Summary
Qui, presentiamo un protocollo per generare dati trascrittomi su larga scala di alta qualità e su larga scala di singole cellule da isole pancreatiche umane isolate utilizzando una tecnologia di sequenziamento di RNA microfluidico a celle a goccia.
Abstract
Le isole pancreatiche comprendono cellule endocrine con modelli distintivi di espressione ormonale. Le cellule endocrine mostrano differenze funzionali in risposta a condizioni normali e patologiche. L'obiettivo di questo protocollo è quello di generare dati transcriptome di alta qualità e su larga scala di ogni tipo di cellula endocrina con l'uso di una tecnologia di sequenziamento di RNA microfluidico a celle singola basata su goccia. Tali dati possono essere utilizzati per costruire il profilo di espressione genica di ogni tipo di cellula endocrina in condizioni normali o specifiche. Il processo richiede un'attenta maneggevolezza, una misurazione accurata e un rigoroso controllo di qualità. In questo protocollo vengono descritti i passaggi dettagliati per la dissociazione, il sequenziamento e l'analisi dei dati delle isole pancreatiche umane. I risultati rappresentativi di circa 20.000 cellule di isolotto umano dimostrano il successo dell'applicazione del protocollo.
Introduction
Le isole pancreatiche rilasciano ormoni endocrini per regolare i livelli di glucosio nel sangue. Cinque tipi di cellule endocrine, che differiscono dal punto di vista funzionale e morfologico, sono coinvolte in questo ruolo essenziale: le cellule z-cellule producono glucagone, insulina a cellule z, somatostatina -cellule del PP, polipeptide pancreatica delle cellule PP e ghrelina di cellule sè1. La profilazione dell'espressione genica è un approccio utile per caratterizzare le cellule endocrine in condizioni normali o specifiche. Storicamente, la profilazione dell'espressione genica dell'intero islet è stata generata utilizzando il sequenziamento dell'RNA di microarray e di nuova generazione2,3,4,5,6,7 , 8. Sebbene l'intero trascrittoma dell'isolotto sia informativo per identificare le trascrizioni specifiche dell'organo e i geni candidati alla malattia, non riesce a scoprire l'eterogeneità molecolare di ogni tipo di cellula issolata. La tecnica della microdissection laser di cattura (LCM) èstata applicata per ottenere direttamente tipi di cellule specifici dalle isole 9,10,11,12 ma non è al di sotto della purezza della cellula mirata popolazione. Per superare queste limitazioni, lo smistamento delle cellule attivato dalla fluorescenza (FACS) è stato utilizzato per selezionare specifiche popolazioni di cellule endocrine, come le cellule di z e z13,14,15,16 , 17 mi lato , 18.Inoltre, Dorrell et al. ha utilizzato un approccio di selezione FACS basato su anticorpi per classificare le cellule z in quattro sottopopolazioni19. Le cellule di isolotto in ordine FACS possono anche essere placcate per il sequenziamento dell'RNA di singole cellule; tuttavia, i metodi a piastre devono affrontare sfide di scalabilità20,21,22.
Per generare dati trascrittoma di alta qualità e su larga scala di ogni tipo di cellula endocrina, abbiamo applicato la tecnologia microfluidica alle cellule delle istome umane. La piattaforma microfluidica genera dati trascrittomi da un gran numero di singole cellule in modo ad alta velocità effettiva, alta qualità e scalabile23,24,25,26,27. Oltre a rivelare le caratteristiche molecolari di un tipo di cellula catturate in una grande quantità, la piattaforma microfluidica altamente scalabile consente l'identificazione di tipi di cellule rare quando vengono fornite abbastanza cellule. Quindi, l'applicazione della piattaforma alle isole pancreatiche umane ha permesso la profilazione di cellule sseriforanti, un raro tipo di cellula endocrina con funzione poco conosciuta a causa della sua scarsità28. Negli ultimi anni, diversi studi sono stati pubblicati da noi e altri riportano dati trascrittomi su larga scala di isole umane utilizzando la tecnologia29,30,31,32, 33. I dati sono disponibili al pubblico e risorse utili per la comunità delle isolotto per studiare l'eterogeneità delle cellule endocrine e le sue implicazioni nelle malattie.
In questo caso, descriviamo un protocollo di sequenziamento dell'RNA microfluidico a celle microfluidico basato sulle goccioline, che è stato utilizzato per produrre dati trascrittomi di circa 20.000 cellule di isole umane, tra cui 32. Il flusso di lavoro inizia con isolotti umani isolati e illustra i passaggi di dissociazione delle isolotti, acquisizione di una singola cella e analisi dei dati. Il protocollo richiede l'uso di isolotti appena isolati e può essere applicato alle isole provenienti da esseri umani e altre specie, come i roditori. Utilizzando questo flusso di lavoro, è possibile costruire atlas imparziale e completo delle celle isolotto e completo in condizioni di base e altre condizioni.
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Protocol
1. Dissociazione dell'isolotto umano
- Ottenere isolotti umani isolati da donatori di organi di cadaveri di entrambi i sessi, età compresa tra 15-80 anni, senza malattie preesistenti, a meno che non siano richieste isole di donatori con dati demografici specifici per lo scopo di studio.
- Dopo l'isolamento, tenere le isole isolate nella struttura di coltura dei tessuti per 2-3 giorni presso il fornitore. Spesso ci vuole più di 1 giorno perché i danni all'isolotto diventino visibili.
- Mettere gli isolette in una bottiglia e immergerle completamente nel supporto dell'isolotto. Portarlo al laboratorio con una spedizione notturna.
- Ottenere la quantità equivalente di ilettè (IEQ) delle isole spedite dal fornitore dell'isolotto.
- Recuperare le isole dalla spedizione il giorno dell'arrivo dell'isolotto. Eseguire questo passaggio utilizzando un cappuccio per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione.
- Raffreddare il supporto completo dell'isolotto (CMRL-1066, 10% (v/v) FBS, 1x Pen-Strep, 2 mM glutamine) in frigorifero.
- Trasferire le isole dalla bottiglia a un tubo conico da 50 ml.
- Aggiungere 10 mL di supporti completi di isolotto preraffreddati alla bottiglia svuotata per lavare le isole rimanenti. Trasferire il supporto al tubo conico.
- Centrifugare il tubo a 200 x g per 2 min per recuperare le isole. Aspirare il supernatante lasciando circa 1-2 mL media con il pellet.
- Risospendere le isole con supporti isolotti completi pre-raffreddati. In base all'IEQ fornito dal fornitore, aggiungere supporti da 12 mL per 5000 IEQ.
- Versare le isole nei supporti su un piatto di coltura tissutale non trattato di 10 cm. Incubare durante la notte in un'incubatrice di coltura tissutale a 37 gradi centigradi con 5% diCO2 nell'aria atmosferica.
- Dissociare le isole come illustrato di seguito. Eseguire questo passaggio dopo l'incubazione notturna.
- Supporti pre-caldo completi e soluzione di dissociazione cellulare.
- Preparare 1x PBS contenente lo 0,04% di BSA a temperatura ambiente.
- Contare e raccogliere a mano 200-300 isolotti utilizzando una pipetta P200 e trasferire le isole su un tubo conico da 15 mL contenente supporti di isolotto completo preriscaldati da 5 mL.
- Raccogliere le isole con centrifugazione a 200 x g per 2 min. Aspira delicatamente il supernatante senza disturbare il pellet sul fondo.
- Aggiungere 1,0 mL di dissociazione cellulare preriscaldata e interrompere il pellet pipetting delicatamente su e giù. Incubare le isole a 37 gradi centigradi per 9-11 min. Ogni 3 min pipette su e giù lentamente per 10 s per dissociare le cellule in singole cellule.
- Una volta che le cellule dell'isolotto sono ben dissociate e la soluzione diventa torbida, aggiungere un supporto di issololet completo da 9 mL e filtrare attraverso un colino cellulare di 30 m in un nuovo tubo conico da 15 mL.
- Lavare il tubo e il colino cellulare con un supporto di isolotto completo da 2 mL per raccogliere le isole rimanenti e aggiungerle allo stesso tubo.
- Raccogliere le cellule per centrifugazione a 400 x g per 5 min.
- Aspirare delicatamente i supporti e risospendere il pellet cellulare in 5 mL 1x PBS contenente 0,04% BSA (PBS-BSA).
- Filtrare attraverso un nuovo colino da 30 m in un tubo conico da 15 mL e centrifugare a 400 x g per 5 min per raccogliere le cellule.
- Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 200-300 -L 1x soluzione PBS-BSA.
- Misurare la concentrazione delle cellule e regolare il volume ad una concentrazione finale di 400-500 cellule/L.
2. Controllo qualità delle sospensioni a cella singola
- Determinare la concentrazione cellulare utilizzando un contatore cellulare automatizzato basato sulla fluorescenza34 .
- Mescolare 10 celle con 0,5 AO/DAPI. Pipette mescolare accuratamente. Caricare 10,5 l sulla diapositiva ed eseguire il test del conteggio cellulare per determinare il conteggio e la fattibilità.
- Diluire e/o filtrare la sospensione cellulare in base alle esigenze in base al numero di celle.
3. Partizionamento a cella singola utilizzando un chip microfluidico. Seguire il protocollo dal produttore di chip microfluidici35.
- Portare 3' perline di gel e reagenti di trascrizione inversa (RT) a temperatura ambiente (>30 min). Ricostituire l'idera RT nel buffer TE, se necessario.
- Preparare la miscela master RT in un tubo a basso legame come descritto nella tabella 1.
- Determinare il numero di celle da immettere per ogni campione. Calcolare il volume di sospensione cellulare (X) necessario per fornire il numero di cella di destinazione desiderato. Il volume calcolato di acqua priva di nuclenonazione da aggiungere ad ogni campione sarà di 33,8-X L.
- Per ogni campione da partizionare, aggiungere 33,8-X acqua priva di nucle in un tubo a striscia PCR da 0,2 mL. Quindi, aggiungere 66,2 ll mix master per ogni tubo striscia. Non aggiungere le celle al tubo striscia in questo punto. Pipette delicatamente mescolare. Posizionare i tubi a striscia preparati sul ghiaccio.
- Mettere un chip microfluidico in una custodia per chip. Orientare la cassa del chip assicurando che i pozzi di olio (riga etichettata 3) siano più vicini alla persona che esegue l'esperimento.
- Se si esegue meno di 8 campioni, utilizzare il 50% di glicerolo per riempire i canali inutilizzati nel seguente ordine:
- Aggiungere 90 lun del 50% glicerolo nei pozze nella fila 1 per tutti i canali inutilizzati.
- Aggiungere 40 lun del 50% glicerolo nei pozze nella riga 2 per tutti i canali inutilizzati.
- Aggiungere 270 lun del 50% glicerolo nei pozze nella riga 3 per tutti i canali inutilizzati.
- Agganciare le perline di gel in un vortice. Vortex a tutta velocità per 30 s. Toccare la striscia sulla panca più volte per raccogliere perline. Verificare che non siano presenti bolle.
- Aggiungere X-L di cellule nei tubi a strisce preparati. Pipette per mescolare 5 volte. Senza scartare le punte della pipetta, trasferire 90-L di miscela cellulare nella riga 1 del chip.
- Attendere 30 s, quindi caricare 40 gradi L di perline di gel alla fila 2. Pipette molto lentamente per questo passaggio. Distribuisci 270 - L di partizionamento dell'olio ai pozzi della riga 3.
- Agganciare la guarnizione del chip sulle linguette del supporto del chip. Posizionare il supporto del chip assemblato nel dispositivo di partizionamento a cella singola e premere il pulsante esegui.
- Rimuovere immediatamente il supporto del chip assemblato al completamento dell'esecuzione.
- Togliere la guarnizione del truciolo dal supporto, aprire la custodia del chip con un angolo di 45 gradi e rimuovere 100 l'emulsione dal chip in una piastra blu in plastica 96-well.
4. Amplificazione cDNA a cella singola. Seguire il protocollo dal produttore di chip microfluidici35.
- Trascrizione inversa.
NOTA: Eseguire questo passaggio sotto un cappuccio solo PCR pulito per evitare la contaminazione microbica e di altro tipo del cDNA non amplificato.- Sigillare la piastra blu 96-well con un sigillo di stagnola su un sigillante a piastre riscaldate.
- Eseguire la reazione di trascrizione inversa in un ciclore termico come segue: 53 gradi centigradi per 45 min à 85 gradi centigradi per 5 min à 4 gradi centigradi.
NOTA: questo è un punto di arresto sicuro. I campioni possono contenere a 4 gradi centigradi per un massimo di 72 h.
- Purificazione post-RT
- Portare le perle magnetiche leganti acide nucleiche e le perle magnetiche di selezione delle dimensioni dell'acido nucleico alla temperatura ambiente e al vortice per ri-sospendere. A questo punto, scongelare il buffer di pulitura del campione per 10 min a 65 gradi centigradi. Portare tutti gli altri reagenti a temperatura ambiente e vortice.
- Preparare i buffer come illustrato nelle tabelle 2 e nelle tabelle 3.
- Rompere chimicamente l'emulsione e purificare.
- Per farlo, rimuovere delicatamente il sigillo di pellicola dalla piastra.
- Distribuisci 125 l di reagente che rompe l'emulsione rosa in ogni emulsione. Attendere 1 min, quindi trasferire l'intero volume in un tubo striscia pulito 0,2 mL. Assicurarsi che ci sia uno strato di chiaro e uno strato di rosa nel tubo striscia.
- Rimuovere 125 l dello strato rosa dal fondo del tubo striscia senza disturbare lo strato chiaro. È normale che un piccolo volume (15 dollari) dello strato rosa rimanga nel tubo.
- Aggiungere 200 l di pulitura dal tavolo 2 al tubo di strip e incubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Trasferire il tubo a strisce su un supporto magnetico e lasciare che la soluzione si schiarisca. Rimuovere il supernatante e scartare, quindi lavare le perline con l'80% di etanolo due volte. Lasciare asciugare le perline per 1 min.
- Togliere il tubo di striscia dal magnete e aggiungere 35,5 gradi di soluzione di eluizione dal tavolo 3 alle perline. Pipette per risospendere le perline nella soluzione. Incubare per 2 min a temperatura ambiente.
- Trasferire il tubo a strisce su un supporto magnetico e lasciare che la soluzione si schiarisca. Rimuovere il cDNA purificato dal tubo di strip e dispensarlo per pulire i tubi a strisce da 0,2 mL.
- Amplifica il cDNA.
- Preparare il mix master di amplificazione nella tabella 4, di seguito.
- Aggiungete a ogni campione 65 - cDNA Amplification Master Mix. Mettere il tubo a strisce in un ciclore termico ed eseguire il seguente programma: 98 c 3 min à 15 cicli di [98 s 15 s à 67 C 20 s à 72 C 1 min] à 72 c 5 min à 4 .
NOTA: questo è un punto di arresto sicuro. I campioni possono essere detenti fino a 4 oC per un massimo di 72 h. - Purificare il cDNA amplificato con perline magnetiche di selezione dell'acido nucleico 0,6x. Lavare due volte con l'80% di etanolo ed elutare con 40,5 l.
- Eseguire il cDNA di controllo qualità utilizzando l'elettroforesi automatica del gel e il test di quantificazione del DNA basato sulla fluorescenza36,37.
NOTA: questo è un punto di arresto sicuro. I campioni possono contenere fino a 4 gradi centigradi per un massimo di 72 h o a -20oC a tempo indeterminato.
5. Costruzione della biblioteca di sequenziamento
- Tagmentation e pulizia di cDNA38.
- Normalizzare cDNA a 50 ng in 20 gradi del volume totale. La quantificazione esatta è fondamentale in questo passaggio.
- Fare il mix di tagmentation nella tabella 5 e 30 per ogni campione di cDNA da 20 gradi sul ghiaccio. Mettere i campioni nel ciclore termico ed eseguire il protocollo di tagmentation: 55 c 5 min à 10 gradi centigradi.
- Eseguire la pulizia del cDNA con tag mediante le colonne38. Aggiungere 180 buffer di legatura del DNA l per ogni campione. Trasferire 230 l in una colonna di spin.
- Centrifuga a 1300 x g per 2 min e scartare il flusso attraverso.
- Lavare due volte con 300 tamponi di lavaggio del DNA. Centrifugare un ulteriore 2 min a 1300 x g per garantire la rimozione dell'etanolo.
- Elute ha purificato il cDNA con l'aggiunta di 31 L di tampone di eluizione alla colonna e incubare a temperatura ambiente per 2 min.
- Centrifuga per 2 min a 1300 x g per recuperare il prodotto purificato.
- Indice di esempio PCR.
- Scegliere codici a barre che non si sovrappongono durante una sequenza multiplexata.
- Creare una combinazione master PCR di indice di esempio, come illustrato nella Tabella 6.
- Aggiungere 60 -L di Sample Index PCR master mix a 30 .
- Aggiungete 10 -L di un indice campione di 20 m e 4 oligo ad ogni campione (indice di registrazione utilizzato). Il volume di reazione totale è ora di 100.
- Mettere in un ciclore termico con il coperchio impostato a 105 gradi centigradi. Eseguire il seguente programma: 98 c 45 s à 12-14 cicli di [98 c 20 s à 54 .C 30 s à 72 s 20 s] à 72 c 1 min à 4 .
NOTA: questo è un punto di arresto sicuro. I campioni possono contenere a 4 gradi centigradi per un massimo di 72 h.
- Purificare le librerie con doppia pulizia del tallone.
- Aggiungere al campione 100 l di dimensioni dell'acido nucleico per raggiungere il campione e mescolare accuratamente con una pipetta. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Trasferire su un magnete e lasciarlo riposare fino a quando la soluzione non si schiarisce. Rimuovere e scartare il super-natante.
- Lavare due volte con 200 l di 80% di etanolo.
- Asciugare le perline sul magnete per 2 min. Rimuovere dal magnete e aggiungere 50,5 L di EB Buffer al pellet di perline. Pipette per sospendere nuovamente le perline nel buffer.
- Incubare a temperatura ambiente per 2 min. Trasferire su un magnete e lasciare riposare per 2 min.
- Aggiungere 40 perline magnetiche di selezione delle dimensioni dell'acido nucleico al campione e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Trasferire su un magnete e lasciare la soluzione libera. Rimuovere e scartare supernatante.
- Lavare due volte con 125 l2 dell'80% di etanolo.
- Asciugare le perline sul magnete per 2 min. Rimuovere dal magnete e aggiungere 60,5 l di EB Buffer al pellet di perline. Pipette per sospendere nuovamente le perline nel buffer.
- Incubare a temperatura ambiente per 2 min. Trasferire su un magnete e lasciarlo riposare per 2 min. Questa è la biblioteca finale.
- Conservare i campioni a 4 gradi centigradi per un massimo di 72 h o a -20 gradi centigradi a tempo indeterminato. Si noti che si tratta di un punto di arresto sicuro.
- Quantificare ed eseguire il controllo di qualità delle librerie finali utilizzando l'elettroforesi automatica del gel e il test di quantificazione del DNA basato sulla fluorescenza36,37. Diluire i campioni 1:10 prima di eseguire il controllo di qualità.
6. Sequenza delle librerie
- Normalizzare ogni campione da sequenziare a 2 ng/-L e pool 3 - L di ogni campione normalizzato insieme.
- Misurare la concentrazione della piscina con il saggio di quantificazione del DNA basato sulla fluorescenza37.
- Diluire la piscina a 0,25 ng/L.
- Denaturare la piscina come segue: 12 l di diluito campione raggruppato (0,25 ng/L) : 1 controllo del DNA ll (1 nM), 2 Buffer EB L - 5 N. L NaOH (0,4N). Lasciare incubare per 5 min, quindi aggiungere 10 L di 200 mM Tris pH 8.0.
- Caricare 4,05 l in 1345,95 HT1. Caricare 1,3 mL nella cartuccia del sequencer ed eseguire secondo le linee guida del produttore39 utilizzando una ricetta di sequenziamento con 26 cicli (Lettura 1) - 8 cicli (indice i7) - 0 cicli (indice i5) - 55 cicli (Lettura 2).
7. Allineamento di lettura (file supplementare 1)
- Eseguire Cell Ranger (v2.0.0) per demultiplex file di chiamata di base raw (BCL) generati dalla sequenza in file FASTQ. Allineare i file FASTQ all'assembly del genoma B37.3 umano e al modello genico UCSC per ottenere la quantificazione dell'espressione.
- Controllo della qualità dell'allineamento.
- Generare metriche di allineamento e controllare le basi Q30, la frazione di codice a barre valida, la frazione di lettura associata alle celle, la frazione di lettura mappata e le letture rilevate in ogni cella.
- Esaminare il grafico di classificazione dei codici a barre per assicurarsi che la separazione dei codici a barre associati alle celle e dello sfondo.
8. Analisi dei dati (file supplementare 2)
- Controllo e pre-elaborazione della qualità delle celle.
- Escludere le celle con < 500 geni rilevati, < 3000 numero totale di identificatori molecolari univoci (UMI), > 0,2 punteggidi fattibilità come descritto in precedenza32. Regolare i tagli in base ai tipi di tessuto e cellule.
- Rimuovere i doppietti.
- Valutare i cinque geni dell'ormone endocrino (glucagone - GCG,insulina - INS, somatostatina - SST, polipeptide pancreatica - PPYe grelina - GHRL) per il modello di espressione bimodale (modalità alta e bassa espressione) utilizzando R pacchetto mclust40.
- Rimuovere le cellule che esprimono più di un gene ormonale, cioè con due o più geni ormonali nella modalità ad alta espressione.
- Normalizzare l'espressione genica per l'UMI totale e moltiplicare per il fattore di scala di 10.000 a livello di cella utilizzando il pacchetto R Seurat41.
- Rimuovere i geni rilevati in meno di 3 cellule.
- Rileva geni variabili usando l'espressione media e la dispersione di tutte le cellule. Regolare i tagli in base ai tipi di tessuto e cellule.
- Eseguire l'analisi del componente principale con i geni variabili. Raggruppare le celle con il numero selezionato di componenti principali. Derivageni arricchiti a grappolo cellulare confrontando un cluster di cellule con il resto delle cellule.
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Representative Results
Il flusso di lavoro di sequenziamento dell'RNA a cella singola è costituito da tre passaggi: dissociare le isole umane intatte in sospensione a singola cellula, acquisire singole cellule utilizzando una tecnologia basata su goccia e analizzare i dati RNA-seq (Figura 1). In primo luogo, le isole umane acquisite sono state incubate durante la notte. Gli isolotti intatti sono stati esaminati al microscopio (Figura 2A). L'integrità delle cellule di isolotto dissociate è stata convalidata utilizzando la fluorescenza dell'RNA nell'ibridazione situ (RNA-FISH). Come illustrato nella Figura 2B, le cellule dissociate dissociate , ovvero le cellule di ssociate, sono state visualizzate utilizzando rispettivamente le sonde di mRNA GCG e INS.
Il numero di celle e la fattibilità devono essere determinati prima della fase di acquisizione a cella singola. Le cellule a bassa vitalità o detriti elevati non sono adatte per un'ulteriore lavorazione. Una buona concentrazione cellulare varia di solito da 400 a 500 celle/L. Circa 6000 cellule sono state caricate nel chip microfluidico nella fase di partizionamento a singola cellula, e 100 l di perline di gel in emulsione sono state rimosse dal chip. Figura 3A esemplifica un esempio di emulsione corretta dopo il passaggio di partizionamento. Il liquido in ogni punta di pipetta è uniforme pallido nuvoloso con olio di partizionamento minimo separato dalle perline di gel. Al contrario, la figura 3B mostra un'emulsione di scarsa qualità con una chiara separazione di fase tra le perline di gel e l'olio. Ciò potrebbe essere dovuto a un intasamento durante l'esecuzione del chip.
Dopo il partizionamento a cella singola, è stata eseguita l'amplificazione cDNA. Figura 4A illustra una distribuzione rappresentativa delle dimensioni dei frammenti dopo l'amplificazione cDNA. Il picco tipico per un campione di cDNA di buona qualità risiedeva vicino a 1000-2000 bp. È interessante notare che un picco vicino a 600 bp era specifico per l'isolotto cDNA. La distribuzione delle dimensioni dei frammenti per le librerie RNA-seq era compresa tra 300 e 500 bp (Figura 4B).
Dopo il sequenziamento, abbiamo impiegato una serie di metriche di allineamento di lettura per valutare la qualità dei dati RNA-seq a singola cella (Tabella 7). Le prime tre metriche hanno ben riassunto la qualità della libreria di sequenziamento a cella singola. In media, il 92% delle letture derivava da celle intatte e il 72% delle letture veniva mappato a esoni. Di tutte le letture di esoni catturati in goccioline, il 90% di esse sono state prodotte da cellule intatte e il resto era probabilmente RNA ambientali in goccioline prive di cellule. Queste metriche di allineamento suggeriscono una buona qualità dei dati. Il rapporto tra letture esone e UMI era una misura empirica per valutare la saturazione del sequenziamento e di solito, il rapporto 10:1 era un buon indicatore. Inoltre, il numero di geni rilevati (UMI > 0) è stata una caratteristica utile per caratterizzare diversi tipi di cellule. Per le cellule dell'isolotto umano, il numero di geni rilevati è di circa 1.900 in ogni cellula.
Abbiamo sequenziato un totale di 20.811 cellule di istono da 12 donatori non diabetici. Espressione di più di un ormone è stato rilevato in circa 6% delle cellule. Queste cellule multiormonali sono molto probabilmente doppietti perché il nostro lavoro precedente ha mostrato che meno di < 0,1% delle cellule a singola isolotto co-espresso più di un ormone endocrino33. Abbiamo rimosso tutte le cellule multiormonali identificate. È inoltre importante escludere le cellule di bassa qualità in base all'UMI totale, ai geni rilevati e alla redditività cellulare33. Dopo queste fasi di controllo della qualità, 19.174 sono rimasti per ulteriori analisi. L'analisi di raggruppamento ha rivelato 12 tipi di cellule: cellule di ecclesazione, acinar, pp, cellule, acinari, duttali, quiescenti, stellate attivate, endoteliali, macrofagie e mastociti (Figura5). Come previsto, le cellule endocrine erano la maggioranza (tabella8). I geni più arricchiti nelle cellule a zON (ad esempio, GCG, TTR, CRYBA2, TM4SF4, TMEM176B) e le cellule di z (ad esempio, IAPP, INS, HADH, DLK1, RBP4) sono coerenti con altri studi13,15,16,17,18,20,21,22,29 ,30,31,33. È interessante notare che, sia le cellule z e z consistevano di diverse sottopopolazioni. Tre sottopopolazioni di cellule z, Beta sub1, 2 e 3, erano simili con un piccolo numero di geni arricchiti con sottopopolazione (18 in Beta sub1, 33 in Beta sub 2 e 18 in Beta sub 3). Il quarto sottopopolazione aveva 488 geni arricchiti. La piccola sottopopolazione di cellule a z ,Alpha sub3) comprendeva cellule proliferanti, caratterizzate da un'espressione arricchita di MKI67, CDK1e TOP2A.
Figura 1: Diagramma schematico del flusso di lavoro di sequenziamento dell'RNA a cella singola. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini rappresentative di isolotti umani intatti e dissociati. (A) Un'immagine di isolette scattate dopo un'incubazione notturna. (B) Cellule di isolotto dissociate visualizzate dalla colorazione RNA-FISH per INS (bianco) e GCG (rosso). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esame della qualità dell'emulsione a cella singola prima della trascrizione inversa. (A) Un'emulsione unicellulare di buona qualità. Il liquido in ogni punta della pipetta era omogeneamente torbida. (B) Un'emulsione a singola cellula di scarsa qualità. Il liquido nella punta della pipetta non era omogeneo e mostrava una separazione tra olio e perline di gel. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Esame della qualità del cDNA e della biblioteca a cella singola. (A) Tracce cDNA rappresentative. Questo cDNA era di buona qualità e resa, con il picco principale per il campione che si verifica vicino a 1000-2000 bp. Il picco nella traccia di circa 600 bp era tipico e distintivo di isolotto cDNA. (B) Una traccia rappresentativa della libreria di sequenziamento finale. Questa libreria era di buona qualità e resa, con il picco principale che si verificatra tra 300-500 bp. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Tipi di cellule e sottopopolazioni identificate nel sequenziamento di RNA unicellulari di isole pancreatiche umane. Le cellule erano raggruppate da tipi di cellule distintive nello spazio delle dimensioni di incorporamento del vicino stocastico distribuito t (tSNE). L'analisi ha anche rivelato tre sottopopolazioni di cellule z e quattro in cellule z. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome agente | Vol. da usare (L) per reazione |
| Miscela reagente RT | 50 anni |
| Primer RT | 3.8 (IN linguaggio utente) |
| Additivo A | 2.4 (in questo stato del documento in questo |
| Miscela di enzimi RT | 10 del sistema |
| totale | 66.2 |
Tabella 1: combinazione di trascrizioni inversa.
| Nome agente | Volume da utilizzare (uL) per reazione |
| Acqua priva di nucle | 9 (in vie |
| Pulizia campione buffer 1 | 182 del sistema |
| Dinamidi MyOne Silane | 4 DEL psu' |
| Additivo A | 5 Del numero 3( |
| totale | 200 anni |
Tabella 2: Combinazione di pulizia.
| Nome agente | Volume da utilizzare (uL) per reazione |
| Buffer EB | 98 (di base) |
| 10% Tween 20 | 1 : il nome del |
| Additivo A | 1 : il nome del |
| totale | 100 del sistema |
Tabella 3: Soluzione di eluzione.
| Nome agente | Volume da utilizzare (uL) per reazione |
| Acqua priva di nucle | 8 (IN vio |
| Miscela Master di Amplificazione | 50 anni |
| Additivo cDNA | 5 Del numero 3( |
| miscela cDNA Primer | 2 Il nome del sistema |
| totale | 65 ( : il nome del |
Tabella 4: mix di amplificazione cDNA.
| Nome agente | Volume da utilizzare (L) per reazione |
| Enzima tagmentation | 5 Del numero 3( |
| Buffer di tagment | 25 mi lato |
| totale | 30 milio |
Tabella 5: Combinazione di tag.
| Nome agente | Volume da utilizzare (L) per reazione |
| Acqua priva di nucle | 8 (IN vio |
| Miscela Master di Amplificazione | 50 anni |
| Primer SI-PCR | 2 Il nome del sistema |
| totale | 60 del sistema |
Tabella 6: Esempio di indice PCR master mix.
| ID di esempio | % letture con codici a barre di cella validi | % di letture di eson nelle celle catturate tra le celle totali | % Letture ex tra letture totali | Letture medi di Exon per cella | UMI mediana per cella | Geni mediani per cellula |
| Campione 1 | 92% | 93% | 76% | 142.015 | 10.310 | 1.747 |
| Campione 2 | 92% | 91% | 74% | 151.395 | 11.350 | 1.754 |
| Campione-3 | 94% | 92% | 75% | 120.538 | 19.604 | 2.180 |
| Campione-4 | 95% | 93% | 67% | 160.657 | 11.870 | 2.111 |
| Campione-5 | 94% | 92% | 62% | 177.809 | 13.821 | 2.288 |
| Campione 6 | 95% | 89% | 67% | 138.208 | 8.235 | 1.296 |
| Campione-7 | 94% | 89% | 72% | 147.484 anni | 13.606 | 2.272 |
| Campione 8 | 94% | 91% | 69% | 159.793 | 9.505 | 1.865 |
| Campione-9 | 95% | 92% | 72% | 168.436 | 12.794 anni | 2.389 |
| Campione 10 | 83% | 83% | 74% | 88.067 | 13.323 | 1.805 |
| Campione 11 | 82% | 88% | 77% | 67.752 | 9.295 | 1.278 |
| Campione 12 | 91% | 85% | 74% | 194.781 anni | 14.877 | 1.746 (in inglese) |
Tabella 7: Leggere le metriche di allineamento.
| Tipo di cella | Numero di celle | Cellule Ave. per donatore (deviazione standard) |
| alfa m inv f inv | 6546 | 546 (258) |
| Beta | 7361 | 613 (252) |
| delta m inv | 922 (in questo stato del | 77 (37) |
| Pp | 545 anni | 45 (25) |
| Epsilon | 11 Del sistema di | 1 (1) |
| Acinose | 836 | 70 (71) |
| Ductal | 1313 | 109 (95) |
| Quiescent stellato | 225 (di sistema) | 19 (14) |
| Attivato stellato | 890 890 | 74 (58) |
| Endoteliale | 408 (in questo stato del sistema) | 34 (21) |
| Macrofago | 80 | 7 (6) |
| Schwann | 37 Mi lasa' di | 3 (3) |
Tabella 8: Composizione di tipo cella. Numero totale di cellule per ogni tipo di cellula e cellule medie per ogni donatore in ogni tipo di cellula.
File supplementare 1: comandi utilizzati per l'allineamento della sequenza. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 2: R script per eseguire il controllo della qualità delle cellule, il clustering cellulare e per identificare i geni arricchiti di tipo cellulare. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Le tecnologie a cella singola sviluppate negli ultimi anni forniscono una nuova piattaforma per caratterizzare i tipi di cellule e studiare l'eterogeneità molecolare nelle isole pancreatiche umane. Abbiamo adottato un protocollo di isolamento microfluidico a singola cellula basato sulle goccioline e analisi dei dati per studiare le isole umane. Il nostro protocollo ha prodotto con successo dati di sequenziamento dell'RNA da oltre 20.000 singole cellule di istolette umane con variazioni relativamente piccole nella qualità della sequenza e negli effetti batch.
In particolare, due passaggi sono fondamentali in questo protocollo per risultati di alta qualità. Occorre prestare attenzione quando si dissociano le isole umane. È importante non digerire eccessivamente le isole. Il partizionamento a cella singola è un altro passaggio chiave per un esperimento a cella singola riuscito. Abbiamo dimostrato esempi di emulsioni di buona e scarsa qualità in Figura 3. Una chiara emulsione è di solito un indicativo di un numero inadeguato di cellule raccolte nella fase di partizionamento.
L'accesso alle isole umane primarie isolate è un passo che limita il tasso per generare trascrittomi unicellulari su larga scala. Le isole isolate dei singoli donatori di cadaveri vengono di solito trattate in momenti diversi, pertanto i potenziali effetti in batch dipendenti dal campione devono essere attentamente esaminati durante l'analisi dei dati. L'analisi integrativa può essere utilizzata per identificare i tipi di cellule e le sottopopolazioni comuni tra i singoli lotti41. L'effetto batch può anche essere regolato in base alla quantificazione dell'espressione corretta in batch42. Un'altra sfida per analizzare i dati RNA-seq a singola cellula consiste nell'identificare i doppi. Nella pre-elaborazione dei dati, abbiamo preso misure per rimuovere i doppi endocrini doppie identificando le cellule che esprimono più geni ormonali (GCG, INS, SST, PPYe GHRL). L'identificazione di doppietti formati da due diversi tipi di cellule è un compito relativamente facile a causa dell'espressione estremamente alta degli ormoni endocrini. La vera sfida consiste nell'identificare i doppi enotietti all'interno delle cellule, ad esempio i doppietti con due cellule z. Poiché un numero maggiore di geni rilevati è un numero maggiore di geni rilevati, una soluzione consiste nel rimuovere gli outlier con un numero elevato di geni e UMI durante il passaggio QC della cellula. Inoltre, sono disponibili strumenti per rilevare i doppi sono disponibili43,44,45.
Una delle principali limitazioni del sequenziamento dell'RNA a cellule singole è la bassa sensibilità. Utilizzando RNA del Consorzio di controllo esterno dell'RNA (ERCC) a picco, abbiamo stimato che solo il 10% di tutti i geni espressi sono stati rilevati utilizzando il protocollo attuale e che quelli rilevati erano orientati verso geni ad alta abbondanza46. Le cellule endocrine pancreatiche esprimono un livello estremamente elevato di geni ormonali (ad esempio, GCG, INS, SSTe PPY). Di conseguenza, gli mRNA di questi geni hanno il rischio di diventare RNA ambientale. Tali rumori di fondo non possono essere completamente evitati. Tuttavia, questo protocollo passo-passo aiuterà i ricercatori a ridurre al minimo i rumori sperimentali indesiderati. Il protocollo attuale è progettato per tessuti appena isolati. Altre tecnologie, come il sequenziamento dell'RNA mononucleoso47,48, sono disponibili per RNA-seq di tessuti freschi, congelati o leggermente fissi. Inoltre, una tecnologia di hash delle cellule recentemente sviluppata49 può essere considerata come un protocollo microfluidico avanzato a cella singola che consente il multiplexing del campione.
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Disclosures
Tutti gli autori sono dipendenti e azionisti di Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Acknowledgments
nessuno
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
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