel-specifikke udskrifter og sygdoms kandidat gener, det undlader at afdække den molekylære heterogenitet af hver ø celletype. Laser opsamling microdissection (LCM) teknik er blevet anvendt til direkte at opnå specifikke celletyper fra Holme9,10,11,12 , men falder kort af renhed af den målrettede celle Befolkning. For at overvinde disse begrænsninger er der anvendt fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) til at udvælge specifikke endokrine cellepopulationer, såsom α-og β-celler13,14,15,16 , 17 , 18. Desuden anvendte dorrell et al. en antistof-baseret FACS sortering tilgang til at klassificere β-celler i fire delpopulationer19. FACS-sorteret ø-celler kan også være belagt til RNA-sekvensering af enkeltceller; men de plade baserede metoder står over for udfordringer i skalerbarhed20,21,22.
For at generere høj kvalitet, storstilet transkriptomer data for hver endokrine celletype, vi anvendt mikrofluidisk teknologi til menneskelige ø-celler. Den mikrofluidisk platform genererer transkriptomer data fra et stort antal enkeltceller i en høj gennemløb, høj kvalitet, og skalerbar måde23,24,25,26,27. Ud over at afsløre molekylære karakteristika for en celletype, der er fanget i en stor mængde, muliggør yderst skalerbar mikrofluidisk-platform identifikation af sjældne celletyper, når der er nok celler til rådighed. Derfor, anvendelse af platformen til menneskelige pancreas Holme tilladt profilering af Ghrelin-secernerende ε-celler, en sjælden endokrine celletype med lidt kendt funktion på grund af sin knaphed28. I de seneste år er flere undersøgelser blevet offentliggjort af os og andre rapporterer store transkriptomer data af menneskelige Holme ved hjælp af teknologien29,30,31,32, 33. Dataene er offentligt tilgængelige og nyttige ressourcer for den ø samfund til at studere endokrine celle heterogenitet og dens konsekvenser i sygdomme.
Her beskriver vi en dråbe baseret mikrofluidic enkelt celle-RNA-sekvente Rings protokol, som er blevet brugt til at fremstille transkriptomdata på ca. 20.000 humane ø-celler, herunder α-, β-, δ-, PP-, ε-celler og en mindre del af ikke-endokrine celler 32. arbejdsprocessen starter med isolerede menneskelige Holme og skildrer trin af ø-celle dissociation, enkelt celle opsamling og dataanalyse. Protokollen kræver brug af frisk isolerede Holme og kan anvendes til Holme fra mennesker og andre arter, såsom gnavere. Ved hjælp af denne arbejdsgang, upartisk og omfattende ø-celle Atlas under baseline og andre betingelser kan bygges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. den menneskelige ø dissociation
- Opnå menneskelige øer isoleret fra Kadaver organdonorer af enten køn, aldre mellem 15-80 år, uden præ-eksisterende sygdomme, medmindre Holme fra donorer med specifik demografi er nødvendige for undersøgelsens formål.
- Efter isolation, har de isolerede Holme holdes i vævskultur facilitet for 2-3 dage hos leverandøren. Det tager ofte mere end 1 dag for Islet skader at blive synlige.
- Placer Holme i en flaske og nedsænk den helt i den ø-medium. Få det til laboratoriet ved overnight forsendelse.
- Få den ø-ækvivalente mængde (iEQ) af de leverede Holme fra den ø-leverandør.
- Recover Holme fra forsendelsen på dagen for Islet ankomst. Udfør dette trin ved hjælp af en hætte for at minimere risikoen for kontaminering.
- Afkøle hele øen medier (CMRL-1066, 10% (v/v) FBS, 1x pen-STREP, 2 mM glutamin) i et køleskab.
- Overfør Holme fra flasken til et 50 ml konisk rør.
- Tilsæt 10 mL forkølet komplet ø-medie til den tømte flaske for at skylle de resterende Holme ud. Overfør mediet til det koniske rør.
- Centrifuger røret ved 200 x g i 2 min for at genvinde Holme. Aspirer supernatanten forlader omkring 1-2 mL medier med pellet.
- Resuspender Holme med forkølet komplette ø-medier. Baseret på IEQ leveret af leverandøren, tilsættes 12 mL medier pr 5000 IEQ.
- Hæld Holme i medierne på en 10 cm ikke-behandlet vævskultur skål. Inkubér natten over i en vævs kulturinkubator ved 37 °C med 5% CO2 i atmosfærisk luft.
- Dissociere Holme som vist nedenfor. Udfør dette trin efter natten inkubation.
- Præ-varm komplet ø-medie og celle dissociations løsning.
- Forbered 1x PBS indeholdende 0,04% BSA ved stuetemperatur.
- Tæl og håndplukkede 200-300 Holme ved hjælp af en P200 pipette og Overfør Holme til et 15 ml konisk rør, der indeholder 5 ml forvarmet komplet ø-medie.
- Øletterne opsamles ved centrifugering ved 200 x g i 2 minutter. forsigtigt Aspirér supernatanten uden at forstyrre pellet på bunden.
- Tilsæt 1,0 mL forvarmet celle dissociations opløsning og forstyrre pellet ved pipettering forsigtigt op og ned. Inkubatislets ved 37 °C i 9-11 min. Hver 3 minutters pipette op og ned langsomt i 10 s for at adskille cellerne i enkeltceller.
- Når ø-cellerne er godt dissocierede, og opløsningen bliver uklar, tilsættes 9 mL komplette ø-medier og filtreres gennem en 30 μm-celle-si i et nyt 15 mL konisk rør.
- Vask røret og celle sien med 2 mL komplette ø-medier for at samle de resterende Holme og tilføje til det samme rør.
- Saml cellerne ved centrifugering ved 400 x g i 5 min.
- Aspirér forsigtigt mediet og resuspender celle pellet i 5 mL 1x PBS indeholdende 0,04% BSA (PBS-BSA).
- Filtrer gennem et nyt 30 μm-cellefilter i et 15 mL konisk rør og centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter for at indsamle celler.
- Aspirér supernatanten og resuspension celle pellet i 200-300 μL 1x PBS-BSA opløsning.
- Mål celle koncentrationen, og Juster lydstyrken til en endelig koncentration på 400-500 celler/μL.
2. kvalitetskontrol af enkelt celle affjedring
- Bestem celle koncentrationen ved hjælp af en fluorescens-baseret automatiseret celle tæller34.
- Bland 10 μL celler med 0,5 μL AO/DAPI. Pipetten blandes grundigt. Indlæs 10,5 μL på diaset, og Kør celletal-analysen for at bestemme antal og levedygtighed.
- Fortynde og/eller Filtrer cellesuspensionen som nødvendigt baseret på celletal.
3. enkelt celle partitionering ved hjælp af en mikrofluidisk chip. Følg protokol fra mikrofluidisk chip producent35.
- Bring 3 ' gel perler og reverse transkription (RT) reagenser til stuetemperatur (> 30 min). Rekonstruere RT primer i TE buffer, hvis det er nødvendigt.
- Forbered RT Master Mix i en lav binde slange som beskrevet i tabel 1.
- Bestem antallet af celler, der skal indgå i hver prøve. Beregn den celle affjedrings volumen (X), som er nødvendig for at levere det ønskede målcelle nummer. Den beregnede mængde nuklease frit vand, der skal tilsættes til hver prøve, vil være 33,8-X μL.
- For hver prøve, der skal partitioneres, tilsættes 33,8-X μL nuclease frit vand til 0,2 mL PCR Strip tube. Tilsæt derefter 66,2 μL Master Mix til hver Strip tube. Tilsæt ikke cellerne til Strip røret på dette tidspunkt. Pipetten forsigtigt for at blande. Placer de forberedte strimrør på is.
- Anbring en mikrofluidisk-chip i en spån kasse. Drej spån etuiet for at sikre, at oliebrønde (række mærket 3) er tættest på den person, der udfører eksperimentet.
- Hvis der kører mindre end 8 prøver, skal du bruge 50% glycerol til at fylde ubrugte kanaler i følgende rækkefølge:
- Tilsæt 90 μL 50% glycerol i brøndene i række 1 for alle ubrugte kanaler.
- Tilsæt 40 μL 50% glycerol i brøndene i række 2 for alle ubrugte kanaler.
- Tilsæt 270 μL 50% glycerol i brøndene i række 3 for alle ubrugte kanaler.
- Fastgør gelperlerne i en hvirvel. Vortex ved fuld hastighed for 30 s. Tryk på strimlen på bænk toppen flere gange for at samle perler. Bekræft, at der ikke er nogen bobler til stede.
- Tilsæt X μL af cellerne i de forberedte strimrør. Pipette til at blande 5 gange. Uden at kassere pipette spidserne skal du overføre 90 μL celle blanding til række 1 i chippen.
- Vent 30 s, og indlæs derefter 40 μL gel perler i række 2. Pipetten meget langsomt for dette trin. 270 μL af partitioneringsolien dispenserer til brøndene i række 3.
- Sæt chip pakningen på spån holderens faner. Placer den monterede chip holder i enkelt celle partitioneringsenheden, og tryk på knappen Kør.
- Fjern straks den monterede chip holder ved køre færdiggørelse.
- Fjern chip pakningen fra holderen, Åbn spån etuiet i en vinkel på 45 °, og fjern 100 μL af emulsionen fra chippen til en blå plastik 96-brønd plade.
4. cDNA-forstærkning med enkelt celle. Følg protokol fra mikrofluidisk chip producent35.
- Omvendt transskription.
Bemærk: Udfør dette trin under en ren PCR-only hætte for at forhindre mikrobiel og anden kontaminering af det uforstærkede cDNA.- Forsegl 96-Well Blue Plate med en folie forsegling på en opvarmet plade forsegler.
- Kør den omvendte transskription reaktion i en termisk variator som følger: 53 °c for 45 min à 85 °c i 5 min à 4 °c hold.
Bemærk: Dette er et sikkert stoppunkt. Prøverne kan holde på 4 °C i op til 72 h.
- Rensning efter RT
- Bring nukleinsyre bindende magnetiske perler og nukleinsyre størrelse udvælgelse magnetiske perler til stuetemperatur og vortex at re-suspendere. På dette tidspunkt tø prøve oprydnings bufferen i 10 min ved 65 °C. Bring alle andre reagenser til stuetemperatur og vortex.
- Forbered bufferne som vist i tabel 2 og tabel 3.
- Kemisk bryde emulsionen og rense.
- For at gøre dette skal du forsigtigt fjerne folie forseglingen fra pladen.
- Dispensere 125 μL lyserød emulsions brydende reagens i hver emulsion. Vent 1 min, og overfør derefter hele volumenet til en ren 0,2 mL Strip tube. Sørg for, at der er et lag af klare og et lag af pink i Strip røret.
- Fjern 125 μL af det lyserøde lag fra bunden af Strip røret uden at forstyrre det klare lag. Det er normalt, at et lille volumen (~ 15 μL) af det lyserøde lag forbliver i røret.
- Tilsæt 200 μL oprydnings blanding fra tabel 2 til Strip røret og Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Overfør Strip røret til et magnetisk stativ og lad opløsningen klare. Fjern supernatanten og kassér, og vask derefter perlerne med 80% ethanol to gange. Lad perlerne tørre i 1 min.
- Fjern Strip røret fra magneten, og tilsæt 35,5 μL elueringsopløsning fra tabel 3 til perlerne. Pipette til at resuspendere perlerne i opløsningen. Inkuber i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Overfør Strip røret til et magnetisk stativ og lad opløsningen klare. Fjern det rensede cDNA fra Strip røret og rengør det for at rengøre 0,2 mL Strip rør.
- Amplificere cDNA.
- Forbered forstærknings Master Mix i tabel 4nedenfor.
- Tilsæt 65 μL cDNA Amplifikationmaster mix til hver prøve. Placer Strip røret i en termisk variator og Kør følgende program: 98 °c 3 min à 15 cyklusser af [98 °c 15 s à 67 °c 20 s à 72 °c 1 min] à 72 °c 5 min à 4 °c hold
Bemærk: Dette er et sikkert stoppunkt. Prøverne kan holde på 4 °C i op til 72 h. - Rense den forstærkede cDNA med 0,6 x nukleinsyre størrelse udvælgelse magnetiske perler. Vask to gange med 80% ethanol og elut med 40,5 μL.
- Kør kvalitetskontrol cDNA ved hjælp af automatiseret gel elektroforese og fluorescens baseret DNA-kvantificerings analyse36,37.
Bemærk: Dette er et sikkert stoppunkt. Prøverne kan holde på 4 °C i op til 72 h eller ved-20 °C på ubestemt tid.
5. opførelse af sekvensering bibliotek
- Tagmentation og oprydning af cDNA38.
- Normaliserer cDNA til 50 ng i 20 μL af det totale volumen. Nøjagtig kvantitation er kritisk i dette trin.
- Tagmentation blandingen i tabel 5 og alikvot 30 μl til hver 20 μl cDNA-prøve på is. Sæt prøverne i den termiske variator og Kør tagmenterings protokollen: 55 °c 5 min à 10 °c hold.
- Udfør oprydning af tagede cDNA ved hjælp af kolonne38. Tilsæt 180 μL DNA-bindings buffer til hver prøve. Overfør 230 μL til en spin kolonne.
- Centrifuge ved 1300 x g i 2 min. og kassér gennemstrømningen.
- Vask to gange med 300 μL DNA-vaskebuffer. Centrifuger yderligere 2 min ved 1300 x g for at sikre fjernelse af ethanol.
- Elute renset, tageret cDNA ved tilsætning af 31 μL elueringsbuffer til søjlen og Inkubér ved stuetemperatur i 2 min.
- Centrifuge i 2 min ved 1300 x g for at genvinde det rensede produkt.
- Sample index PCR.
- Vælg stregkoder, der ikke overlapper under et multiplexed sekvensering-løb.
- Foretag et prøve indeks PCR Master Mix som vist i tabel 6.
- Tilsæt 60 μL prøve indeks PCR Master Mix til 30 μL af den oprensede prøve.
- Der tilsættes 10 μL af et 20 μM, 4-oligo-prøve indeks til hver prøve (det anvendte plade indeks). Den totale reaktions volumen er nu 100 μL.
- Placer i en termisk variator med låget sat til 105 °c. Kør følgende program: 98 °C 45 s à 12-14 cyklusser af [98 °C 20 s à 54 °C 30 s à 72 °C 20 s] à 72 °C 1 min à 4 °C hold.
Bemærk: Dette er et sikkert stoppunkt. Prøverne kan holde på 4 °C i op til 72 h.
- Rense biblioteker med dobbelt perle rydde op.
- Tilsæt 100 μL nukleinsyre størrelses udvælgelse magnetiske perler til prøven og bland grundigt med en pipette. Inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter.
- Overfør til en magnet og lad den stå, indtil opløsningen ryddes. Fjern og kassér supernatanten.
- Vask to gange med 200 μL 80% ethanol.
- Tør perlerne på magneten i 2 min. Fjern fra magneten og tilsæt 50,5 μL EB-buffer til perle pellet. Pipetten igen for at suspendere perlerne i bufferen.
- Inkuber ved stuetemperatur i 2 min. Overfør til en magnet og lad stå i 2 min. Overfør 50 μL elueret prøve til en ren strimmel slange.
- Tilsæt 40 μL nukleinsyre størrelses udvælgelse magnetiske perler til prøven og Inkuber ved stuetemperatur i 5 min. Overfør til en magnet og lad opløsningen klare. Fjern og kassér supernatanten.
- Vask to gange med 125 μL 80% ethanol.
- Tør perlerne på magneten i 2 min. Fjern fra magneten og tilsæt 60,5 μL EB-buffer til perle pellet. Pipetten igen for at suspendere perlerne i bufferen.
- Inkuber ved stuetemperatur i 2 min. Overfør til en magnet og lad den stå i 2 min. Overfør 50 μL elueret prøve til en ren strimmel slange. Dette er det sidste bibliotek.
- Hold prøverne ved 4 °C i op til 72 h eller ved-20 °C på ubestemt tid. Bemærk, at dette er et sikkert stoppunkt.
- Kvantificere og køre kvalitetskontrol af de endelige biblioteker ved hjælp af automatiseret gel elektroforese og fluorescens baseret DNA-kvantificerings analyse36,37. Fortynder prøverne 1:10 inden kontrol af kvalitetskontrollen.
6. Biblioteks sekvensering
- Normaliser hver prøve for at blive sekventieret til 2 ng/μL og pulje 3 μL af hver normaliseret prøve sammen.
- Måle poolkoncentrationen med fluorescens baseret DNA-kvantificerings analyse37.
- Bassinet fortyndes til 0,25 ng/μL.
- Denature puljen som følger: 12 μL fortyndet poolet prøve (0,25 ng/μL) + 1 μL DNA-kontrol (1 nM), 2 μL EB buffer + 5 μL NaOH (0,4 N). Lad dette inkubere i 5 min, og tilsæt derefter 10 μL 200 mM Tris pH 8,0.
- Indlæs 4,05 μL i 1345,95 μL HT1. Indlæs 1,3 mL i sequenzerens patron og Kør i henhold til producentens retningslinjer39 ved hjælp af en sekvensering opskrift med 26 cyklusser (Læs 1) + 8 cyklusser (i7 index) + 0 cyklusser (i5 index) + 55 cyklusser (Læs 2).
7. læse justering (supplerende fil 1)
- Kør Cell Ranger (v 2.0.0) til Demultiplex RAW base Call (BCL) filer genereret af sekvensering i FASTQ filer. Justér FASTQ-filer til human B 37.3 Genome assembly og UCSC gen model for at opnå ekspressions kvantificering.
- Justering kvalitetskontrol.
- Generer justerings metrik, og kontroller Q30 baser, gyldig stregkode fraktion, celle associeret læse brøk, kortlagt læse brøk og læsninger, der er registreret i hver celle.
- Undersøg stregkoden rang plot for at sikre adskillelsen af de celle-associerede stregkoder og baggrunden.
8. data analyse (supplerende fil 2)
- Celle kvalitetskontrol og forbehandling.
- Udelad celler med < 500 fundne gener, < 3000 totalt antal unikke molekyle-id'er (UMI), > 0,2 levedygtig score som tidligere beskrevet32. Juster cutoffs efter vævs-og celletyper.
- Fjern doublets.
- Vurder de fem endokrine hormon gener (Glucagon- GCG, insulin- ins, somatostatin- SST, Pankreatisk polypeptid- PPYog ghrelin- ghrl) for bimodale udtryks mønster (høj-og lavudtryks tilstand) ved hjælp af R pakken mclust40.
- Fjerne celler, der udtrykker mere end ét hormon gen, dvs, med to eller flere hormon gener i High-Expression mode.
- Normaliserer genekspression med den totale UMI og multipliceres med skalaen faktor 10.000 på celleniveau ved hjælp af R-pakken Seurat41.
- Fjerne gener detekteret i mindre end 3 celler.
- Detektér variable gener ved hjælp af gennemsnitlig ekspression og dispersion af alle celler. Juster cutoffs i henhold til vævs-og celle typerne.
- Udfør den primære komponent analyse med de variable gener. Klynge celler med det valgte antal hovedkomponenter. Udlede celle-klynge beriget gener ved at sammenligne en celle klynge med resten af cellerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enkelt cellens RNA-sekvensering består af tre trin: dissociering af intakte humane Holme i enkelt cellesuspension, opsamling af enkeltceller ved hjælp af en dråbe baseret teknologi og analyse af RNA-SEQ-data (figur 1). For det første blev de erhvervede menneskelige Holme inkuberet natten over. De intakte Holme blev undersøgt under mikroskop (figur 2a). Integriteten af dissocierede ø-celler er blevet valideret ved anvendelse af RNA-fluorescens in situ-hybridisering (RNA-fisk). Som vist i figur 2bblev dissocierede α-og β-celler visualiseret ved hjælp af henholdsvis GCG og ins mRNA-sonder.
Celletal og levedygtighed skal bestemmes før single-celle Capture trin. Celler med lav levedygtighed eller høj snavs er ikke egnet til videre forarbejdning. En god celle koncentration spænder normalt fra 400 til 500 celler/μL. ca. 6000 celler blev indlæst til den mikrofluidiske chip i enkelt celle partitioneringstrinnet, og 100 μL gel perler i emulsion blev fjernet fra chippen. Figur 3a eksemplificerer et vellykket eksempel på emulsion efter partitioneringstrinnet. Væsken i hver pipettespidser er ensartet bleg overskyet med minimal partitioneringsolie adskilt fra gelperlerne. I modsætning hertil viser figur 3b en emulsion af dårlig kvalitet med klar faseadskillelse mellem gelperler og olie. Dette kunne være på grund af en tilstoppe under chip Run.
Efter en enkelt celle opdeling blev cDNA-amplifikation udført. Figur 4a illustrerer en repræsentativ fragment størrelsesfordeling efter cDNA-forstærkning. Den typiske top for en god kvalitet cDNA prøve opholdt sig nær 1000-2000 BP. interessant, en Spike nær 600 BP var specifik for Islet cDNA. Fordelingen af Fragmentets størrelsesfordeling på RNA-SEQ-bibliotekerne var mellem 300 og 500 BP (figur 4b).
Efter sekvensering anvendte vi et sæt læse justerings målinger til at evaluere enkelt cellernes RNA-SEQ-datakvalitet (tabel 7). De første tre Metrics godt opsummeret enkelt-celle sekvensering Biblioteks kvalitet. I gennemsnit var 92% af aflæsninger afledt af intakte celler, og 72% af aflæsninger blev overlagt til exons. Ud af alle exon læsninger fanget i dråber, 90% af dem blev produceret af intakte celler og resten var sandsynligvis omgivende RNAs i celle-fri dråber. Disse justerings målinger tyder på god datakvalitet. Forholdet mellem exon læsninger og UMI var en empirisk måling for at evaluere sekvensering mætning og normalt, 10:1 ratio var en god indikator. Desuden var antallet af fundne gener (UMI > 0) en nyttig funktion til at karakterisere forskellige celletyper. For humane ø-celler er antallet af fundne gener ca. 1.900 i hver celle.
Vi sekvenserede i alt 20.811 ø-celler fra 12 ikke-diabetiske donorer. Udtryk for mere end et hormon blev påvist i omkring 6% af cellerne. Disse multi-hormonelle celler er sandsynligvis form fordi vores tidligere arbejde viste, at mindre end < 0,1% af enkelt ø-celler Co-udtrykt mere end én endokrine hormon33. Vi fjernede alle de identificerede multi hormonelle celler. Det er også vigtigt at udelukke lav-kvalitet celler baseret på total UMI, detekterede gener, og cellelevedygtighed33. Efter disse kvalitetskontrol trin forblev 19.174 til yderligere analyse. Klyngedannelse analyse afslørede 12 celletyper: α-, β-, δ-, PP, ε-celler, acinar, ductal, latent stellate, aktiveret stellate, Endothelial, macrophage og mastceller (figur 5). Som forventet var de endokrine celler hovedparten (tabel 8). De mest berigede gener i α-celler (dvs. GCG, TTR, CRYBA2, TM4SF4, TMEM176B) og β-celler (dvs. IAPP, ins, hadh, DLK1, RBP4) er i overensstemmelse med andre studie13,15,16,17,18,20,21,22,29 ,30,31,33. Interessant nok bestod både α-og β-celler af flere delpopulationer. Tre β-celle subpopulationer, beta sub1, 2, og 3, var ens med et lille antal subpopulation-beriget gener (18 i beta sub1, 33 i beta sub 2, og 18 i beta sub 3). Den fjerde delpopulation havde 488 berigede gener. Den lille α-celle delpopulation (Alpha sub3) bestod af prolifererende celler, karakteriseret ved beriget udtryk for MKI67, CDK1og TOP2A.
Figur 1: skematisk diagram over workflow for enkeltcellet RNA-sekvensering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative billeder af intakte og dissocierede humane øer. A) et billede af Holme taget efter natten inkubation. B) dissocierede ø-celler visualiseret ved farvning af RNA-fisk for ins (hvid) og GCG (rød). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: undersøgelse af kvaliteten af enkelt celle emulsion før omskrivning. A) en enkelt celle emulsion af god kvalitet. Væsken i hver pipettespids var homogent uklar. B) en enkelt celle emulsion af dårlig kvalitet. Væsken i pipettespidsen var ikke homogen og viste adskillelse mellem olie og gel perler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: undersøgelse af kvaliteten af enkelt celle-cDNA og-bibliotek. A) et repræsentativt cDNA-spor. Denne cDNA var af god kvalitet og udbytte, med hovedtoppen for prøven forekommer i nærheden af 1000-2000 BP. Spidsen i sporet omkring 600 BP var typisk og karakteristisk for Islet cDNA. (B) et repræsentativt endeligt sekvensering bibliotek spor. Dette bibliotek var af god kvalitet og udbytte, med den største peak forekommer mellem 300-500 BP. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: celletyper og delpopulationer identificeret i enkelt celle-RNA-sekvensering af humane pancreasøer. Celler blev grupperet efter karakteristiske celletyper i rummet af t-distribueret stokastisk nabo indlejring (tSNE) dimensioner. Analysen afslørede også tre delpopulationer i α-celler og fire i β-celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagensnavn | Vol. til brug (μL) pr. reaktion |
| RT reagens blanding | 50 |
| RT primer | 3,8 |
| Additiv A | 2,4 |
| RT-enzym blanding | 10 |
| Samlede | 66,2 |
Tabel 1: omvendt transskriptmix.
| Reagensnavn | Volumen til brug (uL) pr. reaktion |
| Nuklease frit vand | 9 |
| Buffer prøve oprydning 1 | 182 |
| Dynabeads MyOne SILANE | 4 |
| Additiv A | 5 |
| Samlede | 200 |
Tabel 2: oprydning mix.
| Reagensnavn | Volumen til brug (uL) pr. reaktion |
| Buffer EB | 98 |
| 10% Tween 20 | 1 |
| Additiv A | 1 |
| Samlede | 100 |
Tabel 3: Elueringsopløsning.
| Reagensnavn | Volumen til brug (uL) pr. reaktion |
| Nuklease frit vand | 8 |
| Forstærknings Master Mix | 50 |
| cDNA-additiv | 5 |
| cDNA primer mix | 2 |
| Samlede | 65 |
Tabel 4: cDNA-amplifikationmix.
| Reagensnavn | Volumen til brug (μL) pr. reaktion |
| Tagmentation enzym | 5 |
| Tagmentation buffer | 25 |
| Samlede | 30 |
Tabel 5: Tagmentation mix.
| Reagensnavn | Volumen til brug (μL) pr. reaktion |
| Nuklease frit vand | 8 |
| Forstærknings Master Mix | 50 |
| SI-PCR primer | 2 |
| Samlede | 60 |
Tabel 6: prøve indeks PCR Master mix.
| Eksempel-ID | % Læser med gyldige Cellestreg koder | % Exon læser i erobrede celler blandt total celler | % Exon læser blandt de samlede læsninger | Mean exon læser pr. celle | Median UMI pr. celle | Median gener pr. celle |
| Prøve-1 | 92% | 93% | 76% | 142.015 | 10.310 | 1.747 |
| Prøve-2 | 92% | 91% | 74% | 151.395 | 11.350 | 1.754 |
| Prøve-3 | 94% | 92% | 75% | 120.538 | 19.604 | 2.180 |
| Prøve-4 | 95% | 93% | 67% | 160.657 | 11.870 | 2.111 |
| Prøve-5 | 94% | 92% | 62% | 177.809 | 13.821 | 2.288 |
| Prøve-6 | 95% | 89% | 67% | 138.208 | 8.235 | 1.296 |
| Prøve-7 | 94% | 89% | 72% | 147.484 | 13.606 | 2.272 |
| Prøve-8 | 94% | 91% | 69% | 159.793 | 9.505 | 1.865 |
| Prøve-9 | 95% | 92% | 72% | 168.436 | 12.794 | 2.389 |
| Prøve-10 | 83% | 83% | 74% | 88.067 | 13.323 | 1.805 |
| Prøve-11 | 82% | 88% | 77% | 67.752 | 9.295 | 1.278 |
| Prøve-12 | 91% | 85% | 74% | 194.781 | 14.877 | 1.746 |
Tabel 7: Læs justerings metrik.
| Celletype | Antal celler | Ave. celler pr. donor (standardafvigelse) |
| Alpha | 6546 | 546 (258) |
| Beta | 7361 | 613 (252) |
| Delta | 922 | 77 (37) |
| S | 545 | 45 (25) |
| Epsilon | 11 | 1, stk. 1 |
| Acinic | 836 | 70 (71) |
| Duktalt | 1313 | 109 (95) |
| Quiescent stellate | 225 | 19 (14) |
| Aktiveret stellate | 890 | 74 (58) |
| Endotel | 408 | 34 (21) |
| Makrofag | 80 | 7, stk. 6 |
| Schwann | 37 | 3, stk. 3 |
Tabel 8: celletype sammensætning. Det samlede antal celler for hver celletype og de gennemsnitlige celler for hver donor i hver celletype.
Supplerende fil 1: kommandoer, der bruges til sekvens justering. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: R scripts til at udføre celle kvalitetskontrol, celle klyngedannelse, og til at identificere celle-type beriget gener. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Single-celle teknologier udviklet i de seneste år giver en ny platform til at karakterisere celletyper og studere Molekylær heterogenitet i humane bugspytkirtel Holme. Vi vedtog en protokol af droplet-baseret mikrofluidisk enkelt celle isolation og dataanalyse for at studere menneskelige Holme. Vores protokol har med succes produceret RNA-sekvensering af data fra over 20.000 enkelt menneskelige ø-celler med relativt små variationer i sekvens kvalitet og batch effekter.
Især er to trin afgørende i denne protokol for resultater af høj kvalitet. Der skal udvises forsigtighed ved dissociering af humane øer. Det er vigtigt ikke at over fordøje ølets. Enkeltcellepartitionering er et andet vigtigt trin for et vellykket eksperiment med en enkelt celle. Vi viste eksempler på god-og dårlig kvalitet emulsioner i figur 3. En klar emulsion er normalt en indikation af utilstrækkeligt antal celler, der opsamles i partitioneringstrinnet.
Adgangen til isolerede primære menneskelige Holme er et sats begrænsende skridt til at generere store menneskelige ø enkelt celle transkriptomer. Isolerede Holme fra individuelle Kadaver donorer behandles normalt på forskellige tidspunkter, og derfor bør potentielle stikprøve afhængige batch effekter undersøges nøje under dataanalyse. Integrativ analyse kan bruges til at identificere almindelige celletyper og delpopulationer på tværs af individuelle batches41. Batch effekten kan også justeres ved batch korrigeret udtryks kvantificering42. En anden udfordring at analysere enkelt celle-RNA-SEQ-data er at identificere doublets. I data forbehandling, vi tog foranstaltninger til at fjerne endokrine form ved at identificere celler, som udtrykker flere hormon gener (GCG, ins, SST, PPY, og ghrl). Identifikation af form dannet af to forskellige celletyper er en forholdsvis let opgave på grund af den ekstremt høje ekspression af endokrine hormoner. Den virkelige udfordring er at identificere in-Cell-type form, f. eks, form med to α-celler. Fordi højere UMI og højere antal detekterede gener er suggestive af potentielle doublets, en løsning er at fjerne afvigende med et højt antal gener og UMI under cellen QC trin. Derudover er værktøjer til at detektere form tilgængelige43,44,45.
En væsentlig begrænsning af enkeltcellerna-sekvensering er lav følsomhed. Ved hjælp af Spike-in eksterne RNA Controls Consortium (ERCC) RNAs, vurderede vi, at kun 10% af alle udtrykte gener blev detekteret ved hjælp af den nuværende protokol, og at detekterede dem var forudindtaget mod høje overflod gener46. Bugspytkirtel endokrine celler udtrykker ekstremt højt niveau af hormon gener (dvs., GCG, ins, SST, og PPY). Som et resultat, mRNAs af disse gener har risiko for at blive omgivende RNA. Sådanne baggrundslyde kan ikke helt undgås. Men, denne trin-for-trin-protokol vil hjælpe forskerne med at minimere uønskede eksperimentelle lyde. Den nuværende protokol er designet til frisk isoleret væv. Andre teknologier, såsom single-Nucleus RNA sekvensering47,48, er tilgængelige for RNA-SEQ af fersk, frosset eller let fast væv. Derudover kan en nyligt udviklet celle hashing-teknologi49 betragtes som en avanceret mikrofluidisk-enkelt celle protokol, der gør det muligt at prøve multiplexing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere er medarbejdere og aktionærer i Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
References
- Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
- Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552 (2012).
- Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
- Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
- Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
- Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
- Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
- van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694 (2015).
- Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499 (2010).
- Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
- Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
- Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
- Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
- Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
- Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
- Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
- Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
- Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
- Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
- Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
- Chemometec. Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
- 10X Genomics. 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , 10X Genomics. (2017).
- Agilent Technologies. Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , Agilent Technologies. (2013).
- Thermo Fischer Scientific. Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , Thermo Fischer Scientific. (2015).
- Illumina. Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , Illumina. (2016).
- Illumina. llumina NextSeq 500 System Guide. , Illumina. (2018).
- Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
- DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
- McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
- Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
