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Genetics

एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण और मानव अग्नाशय Islets का विश्लेषण

Published: July 18, 2019 doi: 10.3791/59866
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Regeneron Pharmaceuticals, Inc

Summary

यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए उच्च गुणवत्ता उत्पन्न, अलग मानव अग्नाशय islets से एकल कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर transcriptome डेटा एक छोटी बूंद आधारित microfluidic एकल सेल आरएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकी का उपयोग कर.

Abstract

अग्नाशयी आइलेट्स विशिष्ट हार्मोन अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ अंत: स्रावी कोशिकाओं के शामिल. अंत: स्रावी कोशिकाओं सामान्य और रोग की स्थिति के जवाब में कार्यात्मक मतभेद दिखा. इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक छोटी बूंद आधारित microfluidic एकल सेल आरएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के उपयोग के साथ प्रत्येक अंत: स्रावी सेल प्रकार के उच्च गुणवत्ता, बड़े पैमाने पर ट्रांसक्रिप्टम डेटा उत्पन्न करने के लिए है। इस तरह के डेटा सामान्य या विशिष्ट स्थितियों में प्रत्येक अंत: स्रावी सेल प्रकार के जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल का निर्माण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. प्रक्रिया सावधान से निपटने, सटीक माप, और कठोर गुणवत्ता नियंत्रण की आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल में, हम मानव अग्नाशय islets dissociation, अनुक्रमण, और डेटा विश्लेषण के लिए विस्तृत कदम का वर्णन. के बारे में 20,000 मानव एकल islet कोशिकाओं के प्रतिनिधि परिणाम प्रोटोकॉल के सफल आवेदन प्रदर्शित करते हैं.

Introduction

अग्नाशयी आइलेट्स रक्त शर्करा के स्तर को विनियमित करने के लिए अंत: स्रावी हार्मोन जारी करते हैं। पांच अंत: स्रावी सेल प्रकार, जो कार्यात्मक और आकृति विज्ञान के रूप में भिन्न होते हैं, इस आवश्यक भूमिका में शामिल होते हैं: जेड-कोशिकाएं ग्लूकागन काउत्पादन करती हैं, जेड-कोशिकाएं इंसुलिन, जेड-सेल सोमेटोस्टेटिन, पीपी कोशिकाओं अग्नाशयी पॉलीपेप्टाइड, और जेड-सेल ghrelin 1. जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा सामान्य या विशिष्ट स्थितियों में अंत: स्रावी कोशिकाओं की विशेषता के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण है। ऐतिहासिक रूप से, पूरे islet जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा microarray और अगली पीढ़ी के आरएनए अनुक्रमण2,3,4,5,6,7 का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था , 8.हालांकि पूरे आइलेट ट्रांसक्रिप्टम अंग-विशिष्ट ट्रांसक्रिप्ट्स और रोग उम्मीदवार जीन की पहचान करने के लिए जानकारीपूर्ण है, यह प्रत्येक आइलेट सेल प्रकार की आणविक विषमता को उजागर करने में विफल रहता है। लेजर कब्जा microdissection (LCM) तकनीक islets से सीधे विशिष्ट सेल प्रकार प्राप्त करने के लिए लागू किया गया है9,10,11,12 लेकिन लक्षित सेल की शुद्धता की कमी हो जाती है जनसंख्या. इन सीमाओं को दूर करने के लिए, फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग विशिष्ट अंत: स्रावी कोशिका आबादियों का चयन करने के लिए किया गया है, जैसे कि $- और जेड-कोशिकाओं13,14,15,16 , 17 , 18इसके अलावा, Dorrell एट अल एक एंटीबॉडी आधारित FACS छँटाई दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया चार subpopulations19में $ कोशिकाओं को वर्गीकृत करने के लिए 19 . FACS-sorted islet कोशिकाओं को भी एकल कोशिकाओं के आरएनए अनुक्रमण के लिए चढ़ाया जा सकता है; तथापि, प्लेट आधारित विधियों में मापनीयता20,21,22में चुनौतियों का सामना करना पड़ता है।

उच्च गुणवत्ता उत्पन्न करने के लिए, प्रत्येक अंत: स्रावी सेल प्रकार के बड़े पैमाने पर transcriptome डेटा, हम मानव आइलेट कोशिकाओं के लिए microfluidic प्रौद्योगिकी लागू किया. माइक्रोफ्लूइडिक मंच एक उच्च-थ्रूपुट, उच्च गुणवत्ता वाले, और स्केलेबल तरीके से23,24,25,26,27में बड़ी संख्या में एकल कोशिकाओं से ट्रांसक्रिडम डेटा उत्पन्न करता है। एक बड़ी मात्रा में कब्जा कर लिया एक सेल प्रकार की आणविक विशेषताओं का खुलासा करने के अलावा, उच्च स्केलेबल microfluidic मंच दुर्लभ सेल प्रकार की पहचान जब पर्याप्त कोशिकाओं प्रदान कर रहे हैं सक्षम बनाता है. इसलिए, मानव अग्नाशय islets के लिए मंच के आवेदन ghrelin-secreting -कोशिकाओं की रूपरेखा की अनुमति दी, इसकी कमी28के कारण थोड़ा ज्ञात समारोह के साथ एक दुर्लभ अंत: स्रावी सेल प्रकार. हाल के वर्षों में, कई अध्ययन हमारे द्वारा प्रकाशित किया गया है और दूसरों को प्रौद्योगिकी का उपयोग कर मानव islets के बड़े पैमाने पर ट्रांसक्रिम डेटा रिपोर्टिंग29,30,31,32, 33. डेटा सार्वजनिक रूप से उपलब्ध है और इस्लेट समुदाय के लिए उपयोगी संसाधनों endocrine सेल विषमता और रोगों में इसके निहितार्थ का अध्ययन कर रहे हैं.

यहाँ, हम एक छोटी बूंद-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग लगभग 20,000 मानव आइलेट कोशिकाओं के ट्रांसक्रिम डेटा का उत्पादन करने के लिए किया गया है, जिसमें जेड-, जेड-, पीपी, जेड-सेल, और गैर-एंडोक्रिन कोशिकाओं का एक छोटा अनुपात शामिल है। 32.कार्यप्रवाह पृथक मानव आइलेट्स से प्रारंभ होता है और आइलेट सेल वियोजन, एकल-कक्ष कैप्चर, और डेटा विश्लेषण के चरणों को दर्शाया जाता है. प्रोटोकॉल ताजा अलग islets के उपयोग की आवश्यकता है और इस तरह के कृन्तकों के रूप में मनुष्य और अन्य प्रजातियों से islets के लिए लागू किया जा सकता है। इस कार्यप्रवाह का उपयोग करते हुए, आधारभूत और अन्य स्थितियों के अंतर्गत निष्पक्ष और व्यापक islet सेल एटलस बनाया जा सकता है।

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Protocol

1. मानव वियोजन

  1. या तो सेक्स के शव अंग दाताओं से अलग मानव islets प्राप्त, 15-80 साल के बीच की उम्र, पूर्व मौजूदा रोगों के बिना जब तक विशिष्ट जनसांख्यिकी के साथ दाताओं से islets अध्ययन उद्देश्य के लिए आवश्यक हैं.
    1. अलगाव के बाद, अलग islets आपूर्तिकर्ता पर 2-3 दिनों के लिए ऊतक संस्कृति सुविधा में रखा है. आइलेट के नुकसान के लिए अक्सर 1 दिन से अधिक समय लगता है दिखाई देने के लिए.
    2. एक बोतल में islets प्लेस और यह पूरी तरह से आइलेट माध्यम में विसर्जित कर दिया. यह रात भर लदान द्वारा प्रयोगशाला के लिए जाओ.
    3. islet आपूर्तिकर्ता से भेज दिया islets के आइक्यू बराबर मात्रा (IEQ) प्राप्त करें।
  2. आइलेट आगमन के दिन लदान से islets पुनर्प्राप्त करें। संदूषण की संभावना को कम करने के लिए एक हुड का उपयोग कर इस कदम को प्रदर्शन.
    1. एक रेफ्रिजरेटर में पूरा islet मीडिया (CMRL-1066, 10% (v/v) FBS, 1x पेन-स्ट्रेप, 2 एमएम glutamine) शांत।
    2. बोतल से islets एक 50 एमएल शंकु ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
    3. शेष आइलेट्स को धोने के लिए खाली बोतल में 10 एमएल प्री-कूल्ड पूरा आइलेट मीडिया जोड़ें। मीडिया को शंकु नली में स्थानांतरित करें.
    4. आइलेट्स को ठीक करने के लिए 2 मिनट के लिए ट्यूब को 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। गोली के साथ 1-2 एमएल मीडिया के बारे में छोड़ने supernatant प्रेरित.
    5. पूर्व ठंडा पूर्ण आइलेट मीडिया के साथ islets को पुन: निलंबित करें। आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रदान की आईक्यू के आधार पर, 5000 IEQ प्रति 12 एमएल मीडिया जोड़ें.
    6. एक 10 सेमी गैर इलाज ऊतक संस्कृति पकवान पर मीडिया में islets डालो. वायुमंडलीय हवा में 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट।
  3. नीचे दर्शाए गए के रूप में अलग islets. रात भर ऊष्मायन के बाद यह चरण निष्पादित करें।
    1. पूर्व गर्म पूर्ण आलेट मीडिया और सेल वियोजन समाधान.
    2. कमरे के तापमान पर 0.04% बीएसए युक्त 1x पीबीएस तैयार करें।
    3. गिनती और हाथ से उठाओ 200-300 islets एक P200 pippette का उपयोग कर और एक 15 एमएल शंकु ट्यूब 5 एमएल पूर्व गर्म पूर्ण आइलेट मीडिया युक्त करने के लिए islets हस्तांतरण.
    4. 2 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा islets लीजिए. धीरे से तल पर गोली परेशान किए बिना supernatant aspirate.
    5. 1.0 एमएल पूर्व-वार्म्ड सेल वियोजन समाधान जोड़ें और धीरे से ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा गोली को बाधित करें। 9-11 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आइलेट्स को इनक्यूबेट करें। हर 3 मिनट पिपेट ऊपर और नीचे धीरे धीरे के लिए 10 s एकल कोशिकाओं में कोशिकाओं को अलग करने के लिए.
    6. एक बार जब एलेट कोशिकाओं को अच्छी तरह से अलग कर रहे हैं और समाधान बादल हो जाता है, 9 एमएल पूरा islet मीडिया जोड़ें और एक नया 15 एमएल शंकु ट्यूब में एक 30 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से फिल्टर.
    7. ट्यूब और सेल छलनी को 2 एमएल पूर्ण आइलेट मीडिया से धोकर शेष आइलेट्स को एकत्र करें और एक ही ट्यूब में जोड़ें।
    8. 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा.
    9. धीरे aspirate मीडिया और 0.04% बीएसए (पीबीएस-BSA) युक्त 5 एमएल 1x पीबीएस में सेल गोली resuspend.
    10. कोशिकाओं को एकत्र करने के लिए 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर एक 15 एमएल शंकु ट्यूब और अपकेंद्रित्र में एक नया 30 डिग्री मीटर सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें।
    11. सुपरनेंट को प्रेरित करें और 200-300 जेडएल 1x पीबीएस-बीएसए समाधान में सेल गोली को फिर से शुरू करें।
    12. सेल एकाग्रता को मापने और 400-500 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता के लिए मात्रा को समायोजित /

2. एकल सेल निलंबन गुणवत्ता नियंत्रण

  1. एक फ्लोरोसेंट आधारित स्वचालित सेल काउंटर34का उपयोग कर सेल एकाग्रता का निर्धारण।
    1. 0.5 डिग्री एल एओ/डीएपीआई के साथ 10 डिग्री एल कोशिकाओं को मिलाएं। पिपेट मिश्रण अच्छी तरह से. स्लाइड पर 10.5 $L लोड करें और गणना और व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए कक्ष गणना परख चलाएँ.
    2. कक्ष संख्या के आधार पर आवश्यक के रूप में कक्ष निलंबन को पतला और/या फ़िल्टर करें।

3. एक microfluidic चिप का उपयोग कर एकल सेल विभाजन. microfluidic चिप निर्माता35से प्रोटोकॉल का पालन करें |

  1. कमरे के तापमान के लिए 3' जेल मोती और रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी) अभिकर्मकों लाओ (gt; 30 मिनट). यदि आवश्यक हो तो टी बफर में आरटी प्राइमर का पुनर्गठन करें।
  2. कम बांधी हुई नली में आरटी मास्टर मिश्रण तैयार कीजिए जैसा कि तालिका 1में बताया गया है।
  3. प्रत्येक नमूने के लिए इनपुट करने के लिए कक्षों की संख्या निर्धारित करें। वांछित लक्ष्य सेल संख्या वितरित करने के लिए आवश्यक सेल निलंबन मात्रा (X) की गणना करें। प्रत्येक नमूने में जोड़ने के लिए न्यूक्लिएस-मुक्त जल की परिकलित मात्रा 33.8-X $L होगी।
  4. प्रत्येक नमूने के लिए विभाजित किया जा करने के लिए, 0.2 एमएल पीसीआर पट्टी ट्यूब में 33.8-एक्स जेडएल nuclease मुक्त पानी जोड़ें। फिर, प्रत्येक पट्टी ट्यूब के लिए 66.2 $L मास्टर मिश्रण जोड़ें. इस बिंदु पर पट्टी ट्यूब के लिए कोशिकाओं को जोड़ने मत करो. पिपेट धीरे मिश्रण करने के लिए। तैयार स्ट्रिप ट्यूबको बर्फ पर रखें।
  5. एक चिप मामले में एक microfluidic चिप प्लेस. चिप मामले को सुनिश्चित करने वाले चिप के मामले को ओरिएंट करें (पंक्ति लेबल 3) प्रयोग करने वाले व्यक्ति के सबसे करीब हैं।
  6. 8 नमूने से कम चल रहा है, तो निम्न क्रम में अप्रयुक्त चैनल को भरने के लिए 50% ग्लिसरोल का उपयोग करें:
    1. सभी अप्रयुक्त चैनलों के लिए पंक्ति 1 में कुओं में 50% ग्लिसरोल के 90 डिग्री एल जोड़ें।
    2. सभी अप्रयुक्त चैनलों के लिए पंक्ति 2 में कुओं में 50% ग्लिसरोल के 40 $L जोड़ें।
    3. सभी अप्रयुक्त चैनलों के लिए पंक्ति 3 में कुओं में 50% ग्लिसरोल के 270 डिग्री एल जोड़ें।
  7. एक भंवर में जेल मोती स्नैप. 30 s. के लिए पूरी गति से भंवर मोती इकट्ठा करने के लिए बेंच शीर्ष पर पट्टी कई बार टैप करें। पुष्टि करें कि कोई बुलबुले मौजूद हैं।
  8. तैयार पट्टी ट्यूबों में कोशिकाओं के एक्स जेडएल जोड़ें. पिपेट 5 बार मिश्रण करने के लिए। पिपेट युक्तियों को हटाए बिना, चिप की पंक्ति 1 में सेल मिश्रण के 90 डिग्री सेल्सियस को स्थानांतरित करें।
  9. 30 s के लिए प्रतीक्षा करें, तो पंक्ति 2 के लिए जेल मोती के 40 $L लोड. इस कदम के लिए बहुत धीरे धीरे Pipette. पंक्ति 3 के कुओं में तेल विभाजन के 270 $L का वितरण करें।
  10. चिप धारक के टैब पर चिप गैसकेट हुक. एकल सेल विभाजन डिवाइस में इकट्ठे चिप धारक प्लेस और रन बटन दबाएँ.
  11. रन पूरा होने पर इकट्ठे चिप धारक को तुरंत हटा दें।
  12. धारक से चिप गैसकेट निकालें, एक 45 डिग्री कोण पर चिप मामले को खोलने के लिए, और एक नीले प्लास्टिक 96 अच्छी तरह से थाली में चिप से पायस के 100 डिग्री एल हटा दें।

4. एकल सेल cDNA प्रवर्धन. microfluidic चिप निर्माता35से प्रोटोकॉल का पालन करें |

  1. रिवर्स प्रतिलेखन.
    नोट: माइक्रोबियल और unamplified cDNA के अन्य संदूषण को रोकने के लिए एक साफ पीसीआर केवल हुड के तहत इस कदम को प्रदर्शन।
    1. 96-वेल नीली प्लेट को गर्म प्लेट सीलर पर पन्नी सील के साथ सील करें।
    2. एक तापीय चक्रक में रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया को इस प्रकार चलाएँ: 53 र्ब् 45 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पकड़।
      नोट: यह एक सुरक्षित रोक बिंदु है। नमूने 72 डिग्री तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ कर सकते हैं।
  2. पोस्ट-आरटी शुद्धि
    1. न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी चुंबकीय मोती और न्यूक्लिक एसिड आकार चयन चुंबकीय मोती कमरे के तापमान और भंवर को फिर से निलंबित करने के लिए लाओ. इस बिंदु पर, नमूना सफाई बफर के लिए 10 मिनट 65 डिग्री सेल्सियस पर thaw. कमरे के तापमान और भंवर के लिए अन्य सभी अभिकर्मकों लाओ.
    2. बफ़र तैयार करें जैसा कि तालिकाएँ 2 और तालिकाएँ 3में दर्शाए गए हैं।
  3. रासायनिक पायस को तोड़कर शुद्ध करें।
    1. ऐसा करने के लिए, धीरे थाली से पन्नी सील हटा दें।
    2. प्रत्येक इमल्शन में गुलाबी पायस-ब्रेकिंग अभिकर्मक का 125 डिग्री सेल्सियस का वितरण करें। 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें, तो एक साफ 0.2 एमएल पट्टी ट्यूब के लिए पूरे मात्रा हस्तांतरण. सुनिश्चित करें कि वहाँ स्पष्ट की एक परत और पट्टी ट्यूब में गुलाबी की एक परत है.
    3. स्पष्ट परत परेशान किए बिना पट्टी ट्यूब के नीचे से गुलाबी परत के 125 डिग्री सेल्सियस निकालें। यह ट्यूब में रहने के लिए गुलाबी परत की एक छोटी मात्रा ($15 डिग्री सेल्सियस) के लिए सामान्य है।
    4. पट्टी ट्यूब के लिए तालिका 2 से सफाई मिश्रण के 200 डिग्री एल जोड़ें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    5. एक चुंबकीय स्टैंड के लिए पट्टी ट्यूब स्थानांतरण और स्पष्ट करने के लिए समाधान की अनुमति देते हैं। supernatant निकालें और त्यागें, फिर 80% इथेनॉल के साथ दो बार मोती धो लें। मोती 1 मिनट के लिए सूखने के लिए अनुमति दें.
    6. चुंबक से पट्टी ट्यूब निकालें और सारणी 3 से मोती के लिए elution समाधान के 35.5 $L जोड़ें. पिपेट समाधान में मोती को फिर से निलंबित करने के लिए। कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    7. एक चुंबकीय स्टैंड के लिए पट्टी ट्यूब स्थानांतरण और स्पष्ट करने के लिए समाधान की अनुमति देते हैं। पट्टी ट्यूब से शुद्ध cDNA निकालें और 0.2 एमएल पट्टी ट्यूब साफ करने के लिए वितरित.
  4. CDNA बढ़ाना.
    1. तालिका 4, नीचे में प्रवर्धन मास्टर मिश्रण तैयार करें।
    2. प्रत्येक नमूने के लिए cDNA Amplification मास्टर मिक्स के 65 डिग्री एल जोड़ें. पट्टी ट्यूब को एक थर्मल साइकिलर में रखें और निम्नलिखित प्रोग्राम चलाएं: 98 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट [ 15 चक्र [98 डिग्री सेल्सियस 15 s ] 67 डिग्री सेल्सियस 20 s ] 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट ] 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट ] 4 डिग्री सेल्सियस पकड़
      नोट: यह एक सुरक्षित रोक बिंदु है। नमूने 72 एच तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ कर सकते हैं।
    3. 0ण्6x न्यूक्लिक अम्ल आकार चयन चुंबकीय मोतियों के साथ प्रवर्धित सीडीएना को शुद्ध करें। 80% इथेनॉल के साथ दो बार धो लें और 40.5 डिग्री सेल्सियस के साथ एल्यूट करें।
    4. स्वचालित जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस और फ्लोरोसेंट आधारित डीएनए परिमाणपरा 36,37का उपयोग कर गुणवत्ता नियंत्रण cDNA चलाते हैं।
      नोट: यह एक सुरक्षित रोक बिंदु है। नमूने 72 एच तक या -20 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ कर सकते हैं।

5. अनुक्रमण पुस्तकालय निर्माण

  1. टैगेशन और cDNA38की सफाई |
    1. कुल मात्रा के 20 डिग्री एल में 50 एनजी के लिए cDNA सामान्य। सटीक परिमाण इस चरण में महत्वपूर्ण है.
    2. सारणी 5 में टैगेशन मिश्रण बनाइए और बर्फ पर प्रत्येक 20 डिग्री सेल्सियस सीडीएएनए नमूने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस का मिश्रण करें। थर्मल साइकिलर में नमूने रखो और टैगमेंट प्रोटोकॉल चलाने: 55 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट $ 10 डिग्री सेल्सियस पकड़।
    3. 38 कॉलम का उपयोग करटैगकिएगए CDNA की सफाई करें। प्रत्येक नमूने के लिए 180 $L डीएनए बाइंडिंग बफर जोड़ें। स्पिन स्तंभ में 230 $L स्थानांतरित करें.
    4. 2 मिनट के लिए 1300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    5. 300 डिग्री एल डीएनए धोने बफर के साथ दो बार धो लो. इथेनॉल हटाने सुनिश्चित करने के लिए 1300 x ग्राम पर एक अतिरिक्त 2 मिनट सेंट्रीफ्यूज।
    6. Elute शुद्ध tagmented cDNA कॉलम के लिए elution बफर के 31 डिग्री सेल्सियस जोड़कर और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट.
    7. शुद्ध उत्पाद को ठीक करने के लिए 1300 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  2. नमूना सूचकांक पीसीआर.
    1. मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण रन के दौरान ओवरलैप नहीं करते जो बारकोड चुनें।
    2. तालिका 6में दर्शाए गए अनुक्रमणिका PCR मास्टर मिश्रण को बनाएँ।
    3. शुद्ध नमूना के 30 डिग्री एल करने के लिए नमूना सूचकांक पीसीआर मास्टर मिश्रण के 60 डिग्री एल जोड़ें।
    4. प्रत्येक नमूने (रिकॉर्ड अनुक्रमणिका का उपयोग किया गया) में 20 डिग्री सेल्सियस, 4-ओलिगो नमूना अनुक्रमणिका का 10 $L जोड़ें. कुल अभिक्रिया आयतन अब 100 प्र.ल है।
    5. ढक्कन के साथ एक थर्मल चक्र में 105 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट रखें। निम्नलिखित कार्यक्रम चलाएँ: 98 डिग्री सेल्सियस 45 s ] 12-14 चक्र [98 डिग्री सेल्सियस 20 s ] 54 डिग्री सेल्सियस 30 s ] 72 डिग्री सेल्सियस 20 s ] 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट ] 4 डिग्री सेल्सियस पकड़।
      नोट: यह एक सुरक्षित रोक बिंदु है। नमूने 72 डिग्री तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ कर सकते हैं।
  3. डबल मनका साफ के साथ पुस्तकालयों को शुद्ध।
    1. नमूने के लिए न्यूक्लिक एसिड आकार चयन चुंबकीय मोती के 100 डिग्री एल जोड़ें और एक पिपेट के साथ अच्छी तरह से मिश्रण. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    2. एक चुंबक के लिए स्थानांतरण और यह खड़े जब तक समाधान साफ करता है. अति-निकालिए को हटा दें और छोड़ दें।
    3. 80% इथेनॉल के 200 $L के साथ दो बार धो लें।
    4. चुंबक पर मोती को 2 मिनट के लिए सुखाइए। चुंबक से निकालें और मनका गोली में ईबी बफर के 50.5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। बफ़र में मोती को फिर से निलंबित करने के लिए पिपेट।
    5. 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। एक चुंबक में स्थानांतरण करें और 2 मिनट के लिए खड़े हो जाएं। एक साफ पट्टी ट्यूब के लिए 50 डिग्री सेल्सियस एल्यूटेड नमूने का स्थानांतरण करें।
    6. नमूना करने के लिए 40 डिग्री सेल्सियस न्यूक्लिक एसिड आकार चयन चुंबकीय मोती जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट. एक चुंबक के लिए स्थानांतरण और समाधान स्पष्ट करते हैं। निकालें और supernatant त्यागें.
    7. 80% इथेनॉल के 125 जेडएल के साथ दो बार धो लें।
    8. चुंबक पर मोती को 2 मिनट के लिए सुखाइए। चुंबक से निकालें और बीबी बफर के 60.5 डिग्री सेल्सियस को मनका गोली में जोड़ें। बफ़र में मोती को फिर से निलंबित करने के लिए पिपेट।
    9. 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। एक चुंबक में स्थानांतरण करें और इसे 2 मिनट के लिए खड़े होने दें। एक साफ पट्टी ट्यूब के लिए 50 डिग्री सेल्सियस एल्यूटेड नमूने का स्थानांतरण करें। यह अंतिम पुस्तकालय है.
    10. 72 एच तक या -20 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने पकड़ो। ध्यान दें कि यह एक सुरक्षित रोक बिंदु है.
  4. स्वचालित जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस और फ्लोरोसेंट आधारित डीएनए परिमाणकता परख36,37का उपयोग करके अंतिम पुस्तकालयों के क्वांटिफी और रन गुणवत्ता नियंत्रण । गुणवत्ता नियंत्रण चलाने से पहले नमूनों को पतला करें 1:10.

6. लाइब्रेरी अनुक्रमण

  1. प्रत्येक प्रतिदर्श को एक साथ 2 एनजी/जेडएल तथा पूल 3 डिग्री सेल्सियस तक अनुक्रमित करने के लिए सामान्य करें।
  2. फ्लोरोसेंट आधारित डीएनए परिमाणपरक37के साथ पूल एकाग्रता को मापने .
  3. पूल को 0ण्25 एनजी/जेडएल तक पतला करें।
  4. इस प्रकार के रूप में पूल denature: पतला पूल्ड नमूना के 12 $L (0.25 एनजी / 5 मिनट के लिए इस इनक्यूबेट करते हैं, फिर 200 एमएम ट्रास पीएच 8.0 के 10 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
  5. 1345.95 $L HT1 में 4.05 $L लोड करें। अनुक्रमक कारतूस में 1.3 एमएल लोड और निर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसार चलाने39 26 चक्र (पढ़ें 1) + 8 चक्र (i7 सूचकांक) + 0 चक्र (i5 सूचकांक) + 55 चक्र (पढ़ें 2) के साथ एक अनुक्रमण नुस्खा का उपयोग कर.

7. संरेखण पढ़ें (पूरक फ़ाइल 1)

  1. सेल रेंजर (v2.0.0) चलाने के लिए deमल्टीप्लेक्स कच्चे आधार कॉल (BCL) FASTQ फ़ाइलों में अनुक्रमण द्वारा उत्पन्न फ़ाइलों. अभिव्यक्ति परिमाणीकरण प्राप्त करने के लिए मानव B37.3 जीनोम विधानसभा और UCSC जीन मॉडल के लिए FASTQ फ़ाइलों को संरेखित करें।
  2. संरेखण गुणवत्ता नियंत्रण.
    1. संरेखण मैट्रिक्स उत्पन्न और Q30 कुर्सियां, मान्य बारकोड अंश, सेल संबद्ध पढ़ा अंश, मैप किए गए पढ़ें अंश और प्रत्येक सेल में पता चला पढ़ता जाँच करें।
    2. कक्ष-संबद्ध बारकोड और पृष्ठभूमि की पृथक्करण सुनिश्चित करने के लिए बारकोड रैंक प्लॉट की जाँच करें.

8. डेटा विश्लेषण (पूरक फ़ाइल 2)

  1. सेल गुणवत्ता नियंत्रण और पूर्व प्रक्रिया.
    1. पहले वर्णित 32 के रूप में अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता (UMI), gt; 0.2 व्यवहार्यता स्कोर की कुलसंख्या के साथ कक्षों को शामिल न करें; 500 का पता लगाया जीन, (lt; 3000 अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता की कुल संख्या] ऊतक और सेल प्रकार के अनुसार cutoffs समायोजित करें.
    2. डबलेट निकालें.
      1. पांच अंत: स्रावी हार्मोन जीन (ग्लूकागन - जीसीजी, इंसुलिन - आईएनएस, सोमेटोस्टेटिन - एसएसटी, अग्नाशयी पॉलीपेप्टाइड - पीपीवाई, और ghrelin - GHRL) का आकलन bimodal अभिव्यक्ति पैटर्न के लिए (उच्च और कम अभिव्यक्ति मोड ) आर पैकेज mclust40|
      2. उच्च अभिव्यक्ति मोड में दो या अधिक हार्मोन जीन के साथ एक से अधिक हार्मोन जीन व्यक्त है कि कोशिकाओं को निकालें, यानी.
    3. कुल UMI द्वारा जीन अभिव्यक्ति को सामान्य और आर पैकेज Seurat41का उपयोग कर सेल स्तर पर 10,000 के पैमाने कारक से गुणा .
    4. कम से कम 3 कोशिकाओं में पाए गए जीन निकालें.
    5. सभी कोशिकाओं के औसत अभिव्यक्ति और फैलाव का उपयोग करके चर जीनों का पता लगाएँ. ऊतक और सेल प्रकार के अनुसार cutoffs समायोजित करें.
  2. चर जीन के साथ मुख्य घटक विश्लेषण प्रदर्शन. मुख्य घटकों की चयनित संख्या वाले क्लस्टर कक्ष. एक कोशिका समूह की शेष कोशिकाओं के साथ तुलना करके व्युत्पन्न कोशिका-क्लस्टर समृद्ध जीन।

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Representative Results

एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण कार्यप्रवाह में तीन चरण होते हैं: बरकरार मानव आइलेट्स को एकल सेल निलंबन में अलग करना, एक छोटी-छोटी-आधारित तकनीक का उपयोग करके एकल कोशिकाओं को कैप्चर करना, और आरएनए-सेक डेटा का विश्लेषण करना (चित्र1)। सबसे पहले, अधिग्रहीत मानव आइलेट्स को रातोंरात इनक्यूबेट किया गया। अक्षुण्ण आइलेट्स की सूक्ष्मदर्शी के अधीन जांच की गई (चित्र 2क) अलग-अलग islet कोशिकाओं की अखंडता situ संकरीकरण (RNA-FISH) में आरएनए फ्लोरोसेंट का उपयोग कर मान्य किया गया है। जैसा कि चित्र 2खमें दर्शाया गया है, क्रमशः जीसीजी और आईएनएस एमआरएनए जांचों का उपयोग करके अलग-अलग -- और जेड-कोशिकाओं की कल्पना की गई थी।

एकल-कक्ष कैप्चर चरण से पहले कक्ष गणना और व्यवहार्यता का निर्धारण करने की आवश्यकता होती है. कम व्यवहार्यता या उच्च मलबे वाले सेल आगे के प्रसंस्करण के लिए उपयुक्त नहीं हैं। एक अच्छा सेल सांद्रता आमतौर पर 400 से 500 कोशिकाओं/ चित्र 3क विभाजन चरण के बाद इमल्शन का एक सफल उदाहरण है। प्रत्येक पिपेट सुझावों में तरल जेल मोती से अलग न्यूनतम विभाजन तेल के साथ एक समान पीला बादल है। इसके विपरीत, चित्रा 3B जेल मोती और तेल के बीच स्पष्ट चरण जुदाई के साथ एक गरीब गुणवत्ता पायस से पता चलता है. यह चिप चलाने के दौरान एक रोकना के कारण हो सकता है.

एकल कक्ष विभाजन के बाद, cDNA प्रवर्धन किया गया था. चित्र 4A CDNA प्रवर्धन के बाद एक प्रतिनिधि टुकड़ा आकार वितरण दिखाता है. एक अच्छी गुणवत्ता cDNA नमूने के लिए ठेठ चोटी 1000-2000 बीपी के पास रहते थे. दिलचस्प है, 600 बीपी के पास एक कील आइलेट cDNA के लिए विशिष्ट था. आरएनए-सेक पुस्तकालयों के लिए खंड आकार वितरण 300 और 500 बीपी के बीच था (चित्र 4ठ) ।

अनुक्रमण के बाद, हमने एकल-कोशिका आरएनए-सेक डेटा गुणवत्ता (तालिका7)का मूल्यांकन करने के लिए पठन संरेखण मैट्रिक्स का एक सेट नियोजित किया। पहले तीन मैट्रिक्स अच्छी तरह से संक्षेप एकल सेल अनुक्रमण पुस्तकालय की गुणवत्ता. औसतन, 92% पढ़ता बरकरार कोशिकाओं से प्राप्त किया गया और 72% पढ़ता exons के लिए मैप किया गया. सभी exon में से प्राप्त बूंदों में कब्जा कर लिया पढ़ता है, उनमें से 90% बरकरार कोशिकाओं द्वारा उत्पादित किया गया और बाकी की संभावना सेल मुक्त बूंदों में परिवेश आरएनए था. ये संरेखण मीट्रिक अच्छी डेटा गुणवत्ता का सुझाव देते हैं. Exon पढ़ता है और UMI के बीच अनुपात अनुक्रमण संतृप्ति का मूल्यांकन करने के लिए एक अनुभवजन्य माप था और आमतौर पर, 10:1 अनुपात एक अच्छा सूचक था. इसके अतिरिक्त, पता चला जीन की संख्या (UMI gt; 0) विभिन्न सेल प्रकार की विशेषता के लिए एक उपयोगी सुविधा थी. मानव islet कोशिकाओं के लिए, पता चला जीन की संख्या के बारे में है 1,900 प्रत्येक कोशिका में.

हम 12 गैर मधुमेह दाताओं से 20,811 islet कोशिकाओं की कुल अनुक्रम. कोशिकाओं के बारे में 6% में एक से अधिक हार्मोन की अभिव्यक्ति का पता चला था. ये बहु-हार्मोनल कोशिकाएं सबसे अधिक संभावना doubts हैं क्योंकि हमारे पिछले काम से पता चला है कि कम से कम और lt; 0.1% एकल islet कोशिकाओं के सह एक से अधिक अंत: स्रावी हार्मोन33व्यक्त . हम सभी की पहचान की बहु-हार्मोनल कोशिकाओं को हटा दिया. कुल UMI, पता चला जीन, और सेल व्यवहार्यता33के आधार पर कम गुणवत्ता वाली कोशिकाओं को बाहर करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। इन गुणवत्ता नियंत्रण चरणों के बाद, 19,174 आगे विश्लेषण के लिए बने रहे. क्लस्टरिंग विश्लेषण से 12 सेल प्रकारों का पता चला: जेड-, जेड-, जेड-, पीपी, जेड-कोशिकाओं, एसीनार, वाहिनी, शांत स्टेलेट, सक्रिय स्टेलेट, एंडोथेलियल, मैक्रोफेज, और मस्तूल कोशिकाओं (चित्र 5)। जैसा कि आशा थी, अंत: स्रावी कोशिकाएँ बहुसंख्यक थीं (सारणी 8)। जेड-सेल में शीर्ष समृद्ध जीन (अर्थात, जीसीजी, टीटीआर, CRYBA2, TM4SF4, TMEM176B) और जेड-सेल (यानी, IAPP, आईएनएस, HADH, DLK1, RBP4) अन्य के साथ संगत कर रहे हैं अध्ययन13,15,16,17,18,20,21,22,29 ,30,31,33. दिलचस्प बात यह है कि दोनों----कोशिकाओं में कई उप-जनसंख्याएं थीं। तीन जेड-सेल उप-जनसंख्या, बीटा उप1, 2, और 3, उप-जनसंख्या समृद्ध जीनों की छोटी संख्या के समान थे (18 बीटा उप1 में, 33 बीटा उप 2 में, और 18 बीटा उप 3 में)। चौथी उपजनसंख्या में 488 समृद्ध जीन थे। लघु-सेल उपजनसंख्या (अल्फा उप3) में प्रसारित कोशिकाएं शामिल थीं, जिनकी विशेषता MKI67, CDK1और TOP2Aकी समृद्ध अभिव्यक्ति है।

Figure 1
चित्र 1: एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण कार्यप्रवाह का Schematic आरेख. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: अक्षुण्ण और असंबद्ध मानव आइलेट्स की प्रतिनिधि छवियां। (ए) रात भर ऊष्मायन के बाद ली गई आइलेट्स की एक छवि। (बी) अलग-अलग आईलेट कोशिकाओं को आरएनए-फिश दागिंग द्वारा आईएनएस (सफेद) और जीसीजी (लाल) के लिए अभिभूत किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: रिवर्स प्रतिलेखन से पहले एकल सेल पायस की गुणवत्ता की परीक्षा। (क) अच्छी गुणवत्ता का एकल-कोशिका पायस। प्रत्येक पिपेट टिप में तरल सजातीय रूप से बादल था। (बी) खराब गुणवत्ता का एकल-सेल पायस। पिपेट टिप में तरल सजातीय नहीं था और तेल और जेल मोती के बीच जुदाई दिखाया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: एकल कोशिका cDNA और पुस्तकालय की गुणवत्ता की परीक्षा. (ए) एक प्रतिनिधि cDNA निशान. इस cDNA अच्छी गुणवत्ता और उपज का था, नमूना के लिए मुख्य चोटी के साथ 1000-2000 बीपी के पास होने वाली. 600 बीपी के आसपास ट्रेस में कील विशिष्ट और आइलेट cDNA के विशिष्ट था. (ख) एक प्रतिनिधि अंतिम अनुक्रमण पुस्तकालय ट्रेस. यह पुस्तकालय अच्छी गुणवत्ता और उपज का था, 300-500 बीपी के बीच होने वाली मुख्य चोटी के साथ. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: मानव अग्नाशयी आइलेट्स के एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण में पहचाने गए सेल प्रकार और उप-जनसंख्या। सेल टी-वितरित स्टोचैस्टिक पड़ोसी embedding (tSNE) आयाम के अंतरिक्ष में विशिष्ट सेल प्रकार द्वारा संकुल थे। इस विश्लेषण से कोशिकाओं में तीन उप-जनसंख्या और चार कोशिकाओं में भी पता चला। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अभिकर्मक का नाम Vol. प्रति प्रतिक्रिया का उपयोग करने के लिए ($L)
आरटी रिएजेंट मिक्स 50
आरटी प्राइमर 3.8
Additive एक 2.4
आरटी एंजाइम मिक्स 10
कुल 66.2

तालिका 1: रिवर्स प्रतिलिपि मिश्रण.

अभिकर्मक का नाम प्रति प्रतिक्रिया का उपयोग करने के लिए वॉल्यूम (uL)
न्यूक्लेस-मुक्त पानी 9
बफर नमूना साफ ऊपर 1 182
डाइनाबीड्स मायवन सिलेन 4
Additive एक 5
कुल 200

तालिका 2: क्लीनअप मिश्रण.

अभिकर्मक का नाम प्रति प्रतिक्रिया का उपयोग करने के लिए वॉल्यूम (uL)
बफर ईबी 98
10% ट्वेन 20 1
Additive एक 1
कुल 100

तालिका 3: Elution समाधान.

अभिकर्मक का नाम प्रति प्रतिक्रिया का उपयोग करने के लिए वॉल्यूम (uL)
न्यूक्लेस-मुक्त पानी 8
प्रवर्धन मास्टर मिक्स 50
cDNA Additive 5
cDNA प्राइमर मिक्स २
कुल 65

तालिका 4: cDNA प्रवर्धन मिश्रण.

अभिकर्मक का नाम प्रति प्रतिक्रिया का उपयोग करने के लिए वॉल्यूम ($L)
टैगमेंटेशन एंजाइम 5
टैगेशन बफर 25
कुल 30

तालिका 5: टैगमेंट मिश्रण.

अभिकर्मक का नाम प्रति प्रतिक्रिया का उपयोग करने के लिए वॉल्यूम ($L)
न्यूक्लेस-मुक्त पानी 8
प्रवर्धन मास्टर मिक्स 50
एसआई-पीसीआर प्राइमर २
कुल 60

तालिका 6: नमूना सूचकांक पीसीआर मास्टर मिश्रण।

नमूना आईडी मान्य कक्ष बारकोड के साथ % पढ़ता है कुल कक्षों के बीच कैप्चर किए गए कक्षों में % Exon पढ़ता है % Exon कुल पढ़ें के बीच पढ़ता है मतलब Exon सेल प्रति पढ़ता है प्रति सेल मध्य UMI प्रति सेल माध्य जीन
नमूना-1 92% 93% 76% 142,015 10,310 1,747
नमूना-2 92% 91% 74% 151,395 11,350 1,754
नमूना-3 94% 92% 75% 120,538 19,604 2,180
नमूना-4 95% 93% 67% 160,657 11,870 2,111
नमूना-5 94% 92% 62% 177,809 13,821 2,288
नमूना-6 95% 89% 67% 138,208 8,235 1,296
नमूना-7 94% 89% 72% 147,484 13,606 2,272
नमूना-8 94% 91% 69% 159,793 9,505 1,865
नमूना-9 95% 92% 72% 168,436 12,794 2,389
नमूना-10 83% 83% 74% 88,067 13,323 1,805
नमूना-11 82% 88% 77% 67,752 9,295 1,278
नमूना-12 91% 85% 74% 194,781 14,877 1,746

तालिका 7: संरेखण मीट्रिक पढ़ें.

कक्ष प्रकार कक्षों की संख्या Ave. कोशिकाओं दाता प्रति (मानक विचलन)
अल्फा 6546 546 (258)
बीटा 7361 613 (252)
डेल्टा 922 77 (37)
पीपी 545 45 (25)
एप्सिलॉन 11 1 (1)
एसीनार 836 70 (71)
डुक्युटल 1313 109 (95)
शांत स्टेलेट 225 19 (14)
सक्रिय स्टेलेट 890 74 (58)
Endothelial 408 34 (21)
मैक्रोफेज 80 7 (6)
श्वानन 37 3 (3)

तालिका 8: सेल प्रकार संरचना. प्रत्येक सेल प्रकार में प्रत्येक दाता के लिए प्रत्येक सेल प्रकार और औसत कोशिकाओं के लिए कोशिकाओं की कुल संख्या.

पूरक फ़ाइल 1: अनुक्रम संरेखण के लिए उपयोग किया जाने वाले आदेश. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: R लिपियों सेल गुणवत्ता नियंत्रण प्रदर्शन करने के लिए, सेल क्लस्टरिंग, और सेल प्रकार समृद्ध जीन की पहचान करने के लिए. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हाल के वर्षों में विकसित एकल सेल प्रौद्योगिकियों सेल प्रकार की विशेषता और मानव अग्नाशय islets में आणविक विषमता का अध्ययन करने के लिए एक नया मंच प्रदान करते हैं। हमने मानव आइलेट्स का अध्ययन करने के लिए छोटी बूंद-आधारित माइक्रोफ्लूइडिक एकल-सेल अलगाव और डेटा विश्लेषण का प्रोटोकॉल अपनाया। हमारे प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक अनुक्रम गुणवत्ता और बैच प्रभाव में अपेक्षाकृत छोटे रूपों के साथ 20,000 से अधिक एकल मानव गिलेट कोशिकाओं से आरएनए अनुक्रमण डेटा का उत्पादन किया।

विशेष रूप से, दो कदम उच्च गुणवत्ता वाले परिणामों के लिए इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण हैं. मानव आइलेट्स को अलग करते समय सावधानी बरतने की आवश्यकता है। आइलेट्स को अधिक पचाने के लिए यह महत्वपूर्ण है। एकल-सेल विभाजन एक सफल एकल-सेल प्रयोग के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण कदम है. हमने चित्र 3में अच्छी और खराब गुणवत्ता वाले इमल्शनके उदाहरणों का प्रदर्शन किया है। एक स्पष्ट पायस आमतौर पर विभाजन चरण में एकत्र किया जा रहा कोशिकाओं की अपर्याप्त संख्या का संकेत है.

अलग प्राथमिक मानव islets के लिए उपयोग बड़े पैमाने पर मानव आइलेट एकल सेल transcriptomes उत्पन्न करने के लिए एक दर सीमित कदम है. अलग-अलग शव दाताओं से अलग islets आमतौर पर अलग अलग समय पर संसाधित कर रहे हैं, इस प्रकार संभावित नमूना पर निर्भर बैच प्रभाव ध्यान से डेटा विश्लेषण के दौरान जांच की जानी चाहिए. एकात्मक विश्लेषण का उपयोग सामान्य कोशिका प्रकारों और उप-जनसंख्याओं को अलग-अलग बैचोंमें 41में पहचानने के लिए किया जा सकता है। बैच प्रभाव भी बैच सही अभिव्यक्ति परिमाणीकरण42द्वारा समायोजित किया जा सकता है। एकल-सेल आरएनए-सेक डेटा का विश्लेषण करने के लिए एक और चुनौती doubts की पहचान करने के लिए है। डेटा पूर्व प्रसंस्करण में, हमने कई हार्मोन जीनों (जीसीजी, आईएसएस, एसएसटी, पीपीवाई, और जीएचआरएल) व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की पहचान करके अंत: स्रावी डबल्स को हटाने के लिए उपाय किए हैं। दो अलग अलग सेल प्रकार के द्वारा गठित doubts की पहचान अंत: स्रावी हार्मोन के अत्यंत उच्च अभिव्यक्ति के कारण एक अपेक्षाकृत आसान काम है. असली चुनौती के भीतर की पहचान करने के लिए है-सेल प्रकार doubts, उदा, दो $ कोशिकाओं द्वारा doubts. क्योंकि उच्च UMI और पता चला जीन की उच्च संख्या संभावित doubts के विचारोत्तेजक हैं, एक समाधान के लिए जीन और UMI की एक उच्च संख्या के साथ कोशिका QC कदम के दौरान outliers को दूर है. इसके अतिरिक्त, doubts का पता लगाने के लिए उपकरण उपलब्ध हैं43,44,45.

एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण की एक प्रमुख सीमा कम संवेदनशीलता है. कील में बाहरी आरएनए नियंत्रण कंसोर्टियम (ईआरसीसी) आरएनए का उपयोग करते हुए, हमने अनुमान लगाया कि सभी व्यक्त जीनों में से केवल 10% वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करके पाए गए और पता चला कि लोग उच्च बहुतायत जीन46की ओर पक्षपाती थे। अग्नाशयी अंत: स्रावी कोशिकाओं हार्मोन जीन के अत्यंत उच्च स्तर व्यक्त (यानी, जीसीजी, आई.आई.एस., एसएसटी, और PPY). परिणामस्वरूप, इन जीनों के एमआरएनए को परिवेशआरए बनने का खतरा होता है। इस तरह की पृष्ठभूमि शोर पूरी तरह से बचा नहीं जा सकता है. हालांकि, इस कदम दर कदम प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं अवांछित प्रयोगात्मक शोर को कम करने में मदद मिलेगी. वर्तमान प्रोटोकॉल ताजा अलग ऊतकों के लिए बनाया गया है. अन्य प्रौद्योगिकियों, जैसे एकल-न्यूक्लियस आरएनए अनुक्रमण47,48,ताजा, जमे हुए, या हल्के से तय ऊतकों के आरएनए-सेक के लिए उपलब्ध हैं। इसके अतिरिक्त, हाल ही में विकसित सेल हैशिंग प्रौद्योगिकी49 को एक उन्नत माइक्रोफ्लूइडिक एकल-सेल प्रोटोकॉल के रूप में माना जा सकता है जो नमूना बहुसंकेतन की अनुमति देता है।

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Disclosures

सभी लेखकों के कर्मचारियों और Regeneron फार्मास्यूटिकल्स, इंक के शेयरधारकों रहे हैं

Acknowledgments

कोई नहीं

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 µm Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec 130-041-407 Cell strainer
8-chamber slides Chemometec 102673-680 Dell counting assay slides
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 for QC
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647 Single cell media
Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns 10X Genomics 120237 Single cell reagents
Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) 10X Genomics 120236 Microfluidic chips
CMRL-1066 ThermoFisher 11530-037 Complete islet media
EB Buffer Qiagen 19086 Elution buffer
Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted VWR 47744-112 Emulsion plate
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 16000-036 Complete islet media
Human islets Prodo Labs HIR Isolated human islets
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher 25030-081 Complete islet media
Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) Illumina FC-121-1031 Library preparation reagents
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) Illumina FC-404-2005 Sequencing
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher 15140-122 Complete islet media
Qubit High Sensitivity dsDNA Kit Life Technologies Q32854 for QC
Solution 18 Chemometec 103011-420 Cell counting assay reagent
SPRISelect Reagent Fisher Scientific B23318 Purification beads
Tissue Culture Dishes (10 cm) VWR 10861-594 for islet culture
TrypLE Express Life Technologies 12604-013 Cell dissociation solution
Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions VWR 77001-152 Library clean up columns

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जेनेटिक्स अंक 149 एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण मानव अग्नाशयislets जेड कोशिकाओं जेड कोशिकाओं सेल जनसंख्या विषमता ट्रांसपोम
एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण और मानव अग्नाशय Islets का विश्लेषण
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Xin, Y., Adler, C., Kim, J., Ding, Y., Ni, M., Wei, Y., Macdonald, L., Okamoto, H. Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets. J. Vis. Exp. (149), e59866, doi:10.3791/59866 (2019).

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