Summary
Ici, nous présentons un protocole pour produire des données de transcriptome de haute qualité et à grande échelle des cellules simples des îlots pancréatiques humains isolés utilisant une technologie microfluidique de séquençage d'ARN à base de gouttelettes.
Abstract
Les îlots pancréatiques se composent de cellules endocriniennes avec des modèles distinctifs d'expression d'hormone. Les cellules endocriniennes montrent des différences fonctionnelles en réponse à des conditions normales et pathologiques. L'objectif de ce protocole est de générer des données de transcriptome de haute qualité à grande échelle de chaque type de cellules endocriniennes à l'utilisation d'une technologie de séquençage microfluidique à base de gouttelettes à une seule cellule. Ces données peuvent être utilisées pour établir le profil d'expression génique de chaque type de cellule endocrinienne dans des conditions normales ou spécifiques. Le processus nécessite une manipulation minutieuse, une mesure précise et un contrôle rigoureux de la qualité. Dans ce protocole, nous décrivons des étapes détaillées pour la dissociation, le séquençage, et l'analyse de données des îlots pancréatiques humains. Les résultats représentatifs d'environ 20 000 cellules d'îlet sinispeules humaines démontrent l'application réussie du protocole.
Introduction
Les îlots pancréatiques libèrent des hormones endocriniennes pour réguler les niveaux de glucose dans le sang. Cinq types de cellules endocriniennes, qui diffèrent fonctionnellement et morphologiquement, sont impliqués dans ce rôle essentiel : les cellules de l'apo, produisent du glucagon, de l'insuline des cellules, de la somatostatine des cellules PP, du polypeptide pancréatique et de la ghrélinedescellules de l'apo 1. Le profilage de l'expression génique est une approche utile pour caractériser les cellules endocriniennes dans des conditions normales ou spécifiques. Historiquement, l'ensemble du profilage de l'expression génique des îaux a été généré à l'aide du microréseau et du séquençage de l'ARN de nouvelle génération2,3,4,5,6,7 , 8. Bien que le transcriptome entier d'îtte soit instructif pour identifier les transcriptions d'organe-spécifiques et les gènes candidats de maladie, il ne découvre pas l'hétérogénéité moléculaire de chaque type de cellule d'îtal. La technique de microdissection de capture de laser (LCM) a été appliquée pour obtenir directement des types de cellules spécifiques des îlots9,10,11,12 mais manque la pureté de la cellule visée population. Pour surmonter ces limitations, le tri cellulaire activé par la fluorescence (FACS) a été utilisé pour sélectionner des populations de cellules endocriniennes spécifiques, telles que les cellules de l'aétée et des cellules13,14,15,16 , 17 Annonces , 18. De plus, Dorrell et coll. ont utilisé une approche de tri FACS à base d'anticorps pour classer les cellules de l'A en quatre sous-populations19. Les cellules d'échafaudaise fac-triées de FACS peuvent également être plaquées pour le séquençage d'ARN des cellules simples ; cependant, les méthodes à base de plaques font face à des défis dans l'évolutivité20,21,22.
Pour générer des données de transcriptome de haute qualité et à grande échelle de chaque type de cellule endocrinienne, nous avons appliqué la technologie microfluidique aux cellules humaines d'isfle. La plate-forme microfluidique génère des données de transcriptome à partir d'un grand nombre de cellules individuelles dans un haut débit, de haute qualité, et de manière évolutive23,24,25,26,27. En plus de révéler les caractéristiques moléculaires d'un type de cellule capturée en grande quantité, plate-forme microfluidique hautement évolutive permet d'identifier les types de cellules rares lorsque suffisamment de cellules sont fournies. Par conséquent, l'application de la plate-forme aux îlots pancréatiques humains a permis le profilage des cellules de la ghréline-sécrétion, un type de cellules endocriniennes rares avec la fonction peu connue due à sa rareté28. Ces dernières années, plusieurs études ont été publiées par nous et d'autres rapportant des données de transcriptome à grande échelle des îlots humains utilisant la technologie29,30,31,32, 33. Les données sont accessibles au public et des ressources utiles pour la communauté des îîaux pour étudier l'hétérogénéité des cellules endocriniennes et son implication dans les maladies.
Ici, nous décrivons un protocole de séquençage microfluidique à base de gouttelettes d'ARN unicellulaire, qui a été utilisé pour produire des données de transcriptome d'environ 20 000 cellules d'isfle-d'œil humain, y compris des cellules d'isflement, y compris des cellules non endocriniens, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniens, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non en 32. Le flux de travail commence par des îlots humains isolés et représente des étapes de dissociation des cellules des îlots, de capture d'une seule cellule et d'analyse des données. Le protocole exige l'utilisation d'îlots fraîchement isolés et peut être appliqué aux îlots de l'homme et d'autres espèces, comme les rongeurs. À l'aide de ce flux de travail, un atlas de cellules d'islet impartial et complet dans des conditions de référence et d'autres conditions peut être construit.
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Protocol
1. Dissociation des islets humains
- Obtenir des îlots humains isolés chez les donneurs d'organes de cadavre de l'un ou l'autre sexe, âgés entre 15 et 80 ans, sans maladies préexistantes, à moins que des îlots de donneurs ayant des données démographiques spécifiques ne soient nécessaires aux fins de l'étude.
- Après l'isolement, faire garder les îlots isolés dans l'installation de culture tissulaire pendant 2-3 jours chez le fournisseur. Il faut souvent plus d'un jour pour que les dommages causés par les islets deviennent visibles.
- Placer les îlots dans une bouteille et les immerger complètement dans le milieu de l'îlots. Acquiez-le au laboratoire par expédition de nuit.
- Obtenir la quantité équivalente d'îlots (IEQ) des îlots expédiés auprès du fournisseur d'îlots.
- Récupérer les îlots de l'expédition le jour de l'arrivée de l'îlots. Effectuez cette étape à l'aide d'une hotte pour minimiser les risques de contamination.
- Refroidir le support complet des îaux (CMRL-1066, 10% (v/v) FBS, 1x Pen-Strep, 2 mM de glutamine) dans un réfrigérateur.
- Transférer les îlots de la bouteille dans un tube conique de 50 ml.
- Ajouter 10 ml de support d'îlots complet sépuld s'est pré-réfrigéré dans la bouteille vidée pour laver les îlots restants. Transférer les supports dans le tube conique.
- Centrifuger le tube à 200 x g pendant 2 min pour récupérer les îlots. Aspirez le supernatant en laissant environ 1-2 ml de support avec la pastille.
- Resuspendre les îlots avec des supports d'îlots complets pré-réfrigérés. Sur la base de l'IEQ fourni par le fournisseur, ajouter 12 mL de support par 5000 IEQ.
- Verser les îlots dans les médias sur un plat de culture tissulaire non traité de 10 cm. Incuber toute la nuit dans un incubateur de culture tissulaire à 37 oC avec 5 % de CO2 dans l'air atmosphérique.
- Dissocier les îlots comme indiqué ci-dessous. Effectuez cette étape après l'incubation de nuit.
- Pré-chaud complète des médias d'islette et solution de dissociation cellulaire.
- Préparer 1x PBS contenant 0,04% de BSA à température ambiante.
- Comptez et choisissez à la main 200-300 îlots à l'aide d'une pipette P200 et transférez les îlots dans un tube conique de 15 ml contenant un support d'îlots complet préréchauffé de 5 ml.
- Recueillir les îlots par centrifugation à 200 x g pendant 2 min. Aspirez doucement le supernatant sans déranger la boulette sur le fond.
- Ajouter une solution de dissociation cellulaire préréchauffée de 1,0 ml et perturber la pastille en tirant doucement vers le haut et vers le bas. Incuber les îlots à 37 oC pendant 9-11 min. Toutes les 3 min pipette de haut en bas lentement pendant 10 s pour dissocier les cellules en cellules simples.
- Une fois que les cellules des îîaux sont bien dissociées et que la solution devient trouble, ajouter 9 ml de milieu complet des îaux et filtrer à travers une passoire cellulaire de 30 m dans un nouveau tube conique de 15 ml.
- Laver le tube et la passoire cellulaire avec 2 ml de support d'îlots complets pour recueillir les îlots restants et ajouter au même tube.
- Recueillir les cellules par centrifugation à 400 x g pendant 5 min.
- Aspirez doucement les supports et suspendez la pastille cellulaire en 5 mL 1x PBS contenant 0,04 % de BSA (PBS-BSA).
- Filtrer à travers une nouvelle passoire cellulaire de 30 m dans un tube conique de 15 ml et une centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min pour recueillir les cellules.
- Aspirez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire dans la solution PBS-BSA de 200 à 300 l 1x.
- Mesurer la concentration cellulaire et ajuster le volume à une concentration finale de 400 à 500 cellules/L.
2. Contrôle de la qualité de la suspension à cellule unique
- Déterminer la concentration cellulaire à l'aide d'un compteur cellulaire automatisé à base de fluorescence34.
- Mélanger 10 cellules ll avec 0,5 L AO/DAPI. Pipette bien mélanger. Chargez 10,5 L sur la glissière et exécutez l'essai de comptage cellulaire pour déterminer le nombre et la viabilité.
- Diluer et/ou filtrer la suspension cellulaire au besoin en fonction du nombre de cellules.
3. Partitionnement à cellule unique à l'aide d'une puce microfluidique. Suivez le protocole du fabricant de puces microfluidiques35.
- Apportez des perles de gel de 3' et des réactifs de transcription inversée (RT) à la température ambiante (à la température de la pièce( '30 min). Reconstituez l'amorce RT dans le tampon TE si nécessaire.
- Préparer le mélange principal RT dans un tube de liaison bas tel qu'indiqué dans le tableau 1.
- Déterminer le nombre de cellules à entrer pour chaque échantillon. Calculez le volume de suspension cellulaire (X) nécessaire pour fournir le numéro de cellule cible souhaité. Le volume calculé d'eau exempte de nucléane à ajouter à chaque échantillon sera de 33,8 X L.
- Pour que chaque échantillon soit cloisonné, ajouter de l'eau sans nucléane de 33,8 X X dans un tube à bande PCR de 0,2 mL. Ensuite, ajoutez le mélange maître de 66,2 L à chaque tube à bande. Ne pas ajouter les cellules au tube à bande à ce stade. Pipette délicatement à mélanger. Placer les tubes à bande préparés sur la glace.
- Placer une puce microfluidique dans un étui à puce. Orientez le boîtier à puce en veillant à ce que les puits de pétrole (ligne étiqueté e 3) soient les plus proches de la personne qui effectue l'expérience.
- Si vous exécutez moins de 8 échantillons, utilisez 50 % de glycérol pour remplir les canaux inutilisés dans l'ordre suivant :
- Ajouter 90 l de glycérol à 50 % dans les puits dans la rangée 1 pour tous les canaux inutilisés.
- Ajouter 40 l de glycérol à 50 % dans les puits dans la rangée 2 pour tous les canaux inutilisés.
- Ajouter 270 l de glycérol à 50 % dans les puits dans la rangée 3 pour tous les canaux inutilisés.
- Casser les perles de gel dans un vortex. Vortex à pleine vitesse pour 30 s. Appuyez sur la bande sur le dessus du banc à plusieurs reprises pour recueillir des perles. Confirmez qu'il n'y a pas de bulles présentes.
- Ajouter X 'L de cellules dans les tubes à bande préparés. Pipette à mélanger 5 fois. Sans jeter les pointes de pipette, transférer 90 l de mélange cellulaire à la rangée 1 de la puce.
- Attendez 30 s, puis chargez 40 l de perles de gel à la rangée 2. Pipette très lentement pour cette étape. Distribuer 270 l'huile de partitionnement aux puits de la rangée 3.
- Accrochez le joint de puce sur les onglets du support de puce. Placez le support de puce assemblé dans le dispositif de partitionnement à cellule unique et appuyez sur le bouton d'exécution.
- Retirez immédiatement le support de puce assemblé à l'achèvement de l'exécution.
- Retirez le joint de la puce du support, ouvrez le boîtier de la puce à un angle de 45 degrés et retirez 100 lL de l'émulsion de la puce dans une plaque bleue en plastique de 96 puits.
4. Amplification de cDNA de cellules simples. Suivez le protocole du fabricant de puces microfluidiques35.
- Transcription inversée.
REMARQUE : Effectuez cette étape sous une hotte PCR-seulement propre pour empêcher la contamination microbienne et d'autres de l'ADNc non amplifié.- Sceller la plaque bleue de 96 puits avec un joint de papier d'aluminium sur un scellant chauffé.
- Exécuter la réaction de transcription inverse dans un cycleur thermique comme suit : 53 oC pour 45 min à 85 oC pendant 5 min à 4 oC.
REMARQUE : Il s'agit d'un point d'arrêt sécuritaire. Les échantillons peuvent tenir jusqu'à 72 h.
- Purification post-RT
- Apportez les perles magnétiques liant l'acide nucléique et les perles magnétiques de sélection de taille d'acide nucléique à la température ambiante et au vortex pour re-suspendre. À ce stade, décongeler le tampon de nettoyage de l'échantillon pendant 10 min à 65 oC. Amener tous les autres réactifs à la température ambiante et le vortex.
- Préparer les tampons tels qu'indiqués dans les tableaux 2 et 3.
- Casser chimiquement l'émulsion et purifier.
- Pour ce faire, retirer délicatement le joint de papier d'aluminium de l'assiette.
- Distribuer 125 l de réactif rose qui brise l'émulsion dans chaque émulsion. Attendez 1 min, puis transférez le volume entier dans un tube à bande propre de 0,2 ml. Assurez-vous qu'il y a une couche de clair et une couche de rose dans le tube à bande.
- Retirez 125 l de la couche rose du fond du tube à bande sans perturber la couche claire. Il est normal qu'un petit volume (15 l) de la couche rose reste dans le tube.
- Ajouter 200 l de mélange de nettoyage du tableau 2 au tube à bande et couver à température ambiante pendant 10 min.
- Transférer le tube à bande sur un support magnétique et permettre à la solution de se dégager. Retirer le supernatant et jeter, puis laver les perles avec 80% d'éthanol deux fois. Laisser sécher les perles pendant 1 min.
- Retirez le tube à bande de l'aimant et ajoutez 35,5 L de solution d'élution du tableau 3 aux perles. Pipette pour resuspendre les perles dans la solution. Incuber 2 min à température ambiante.
- Transférer le tube à bande sur un support magnétique et permettre à la solution de se dégager. Retirez l'ADNc purifié du tube à bande et distribuez-le pour nettoyer les tubes à bande de 0,2 ml.
- Amplifier l'ADNc.
- Préparer le mix maître d'amplification dans le tableau 4, ci-dessous.
- Ajouter 65 ll de mélange maître d'amplification de l'ADNc à chaque échantillon. Placer le tube à bande dans un cycleur thermique et exécuter le programme suivant : 98 oC 3 min à 15 cycles de [98 oC 15 s à 67 'C 20 s à 72 'C 1 min] à 72 'C 5 min à 4 'C hold
REMARQUE : Il s'agit d'un point d'arrêt sécuritaire. Les échantillons peuvent tenir jusqu'à 72 h. - Purifez l'ADNc amplifié avec 0,6 x de taille d'acide nucléique sélection de perles magnétiques. Laver deux fois avec 80% d'éthanol et éliner avec 40,5 l.
- Exécuter le cDNA de contrôle de la qualité à l'aide d'électrophorèse de gel automatisée et d'analyse de quantitation de l'ADN à base de fluorescence36,37.
REMARQUE : Il s'agit d'un point d'arrêt sécuritaire. Les échantillons peuvent tenir jusqu'à 72 h ou à -20 oC indéfiniment.
5. Séquençage de la construction de la bibliothèque
- Tagmentation et nettoyage de l'ADNc38.
- Normaliser l'ADNc à 50 ng s'insinus dans 20 l du volume total. La quantitation exacte est essentielle dans cette étape.
- Faire le mélange d'étiquettes dans le tableau 5 et l'aliquot 30 L à chaque échantillon de cDNA de 20 l sur la glace. Placez les échantillons dans le cycleur thermique et exécutez le protocole de tagmentation : 55 oC 5 min à 10 oC.
- Effectuer le nettoyage de l'ADNc taguré à l'aide des colonnes38. Ajouter un tampon de liaison d'ADN de 180 L à chaque échantillon. Transférer 230 l dans une colonne de spin.
- Centrifugeuse à 1300 x g pendant 2 min et jetez le flux.
- Laver deux fois avec un tampon de lavage d'ADN de 300 l. Centrifugeuse 2 min de plus à 1300 x g pour assurer l'élimination de l'éthanol.
- Elute purifié cdna tagmented en ajoutant 31 L de tampon d'élution à la colonne et incuber à température ambiante pendant 2 min.
- Centrifugeuse pendant 2 min à 1300 x g pour récupérer le produit purifié.
- Exemple d'index PCR.
- Choisissez des codes-barres qui ne se chevauchent pas lors d'une exécution de séquençage multiplexée.
- Faire un mélange maître d'indice d'échantillon PCR comme indiqué dans le tableau 6.
- Ajouter 60 ll de mix principal PCR de l'indice d'échantillon à 30 oL de l'échantillon purifié.
- Ajouter 10 l d'un indice d'échantillon de 20 M, 4 oligo à chaque échantillon (indice d'enregistrement utilisé). Le volume total de réaction est maintenant de 100 l.
- Placer dans un cycleur thermique avec le couvercle réglé à 105 oC. Exécuter le programme suivant : 98 oC 45 s à 12-14 cycles de [98 'C 20 s à 54 'C 30 s à 72 'C 20 s] à 72 'C 1 min à 4 'C hold.
REMARQUE : Il s'agit d'un point d'arrêt sécuritaire. Les échantillons peuvent tenir jusqu'à 72 h.
- Purifie les bibliothèques avec double perle nettoyer.
- Ajouter 100 l de perles magnétiques de sélection d'acide nucléique à l'échantillon et bien mélanger avec une pipette. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Transférer sur un aimant et laisser reposer jusqu'à ce que la solution se dégage. Retirez et jetez le supernatant.
- Laver deux fois avec 200 l d'éthanol à 80 %.
- Séchez les perles sur l'aimant pendant 2 min. Retirez l'aimant et ajoutez 50,5 l de tampon EB à la pastille de perles. Pipette pour suspendre à nouveau les perles dans le tampon.
- Incuber à température ambiante pendant 2 min. Transférer sur un aimant et laisser reposer 2 min. Transférer 50 ll d'échantillon élucidé dans un tube à bande propre.
- Ajouter des perles magnétiques de sélection de taille d'acide nucléique de 40 l l à l'échantillon et couver à température ambiante pendant 5 min. Transférer à un aimant et laisser la solution claire. Retirer et jeter le supernatant.
- Laver deux fois avec 125 l d'éthanol à 80 %.
- Séchez les perles sur l'aimant pendant 2 min. Retirez l'aimant et ajoutez 60,5 l de tampon EB à la pastille de perles. Pipette pour suspendre à nouveau les perles dans le tampon.
- Incuber à température ambiante pendant 2 min. Transférer sur un aimant et laisser reposer 2 min. Transférer 50 ll d'échantillon élucidé dans un tube à bande propre. C'est la dernière bibliothèque.
- Maintenez les échantillons à 4 oC jusqu'à 72 h ou à -20 oC indéfiniment. Notez qu'il s'agit d'un point d'arrêt sûr.
- Quantifier et exécuter le contrôle de la qualité des bibliothèques finales à l'aide de l'électrophorèse automatisée de gel et de l'analyse de quantitation d'ADN basée sur la fluorescence36,37. Diluer les échantillons 1:10 avant d'exécuter le contrôle de la qualité.
6. Séquençage de la bibliothèque
- Normaliser chaque échantillon à séquencer à 2 ng/L et à pool 3 l de chaque échantillon normalisé ensemble.
- Mesurer la concentration en piscine à l'aide d'un test de quantitation de l'ADN à base de fluorescence37.
- Diluer la piscine à 0,25 ng/L.
- Dénaturer le pool comme suit : 12 'L d'échantillon mis en commun dilué (0.25 ng/L) '1 'L de contrôle de l'ADN (1 nM), 2 'L EB Buffer '5 'L NaOH (0.4N). Laisser incuber pendant 5 min, puis ajouter 10 l de 200 mM Tris pH 8.0.
- Chargez 4,05 l en 1345,95 et L HT1. Chargez 1,3 mL dans la cartouche du séquenceur et exécutez selon les directives du fabricant39 à l'aide d'une recette de séquençage avec 26 cycles (Lire 1) - 8 cycles (i7 Index) - 0 cycles (i5 Index) - 55 cycles (Lire 2).
7. Lire l'alignement (Fichier supplémentaire 1)
- Exécutez Cell Ranger (v2.0.0) pour demultiplex fichiers d'appels de base bruts (BCL) générés par le séquençage dans les fichiers FASTQ. Aligner les fichiers FASTQ sur l'assemblage du génome B37.3 humain et le modèle de gène UCSC pour obtenir la quantification de l'expression.
- Contrôle de la qualité de l'alignement.
- Générer des mesures d'alignement et vérifier les bases Q30, fraction de code à barres valide, fraction de lecture associée aux cellules, fraction de lecture cartographiée et lectures détectées dans chaque cellule.
- Examinez la parcelle de classement du code-barres pour vous assurer de la séparation des codes à barres associés à la cellule et de l'arrière-plan.
8. Analyse des données (Fichier supplémentaire 2)
- Contrôle de la qualité cellulaire et prétraitement.
- Exclure les cellules avec 'lt; 500 gènes détectés, 'lt; 3000 nombre total d'identifiant moléculaire unique (UMI), 'gt; 0.2 score de viabilité comme précédemment décrit32. Ajuster les seuils en fonction des tissus et des types de cellules.
- Retirer les doublets.
- Évaluer les cinq gènes de l'hormone endocrinienne (glucagon - GCG, insuline - INS, somatostatine - SST, polypeptide pancréatique - PPY, et ghréline - GHRL) pour le modèle d'expression bimodale (mode haute et basse expression) en utilisant R paquet mclust40.
- Enlever les cellules qui expriment plus d'un gène hormonal, c'est-à-dire avec deux gènes hormonaux ou plus en mode haute expression.
- Normaliser l'expression des gènes par l'UMI total et multiplier par le facteur d'échelle de 10.000 au niveau cellulaire en utilisant le paquet R Seurat41.
- Enlever les gènes détectés dans moins de 3 cellules.
- Détecter les gènes variables en utilisant l'expression moyenne et la dispersion de toutes les cellules. Ajuster les seuils en fonction des tissus et des types de cellules.
- Effectuer l'analyse principale des composants avec les gènes variables. Cellules de cluster avec le nombre sélectionné de composants principaux. Dériver des gènes enrichis en grappes cellulaires en comparant un amas cellulaire avec le reste des cellules.
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Representative Results
Le flux de travail de séquençage de l'ARN à cellule unique se compose de trois étapes : dissocier les îlots humains intacts en suspension à cellule unique, capturer les cellules individuelles à l'aide d'une technologie à base de gouttelettes et analyser les données DE l'ARN-seq (figure 1). Tout d'abord, les îlots humains acquis ont été incubés pendant la nuit. Les îlots intacts ont été examinés au microscope (Figure 2A). L'intégrité des cellules dissociées d'îlet a été validée utilisant l'hybridation in situ de fluorescence d'ARN (RNA-FISH). Comme le montre la figure 2B,les cellules dissociées ont été visualisées à l'aide de sondes GCG et INS, respectivement.
Le nombre et la viabilité des cellules doivent être déterminés avant l'étape de capture d'une seule cellule. Les cellules à faible viabilité ou à haute teneur en débris ne conviennent pas à un traitement ultérieur. Une bonne concentration cellulaire varie habituellement de 400 à 500 cellules/L. Environ 6000 cellules ont été chargées à la puce microfluidique dans l'étape de partitionnement unicellulaire, et 100 l de perles de gel en émulsion ont été retirées de la puce. Figure 3A illustre un exemple réussi d'émulsion après l'étape de partitionnement. Le liquide dans chaque pointe de pipette est pâle uniforme nuageux avec l'huile de cloisonnement minimale séparée des perles de gel. En revanche, la figure 3B montre une émulsion de mauvaise qualité avec une séparation de phase claire entre les perles de gel et l'huile. Cela peut être dû à un sabot pendant la course de jetons.
Après le cloisonnement simple de cellule, l'amplification de cDNA a été exécutée. La figure 4A illustre une distribution représentative de la taille des fragments après amplification de l'ADNc. Le pic typique pour un échantillon d'ADNc de bonne qualité résidait près de 1000-2000 bp. Fait intéressant, un pic près de 600 bp était spécifique à l'aDNc islet. La distribution de la taille des fragments pour les bibliothèques RNA-seq se trouvait entre 300 et 500 pb (figure 4B).
Après le séquençage, nous avons utilisé un ensemble de mesures d'alignement de lecture pour évaluer la qualité des données RNA-seq à cellule unique (tableau 7). Les trois premières mesures ont bien résumé la qualité de la bibliothèque de séquençage unicellulaire. En moyenne, 92 % des lectures provenaient de cellules intactes et 72 % des lectures étaient cartographiées en exons. De toutes les lectures d'exon capturées dans des gouttelettes, 90% d'entre elles ont été produites par des cellules intactes et le reste était probablement DES ARN ambiantes dans des gouttelettes sans cellules. Ces mesures d'alignement suggèrent une bonne qualité des données. Le rapport entre les lectures d'exon et l'IM ÉTAIT une mesure empirique pour évaluer la saturation du séquençage et, habituellement, le ratio 10:1 était un bon indicateur. En outre, le nombre de gènes détectés (UMI 'gt; 0) était une caractéristique utile pour caractériser différents types de cellules. Pour les cellules des îîdres humains, le nombre de gènes détectés est d'environ 1 900 dans chaque cellule.
Nous avons séquencé un total de 20 811 cellules d'élet de 12 donneurs non diabétiques. L'expression de plus d'une hormone a été détectée dans environ 6% des cellules. Ces cellules multi-hormonales sont très probablement des doublets parce que nos travaux précédents ont montré que moins de 'lt; 0.1% des cellules d'islet simples co-exprimé plus d'une hormone endocrinienne33. Nous avons enlevé toutes les cellules multi-hormonales identifiées. Il est également important d'exclure les cellules de mauvaise qualité en fonction de l'IME total, des gènes détectés et de la viabilité cellulaire33. Après ces étapes de contrôle de la qualité, 19 174 sont restés pour une analyse plus approfondie. L'analyse de clustering a indiqué 12 types de cellules : '-, '-, ',, ',' -, '-cellules, acinar, ductal, queescent stellate, endothélial, macrophage, et mastocytes (Figure 5). Comme prévu, les cellules endocriniennes étaient majoritaires (tableau8). Les gènes enrichis les plus en haut dans les cellules de l'I (c.-à-d. GCG, TTR, CRYBA2, TM4SF4, TMEM176B) et les cellules de l'IAPP, del'INS, de la HADH, du DLK1,du RBP4)sont compatibles avec d'autres études13,15,16,17,18,20,21,22,29 ,30,31,33. Fait intéressant, les deux cellules et les cellules de l'adurif se composaient de plusieurs sous-populations. Trois sous-populations de cellules de la cellule , bêta-sous-1, 2 et 3, étaient semblables avec un petit nombre de gènes enrichis par sous-population (18 en bêta-sous-1, 33 en bêta-sous-2 et 18 en bêta-sous-3). La quatrième sous-population avait 488 gènes enrichis. La petite sous-population de cellules d'Alpha (Alpha sub3) comprenait des cellules proliférantes, caractérisées par l'expression enrichie de MKI67, CDK1, et TOP2A.
Figure 1 : Diagramme schématique du flux de travail de séquençage de l'ARN unicellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Images représentatives d'îlots humains intacts et dissociés. (A) Une image d'îlots prises après l'incubation de nuit. (B) Cellules dissociées des înles visualisées par la coloration RNA-FISH pour l'INS (blanc) et le GCG (rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Examen de la qualité de l'émulsion unicellulaire avant la transcription inversée. (A) Une émulsion unicellulaire de bonne qualité. Le liquide dans chaque pointe de pipette était homogènement nuageux. (B) Une émulsion unicellulaire de mauvaise qualité. Le liquide dans la pointe de pipette n'était pas homogène et a montré la séparation entre l'huile et les perles de gel. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Examen de la qualité de l'ADNc unicellulaire et de la bibliothèque. (A) Un représentant cDNA traces. Cet ADNc était de bonne qualité et de rendement, avec le pic principal pour l'échantillon se produisant près de 1000-2000 bp. Le pic dans la trace autour de 600 bp était typique et distinctif de l'ADN cdna d'înçat. (B) Une trace représentative de la bibliothèque de séquençage final. Cette bibliothèque était de bonne qualité et le rendement, avec le pic principal se produisant entre 300-500 bp. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Types de cellules et sous-populations identifiées dans le séquençage de l'ARN unicellulaire des îlots pancréatiques humains. Les cellules ont été regroupées par types de cellules distinctifs dans l'espace des dimensions d'intégration stochastique de voisin t-distribué (tSNE). L'analyse a également révélé trois sous-populations dans les cellules de l'aïe et quatre dans les cellules de l'A. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Nom du réactif | Vol. à utiliser (L) par réaction |
| Mix réactif RT | 50 Annonces |
| Apprêt RT | 3,8 Annonces |
| Additif A | 2,4 |
| MIX ENzymatique RT | 10 Ans et plus |
| total | 66,2 Annonces |
Tableau 1 : Mix de transcription inversé.
| Nom du réactif | Volume à utiliser (uL) par réaction |
| Eau sans nucléane | 9 (en) |
| Nettoyage de l'échantillon tampon 1 | En 182, états-unis qui ont été |
| Dynabeads MyOne Silane | 4 ( en plus) |
| Additif A | 5 Annonces |
| total | 200 Ans et plus |
Tableau 2 : Mélange de nettoyage.
| Nom du réactif | Volume à utiliser (uL) par réaction |
| Tampon EB | 98 Annonces |
| 10% Entre120 | 1 Fois |
| Additif A | 1 Fois |
| total | 100 ans |
Tableau 3 : Solution d'élution.
| Nom du réactif | Volume à utiliser (uL) par réaction |
| Eau sans nucléane | 8 Annonces |
| Mix Maître amplification | 50 Annonces |
| cDNA Additif | 5 Annonces |
| cDNA Primer Mix | 2 (en) |
| total | 65 Annonces |
Tableau 4 : mélange d'amplification de l'ADNc.
| Nom du réactif | Volume à utiliser (L) par réaction |
| Enzyme Tagmentation | 5 Annonces |
| Tampon de tagmentation | 25 Annonces |
| total | 30 Ans, états-unis ( |
Tableau 5 : Mélange de tagmentation.
| Nom du réactif | Volume à utiliser (L) par réaction |
| Eau sans nucléane | 8 Annonces |
| Mix Maître amplification | 50 Annonces |
| Amorce SI-PCR | 2 (en) |
| total | 60 Annonces |
Tableau 6 : Mélange principal pcR d'indice d'échantillon.
| ID d'échantillon | % lit avec des codes-barres cellulaires valides | % Exon lit dans les cellules capturées parmi les cellules totales | % Exon lit parmi les lectures totales | Moyenne Exon Lit par cellule | UMI médian par cellule | Gènes médians par cellule |
| Échantillon-1 | 92% | 93% | 76% | 142 015 | 10 310 | 1 747 |
| Échantillon-2 | 92% | 91% | 74 % | 151 395 | 11 350 | 1 754 |
| Échantillon-3 | 94 % | 92% | 75% | 120 538 | 19 604 Annonces | 2 180 |
| Échantillon-4 | 95% | 93% | 67 % | 160 657 | 11 870 | 2 111 |
| Échantillon-5 | 94 % | 92% | 62% | 177 809 | 13 821 | 2 288 |
| Échantillon-6 | 95% | 89% | 67 % | 138 208 | 8 235 | 1 296 |
| Échantillon-7 | 94 % | 89% | 72% | 147 484 | 13 606 | 2 272 |
| Échantillon-8 | 94 % | 91% | 69% | 159 793 | 9 505 | 1 865 |
| Échantillon-9 | 95% | 92% | 72% | 168 436 | 12 794 | 2 389 |
| Échantillon-10 | 83% | 83% | 74 % | 88 067 | 13 323 | 1 805 Annonces |
| Échantillon-11 | 82% | 88% | 77% | 67 752 | 9 295 | 1 278 |
| Échantillon-12 | 91% | 85% | 74 % | 194 781 | 14 877 | 1 746 |
Tableau 7 : Lire les mesures d'alignement.
| Type de cellule | Nombre de cellules | Cellules de l'ave. par donneur (déviation standard) |
| Alpha | 6546 Annonces | 546 (258) |
| Bêta | 7361 Annonces | 613 (252) |
| delta | 922, états-unis | 77 (37) |
| Pp | 545 Annonces | 45 (25) |
| Epsilon | 11 Ans, états-unis ( | 1 (1) |
| Acinar Acinar | 836 Annonces | 70 (71) |
| Canalaire | En 1313, | 109 (95) |
| Stellate quiescente | 225 Annonces | 19 (14) |
| Stellate activé | 890 Annonces | 74 (58) |
| Endothéliales | Le 408, en a été à eux ( | 34 (21) |
| Macrophage | 80 Ans, états-unis ( | 7 (6) |
| Schwann | 37 Ans, états-unis ( | 3 (3) |
Tableau 8 : Composition de type cellulaire. Nombre total de cellules pour chaque type de cellule et cellules moyennes pour chaque donneur dans chaque type de cellule.
Fichier supplémentaire 1 : Commandes utilisées pour l'alignement de séquence. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 2 : Scripts R pour effectuer le contrôle de la qualité cellulaire, le regroupement cellulaire et l'identification des gènes enrichis de type cellulaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Les technologies unicellulaires développées ces dernières années fournissent une nouvelle plate-forme pour caractériser les types de cellules et étudier l'hétérogénéité moléculaire dans les îlots pancréatiques humains. Nous avons adopté un protocole d'isolement microfluidique à base de gouttelettes unicellulaire et d'analyse de données pour étudier les îlots humains. Notre protocole a produit avec succès des données de séquençage de l'ARN à partir de plus de 20 000 cellules d'ists humains uniques avec des variations relativement faibles de la qualité de la séquence et des effets de lots.
En particulier, deux étapes sont essentielles dans ce protocole pour des résultats de haute qualité. La prudence est de mise lors de la dissociation des îlots humains. Il est important de ne pas surdigérer les îlots. Le cloisonnement à cellule unique est une autre étape clé pour une expérience à cellule unique réussie. Nous avons démontré des exemples d'émulsions de bonne et de mauvaise qualité à la figure 3. Une émulsion claire est généralement un indicateur du nombre insuffisant de cellules recueillies dans l'étape de partitionnement.
L'accès à des îlots humains primaires isolés est une étape limitant le taux pour générer des transcriptomes à cellule unique à grande échelle. Les îlots isolés des donneurs de cadavres individuels sont habituellement traités à des moments différents, de ce fait que les effets potentiels des lots dépendants de l'échantillon devraient être soigneusement examinés lors de l'analyse des données. L'analyse intégrative peut être utilisée pour identifier les types de cellules et les sous-populations communes entre les lots individuels41. L'effet de lot peut également être ajusté par quantification d'expression corrigée par lots42. Un autre défi pour analyser les données rna-seq unicellulaires est d'identifier les doublets. Dans le prétraitement des données, nous avons pris des mesures pour éliminer les doublets endocriniens en identifiant les cellules exprimant plusieurs gènes hormonaux(GCG, INS, SST, PPY, et GHRL). L'identification des doublets formés par deux types de cellules différents est une tâche relativement facile en raison de l'expression extrêmement élevée des hormones endocriniennes. Le véritable défi consiste à identifier les doublets de type cellulaire, par exemple les doublets par deux cellules. Étant donné que l'UMI plus élevé et le nombre plus élevé de gènes détectés sont suggestifs de doublets potentiels, une solution est d'enlever les valeurs aberrantes avec un nombre élevé de gènes et d'IMAu cours de l'étape DE QC cellulaire. En outre, des outils pour détecter les doublets sont disponibles43,44,45.
Une limitation majeure du séquençage d'ARN unicellulaire est la faible sensibilité. À l'aide d'ARN du Consortium externe de contrôle de l'ARN (ERCC), nous avons estimé que seulement 10 % de tous les gènes exprimés ont été détectés à l'aide du protocole actuel et que ceux détectés étaient biaisés vers des gènes à forte abondance46. Les cellules endocriniennes pancréatiques expriment un niveau extrêmement élevé de gènes hormonaux (c.-à-d. GCG, INS, SST, et PPY). En conséquence, les ARNm de ces gènes ont le risque de devenir de l'ARN ambiant. De tels bruits de fond ne peuvent pas être entièrement évités. Cependant, ce protocole étape par étape aidera les chercheurs à minimiser les bruits expérimentaux indésirables. Le protocole actuel est conçu pour les tissus fraîchement isolés. D'autres technologies, telles que le séquençage de l'ARN à un seul noyau47,48, sont disponibles pour l'ARN-seq de tissus frais, congelés ou légèrement fixes. En outre, une technologie de houtage cellulaire récemment développée49 peut être considérée comme un protocole microfluidique avancé à cellule unique permettant le multiplexage de l'échantillon.
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Disclosures
Tous les auteurs sont des employés et des actionnaires de Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Acknowledgments
aucun
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
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