Summary
여기서, 우리는 액적 기반 의 미세 유체 단일 세포 RNA 염기서열 분석 기술을 사용하여 단면 췌도로부터 단일 세포의 고품질, 대규모 전사체 데이터를 생성하는 프로토콜을 제시한다.
Abstract
췌도는 독특한 호르몬 발현 패턴을 가진 내분비 세포로 구성됩니다. 내분비 세포는 정상 및 병리학 적 조건에 대한 응답에서 기능적 차이를 보여줍니다. 이 프로토콜의 목표는 액적 기반 미세 유체 단일 세포 RNA 염기서열 분석 기술을 사용하여 각 내분비 세포 유형의 고품질, 대규모 전사체 데이터를 생성하는 것입니다. 이러한 데이터는 정상 또는 특정 조건에서 각 내분비 세포 유형의 유전자 발현 프로필을 구축하는 데 활용될 수 있다. 이 공정에는 신중한 취급, 정확한 측정 및 엄격한 품질 관리가 필요합니다. 이 프로토콜에서는 인간 췌도 해리, 시퀀싱 및 데이터 분석을 위한 자세한 단계를 설명합니다. 약 20,000개의 인간 단일 아일렛 세포의 대표적인 결과는 프로토콜의 성공적인 적용을 입증한다.
Introduction
췌 장 섬 혈액 포도 당 수준을 조절 하는 내 분 비 호르몬을 해제. 기능적으로 그리고 형태학적으로 다른 5개의 내분비 세포 모형은, 이 필수적인 역할에 관여합니다: α 세포는 글루카곤, β 세포 인슐린, δ 세포 소마토스타틴, PP세포 췌장 폴리펩티드 및 θ 세포 그렐린 1을 생성합니다. 유전자 발현 프로파일링은 정상 또는 특정 조건에서 내분비 세포를 특성화하는 유용한 접근법이다. 역사적으로, 전체 아일렛 유전자 발현 프로파일링은 마이크로어레이 및 차세대RNA 시퀀싱 2, 3,4,5,6,7을 사용하여 생성되었다. , 8.전체 아일렛 전사체는 장기 특이적 전사체 및 질병 후보 유전자를 식별하는 데 유익하지만, 각 아일렛 세포 유형의 분자 이질성을 밝히지 못한다. 레이저 포획 미세 해부 (LCM) 기술은 섬9,10,11,12에서 특정 세포 유형을 직접 얻기 위해 적용되었지만 표적 세포의 순도에 미치지 못합니다. 인구. 이러한 한계를 극복하기 위해, 형광 활성화 세포 선별(FACS)은 α-및 β세포(13,14,15,16)와 같은 특정 내분비 세포 집단을 선택하는 데 사용되어 왔다. , 17세 , 18. 또한, Dorrell 외. 4 개의 하위 집단으로 β 세포를 분류하는 항체 기반 FACS 분류 접근 방식을 사용19. FACS-정렬 된 섬 세포는 또한 단일 세포의 RNA 시퀀싱을 위해 도금 될 수 있습니다. 그러나 플레이트 기반 방법은 확장성20,21,22에서어려움을 겪습니다.
각 내분비 세포 유형의 고품질, 대규모 전사체 데이터를 생성하기 위해 인간 아일렛 세포에 미세 유체 기술을 적용했습니다. 미세 유체 플랫폼은 높은 처리량, 고품질 및 확장 가능한 방식으로 많은 수의 단일 셀로부터 전사체 데이터를 생성합니다23,24,25,26,27. 다량으로 포획된 세포 유형의 분자 특성을 밝히는 것 외에도, 확장성이 뛰어난 미세 유체 플랫폼은 충분한 세포가 제공될 때 희귀 세포 유형을 식별할 수 있게 합니다. 따라서, 인간 췌도에 플랫폼을 적용하면 그렐린 분비 σ-세포의 프로파일링을 허용하인데, 그 희소성(28)으로 인해거의 알려지지 않은 기능을 가진 희귀한 내분비 세포 유형이다. 최근 몇 년 동안, 여러 연구는 기술29,30,31,32를사용하여 인간 작은 섬의 대규모 전사 데이터를보고 우리와 다른 사람에 의해 출판되었다, 33. 데이터는 내분비 세포 이질성과 질병에 미치는 영향을 연구하기 위해 아일렛 커뮤니티를 위해 공개적으로 사용할 수 있고 유용한 자원입니다.
여기에서, 우리는 α-, β-, δ-, PP, 및 비내분비 세포의 더 작은 비율을 포함하여 대략 20,000개의 인간 적인 작은 islet 세포의 전사체 데이터를 생성하기 위하여 이용된 액적계 미유체 단세포 RNA 염기서열 분석 프로토콜을 기술합니다 32. 워크플로는 고립 된 인간 섬으로 시작하여 섬 세포 해리, 단일 셀 캡처 및 데이터 분석의 단계를 묘사합니다. 이 프로토콜은 갓 분리된 섬을 사용해야 하며 설치류와 같은 인간 및 기타 종의 섬에 적용할 수 있습니다. 이 워크플로우를 사용하여 기준선 및 기타 조건에서 편견없고 포괄적인 아일렛 셀 아틀라스를 구축할 수 있습니다.
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Protocol
1. 인간 섬 해리
- 특정 인구 통계학을 가진 기증자의 작은 섬이 연구 목적을 위해 요구되지 않는 한, 15-80 년 사이, 어느 성의 시체 기관 기증자로부터 고립 된 인간의 섬을 얻을, 기존의 질병없이.
- 격리 후, 분리된 섬을 공급업체에서 2-3일 동안 조직 배양 시설에 보관한다. 종종 아일렛 손상이 보이려면 1 일 이상 걸립니다.
- 작은 섬을 병에 담고 섬 매체에 완전히 담그십시오. 하룻밤 선적에 의해 실험실에 그것을 얻을.
- 섬 공급 업체에서 선적 된 작은 섬의 섬 등가 물량 (IEQ)을 가져옵니다.
- 섬 도착 당일 발송물에서 섬을 회수하십시오. 후드를 사용하여 이 단계를 수행하여 오염 가능성을 최소화합니다.
- 냉장고에서 전체 아일렛 매더(CMRL-1066, 10% (v/v) FBS, 1x 펜 스트렙, 2mM 글루타민)을 식힙니다.
- 병에서 50 mL 원엽 튜브로 섬을 옮김을 옮김.
- 비어 있는 병에 10 mL 미리 냉각된 완전한 섬 매체를 추가하여 나머지 섬을 씻어내십시오. 미디어를 원유관으로 옮김을 전달합니다.
- 200 x g에서 2 분 동안 튜브를 원심 분리하여 섬을 복구합니다. 상급체를 흡기하여 펠릿과 함께 약 1-2 mL 용지를 남긴다.
- 미리 냉각된 완전한 섬 매체로 섬을 다시 일시 중단합니다. 공급업체가 제공하는 IEQ를 기반으로 5000 IEQ당 12mL 미디어를 추가합니다.
- 10cm 비처리 조직 배양 접시에 매체에 작은 섬을 붓는다. 대기 중의 5% CO2로 37°C에서 조직 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양한다.
- 아래와 같이 아일렛을 해리합니다. 하룻밤 배양 후이 단계를 수행합니다.
- 사전 온난 완전 섬 매체 및 세포 해리 솔루션.
- 실온에서 0.04% BSA를 함유하는 1x PBS를 준비합니다.
- P200 파이펫을 사용하여 200-300개의 섬을 수작업으로 선택하고 5mL 미리 온열된 완전 섬 매체를 포함하는 15mL 원엽 튜브로 섬을 옮김을 수작업으로 채취합니다.
- 200 x g에서 2 분 동안 원심 분리로 섬을 수집하십시오.
- 1.0 mL 미리 가열된 세포 해리 액을 추가하고 부드럽게 위아래로 파이펫팅하여 펠릿을 방해합니다. 9-11 분 동안 37 °C에서 섬을 배양하십시오. 3분마다 피펫을 천천히 위아래로 10초 동안 단일 세포로 분리합니다.
- 일단 아일렛 세포가 잘 해리되고 용액이 흐리게 되면, 9 mL 완전한 아일렛 매체를 추가하고 새로운 15 mL 원엽 튜브에 30 μm 세포 스트레이너를 통해 여과합니다.
- 튜브 및 셀 스트레이너를 2 mL 완전 아일렛 매체로 세척하여 나머지 섬을 수집하고 동일한 튜브에 추가합니다.
- 5 분 동안 400 x g에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다.
- 부드럽게 방수 및 0.04% BSA (PBS-BSA)를 포함하는 5 mL 1x PBS에 세포 펠렛을 다시 중단.
- 새로운 30 μm 세포 스트레이너를 통해 15 mL 원엽 튜브 및 원심 분리기를 400 x g에서 5 분 동안 걸레질하여 세포를 수집합니다.
- 상월체를 흡인하고 200-300 μL 1x PBS-BSA 용액에서 세포 펠릿을 재중단시켰다.
- 세포 농도를 측정하고 400-500 세포 / μL의 최종 농도로 볼륨을 조정합니다.
2. 단세포 현탁액 품질 관리
- 형광계 자동세포 카운터(34)를 이용하여세포 농도를 측정한다.
- 10 μL 세포를 0.5 μL AO/DAPI와 혼합합니다. 파이펫은 철저히 섞습니다. 슬라이드에 10.5 μL을 로드하고 셀 카운트 분석기를 실행하여 개수와 생존 가능성을 결정합니다.
- 셀 수에 따라 필요에 따라 셀 현탁액을 희석 및/또는 필터링합니다.
3. 미세 유체 칩을 사용하여 단일 셀 분할. 미세 유체 칩 제조 업체(35)의프로토콜을 따르십시오.
- 3' 젤 비드와 역전사(RT) 시약을 실온으로 가져옵니다(>30분). 필요한 경우 TE 버퍼에서 RT 프라이머를 재구성합니다.
- 표1에 설명된 대로 낮은 바인드 튜브에 RT 마스터 믹스를 준비합니다.
- 각 샘플에 대해 입력할 셀 수를 결정합니다. 원하는 대상 셀 번호를 전달하는 데 필요한 셀 서스펜션 부피(X)를 계산합니다. 각 샘플에 첨가할 뉴클레아제 없는 물의 계산된 부피는 33.8-X μL일 것이다.
- 분할될 각 시료에 대해 33.8-X μL 뉴클레아제 없는 물을 0.2 mL PCR 스트립 튜브에 추가합니다. 그런 다음 각 스트립 튜브에 66.2 μL 마스터 믹스를 추가합니다. 이 시점에서 스트립 튜브에 셀을 추가하지 마십시오. 파이펫을 부드럽게 섞어 주세요. 준비된 스트립 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
- 미세 유체 칩을 칩 케이스에 넣습니다. 유정(행 라벨이 3행)이 실험을 수행하는 사람과 가장 가까운지 확인하는 칩 케이스의 방향을 지정합니다.
- 8개 미만의 샘플을 실행하는 경우 50% 글리세롤을 사용하여 사용하지 않는 채널을 다음 순서로 채웁니다.
- 사용하지 않은 모든 채널에 대해 1열의 우물에 50% 글리세롤 의 90 μL을 추가하십시오.
- 사용하지 않은 모든 채널에 대해 2열의 웰에 50% 글리세롤 40 μL을 넣으세요.
- 사용하지 않은 모든 채널에 대해 3열의 웰에 50% 글리세롤 270 μL을 추가합니다.
- 젤 비드를 소용돌이에 끼습니다. 30 초 동안 최고 속도로 소용돌이. 구슬을 수집하기 위해 벤치 상단에 스트립을 여러 번 누릅니다. 거품이 없는지 확인합니다.
- 준비된 스트립 튜브에 X μL의 세포를 추가합니다. 파이펫을 5번 섞어 보시고 다트하세요. 파이펫 팁을 버리지 않고 90 μL의 셀 혼합물을 칩의 행 1로 옮니다.
- 30s를 기다린 다음 40 μL의 젤 비드를 행 2에 로드합니다. 이 단계에 대 한 매우 느리게 파이펫. 행 3의 우물에 분할 오일 270 μL을 분배합니다.
- 칩 개스킷을 칩 홀더의 탭에 연결합니다. 조립된 칩 홀더를 단일 셀 분할 장치에 넣고 실행 버튼을 누릅니다.
- 실행이 완료되면 조립된 칩 홀더를 즉시 제거합니다.
- 홀더에서 칩 개스킷을 제거하고 칩 케이스를 45° 각도로 열고 칩에서 에멀젼 100 μL을 파란색 플라스틱 96 웰 플레이트로 제거합니다.
4. 단세포 cDNA 증폭. 미세 유체 칩 제조 업체(35)의프로토콜을 따르십시오.
- 역전사.
참고: 깨끗한 PCR 전용 후드 아래에서 이 단계를 수행하여 증폭되지 않은 cDNA의 미생물 및 기타 오염을 방지합니다.- 가열 된 플레이트 실러에 호일 씰로 96 웰 블루 플레이트를 밀봉하십시오.
- 열 사이클러에서 역전사 반응을 실행한다: 53°C에 대해 45 분 à 85°C에 대해 5 분 à 4°C 홀드.
참고: 이것은 안전한 중지 지점입니다. 시료는 최대 72시간 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
- RT 후 정화
- 핵산 결합 자기 비드 및 핵산 크기 선택 자기 비드를 실온및 와류에 가져와 다시 현탁한다. 이 때, 65°C에서 10분 동안 시료 정리 버퍼를 해동한다. 다른 모든 시약을 실온과 소용돌이로 가져오십시오.
- 테이블 2 및 표 3에 표시된 대로 버퍼를 준비합니다.
- 화학적으로 에멀젼을 깨고 정화.
- 이렇게 하려면 플레이트에서 호일 씰을 부드럽게 제거합니다.
- 각 에멀젼에 분홍색 에멀젼 파괴 시약 125 μL을 분배합니다. 1 분 동안 기다린 다음 전체 볼륨을 깨끗한 0.2 mL 스트립 튜브로 옮김하십시오. 스트립 튜브에 명확한 분홍색층이 있는지 확인하십시오.
- 투명 층을 방해하지 않고 스트립 튜브 의 바닥에서 분홍색 층의 125 μL을 제거합니다. 분홍색 층의 작은 부피(~15 μL)가 튜브에 남아 있는 것은 정상입니다.
- 표 2에서 스트립 튜브에 200 μL의 클린업 믹스를 넣고 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
- 스트립 튜브를 마그네틱 스탠드로 옮기고 용액을 지울 수 있습니다. 상급제를 제거하고 폐기한 다음 80% 에탄올로 구슬을 두 번 씻습니다. 구슬이 1분 동안 건조되도록 합니다.
- 자석에서 스트립 튜브를 제거하고 표 3에서 35.5 μL의 용출 액을 구슬에 추가합니다. 파이펫은 용액의 비드를 다시 일시 중단합니다. 실온에서 2 분 동안 배양하십시오.
- 스트립 튜브를 마그네틱 스탠드로 옮기고 용액을 지울 수 있습니다. 스트립 튜브에서 정제 된 cDNA를 제거하고 0.2 mL 스트립 튜브를 청소하기 위해 분배하십시오.
- cDNA를 증폭합니다.
- 아래 표4에서 증폭 마스터 믹스를 준비합니다.
- 각 샘플에 cDNA 증폭 마스터 믹스 65 μL을 추가합니다. 스트립 튜브를 열 사이클러에 놓고 다음 프로그램을 실행하십시오: [98 °C 15 s à 67 °C 20 s à 72 °C 1 분] à 72 °C 5 분 à 4 °C 홀드의 98 °C 3 분 à 15 사이클
참고: 이것은 안전한 중지 지점입니다. 시료는 최대 72시간 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다. - 0.6배 핵산 크기 선택 자기 비드로 증폭된 cDNA를 정화합니다. 80% 에탄올로 두 번 씻고 40.5 μL로 용해하십시오.
- 자동화된 겔 전기영동 및 형광계 DNA 정량 분석분석36,37을이용하여 품질관리 cDNA를 실행한다.
참고: 이것은 안전한 중지 지점입니다. 시료는 최대 72시간 동안 4°C 또는 -20°C에서 무기한으로 고정할 수 있습니다.
5. 시퀀싱 라이브러리 건설
- cDNA38의태그 및 정리 .
- 총 부피의 20 μL에서 cDNA를 50 ng로 정상화합니다. 이 단계에서는 정확한 정량화에 매우 중요합니다.
- 표 5에서 태그션 혼합을 만들고 얼음 상에서 각 20 μL cDNA 샘플에 30 μL을 aliquot. 샘플을 열 사이클러에 넣고 태그 화 프로토콜을 실행합니다: 55°C 5 분 à 10°C 홀드.
- 열38을사용하여 태그가 지정된 cDNA의 정리를 수행합니다. 각 샘플에 180 μL DNA 결합 버퍼를 추가합니다. 230 μL을 스핀 컬럼으로 옮김.
- 1300 x g에서 2 분 동안 원심 분리기를 제거하고 흐름을 폐기하십시오.
- 300 μL DNA 세척 버퍼로 두 번 씻으시고. 에탄올 제거를 보장하기 위해 1300 x g에서 2 분 더 원심 분리기.
- 31 μL의 용출 버퍼를 컬럼에 첨가하여 정제된 cDNA를 정제하고 실온에서 2분 동안 배양하였다.
- 정제 된 제품을 회수하기 위해 1300 x g에서 2 분 동안 원심 분리기.
- 샘플 인덱스 PCR.
- 다중 시퀀싱 실행 중에 겹치지 않는 바코드를 선택합니다.
- 표6에 표시된 대로 샘플 인덱스 PCR 마스터 믹스를 만듭니다.
- 정제된 시료의 30 μL에 60 μL의 샘플 인덱스 PCR 마스터 믹스를 추가합니다.
- 각 샘플에 20 μM, 4-올리고 샘플 인덱스의 10 μL을 추가합니다(사용된 레코드 인덱스). 총 반응 량은 이제 100 μL입니다.
- 뚜껑을 105°C로 설정한 열 사이클러에 놓습니다. 다음 프로그램을 실행: 98°C 45 s à 12-14 사이클 [98°C 20 s à 54°C 30 s à 72°C 20 s] à 72°C 1 분 à 4 °C 홀드.
참고: 이것은 안전한 중지 지점입니다. 시료는 최대 72시간 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
- 이중 비드 정리로 라이브러리를 정화합니다.
- 100 μL의 핵산 크기 선택 자기 비드를 샘플에 넣고 파이펫과 철저히 섞습니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- 자석으로 옮기고 용액이 지워지때까지 방치하십시오. 상급체를 제거하고 폐기하십시오.
- 80% 에탄올의 200 μL로 두 번 씻으소서.
- 자석에 구슬을 2 분 동안 건조. 자석에서 제거하고 비드 펠릿에 EB 버퍼의 50.5 μL을 추가합니다. 버퍼내의 비드를 다시 일시 중단하는 피펫.
- 실온에서 2 분 동안 배양. 자석으로 옮기고 2 분 동안 방치하십시오. 깨끗한 스트립 튜브에 용출 된 샘플 50 μL을 옮김.
- 40 μL 핵산 크기 선택 자기 비드를 샘플에 넣고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 장식품을 제거하고 폐기하십시오.
- 80% 에탄올의 125 μL로 두 번 씻으소서.
- 자석에 구슬을 2 분 동안 건조. 자석에서 제거하고 비드 펠릿에 EB 버퍼의 60.5 μL을 추가합니다. 버퍼내의 비드를 다시 일시 중단하는 피펫.
- 실온에서 2 분 동안 배양. 자석으로 옮기고 2 분 동안 방치하십시오. 용출 된 샘플 50 μL을 깨끗한 스트립 튜브로 옮김. 이것이 최종 라이브러리입니다.
- 샘플을 최대 72시간 동안 4°C또는 -20°C에서 무기한으로 유지합니다. 이것은 안전한 중지 지점입니다.
- 자동화된 겔 전기영동 및 형광계 DNA 정량 분석(36,37)을사용하여 최종 라이브러리의 품질 관리를 정량화하고 실행한다. 품질 관리를 실행하기 전에 샘플을 1:10 희석하십시오.
6. 도서관 시퀀싱
- 각 시료를 2 ng/μL로 시퀀스화하고 정규화된 각 시료의 풀 3 μL로 함께 정규화합니다.
- 형광계 DNA 정량 분석분석37로 풀농도를 측정한다.
- 풀을 0.25 ng/μL로 희석합니다.
- 다음과 같이 풀을 변성: 희석된 풀링 된 샘플 (0.25 ng /μL) + 1 μL DNA 대조군 (1 nM), 2 μL EB 버퍼 + 5 μL NaOH (0.4N)의 12 μL. 이 배양 5 분 동안 하자, 다음 추가 10 μL 의 200 mM Tris pH 8.0.
- 4.05 μL을 1345.95 μL HT1로 로드합니다. 시퀀서의 카트리지에 1.3 mL을로드하고 26 사이클 (읽기 1) + 8 사이클 (i7 색인) + 0 사이클 (i5 색인) + 55 사이클 (읽기 2)와 시퀀싱 레시피를 사용하여 제조 업체의 지침(39)에 따라 실행합니다.
7. 읽기 정렬 (보조 파일 1)
- 셀 레인저 (v2.0.0)를 실행하여 FASTQ 파일로 시퀀싱하여 생성 된 BCL (원시 기본 호출) 파일을 디멀티 플렉스합니다. FASTQ 파일을 인간 B37.3 게놈 어셈블리 및 UCSC 유전자 모델에 정렬하여 발현 정량화를 얻습니다.
- 정렬 품질 관리.
- 정렬 메트릭을 생성하고 Q30 베이스, 유효한 바코드 분수, 셀 관련 읽기 분수, 매핑된 읽기 분수 및 각 셀에서 감지된 읽기를 확인합니다.
- 바코드 순위 플롯을 검사하여 셀 관련 바코드와 배경이 분리되는지 확인합니다.
8. 데이터 분석 (추가 파일 2)
- 셀 품질 관리 및 전처리.
- < 500 검출된 유전자, < 3000의 고유 분자 식별자(UMI), > 0.2 생존성 점수를 앞에서 설명한 바와 같이배제한다32. 조직 및 세포 유형에 따라 컷오프를 조정합니다.
- 더블을 제거합니다.
- R을 사용하여 이중 모달 발현 패턴(고발성 및 저발식 모드)에 대해 5개의 내분비 호르몬 유전자(글루카곤- GCG,인슐린- INS,소마토스타틴 - SST,췌장 폴리펩티드 - PPY,및 ghrelin-GHRL)를 평가합니다. 패키지 mclust40.
- 둘 이상의 호르몬 유전자, 즉 고발현 모드에서 두 개 이상의 호르몬 유전자를 발현하는 세포를 제거한다.
- 총 UMI에 의하여 유전자 발현을 정규화하고 R 패키지 Seurat41를사용하여 세포 수준에서 10,000의 스케일 인자를 곱합니다.
- 3개 미만의 세포에서 검출된 유전자를 제거합니다.
- 모든 세포의 평균 발현 및 분산을 사용하여 가변 유전자를 감지합니다. 조직 및 세포 유형에 따라 컷오프를 조정합니다.
- 가변 유전자를 통해 주성분 분석을 수행한다. 선택한 주 성분 수가 있는 클러스터 셀입니다. 세포의 나머지 부분과 하나의 세포 클러스터를 비교하여 세포 클러스터 농축 유전자를 유도한다.
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Representative Results
단세포 RNA 염기서열 분석 워크플로우는 3단계로 구성됩니다: 손상되지 않은 인간 섬을 단일 세포 현탁액으로 해리하고, 액적 기반 기술을사용하여 단일 세포를 포착하고, RNA-seq 데이터를 분석합니다(그림 1). 첫째, 획득 된 인간 섬은 하룻밤 동안 배양되었다. 온전한 섬을 현미경으로 검사하였다(도2A). 해리된 아일렛 세포의 무결성은 RNA 형광을 사용하여 인지혼화(RNA-FISH)로 검증되었습니다. 도 2B에도시된 바와 같이, 해리α-β-세포는 각각 GCG 및 INS mRNA 프로브를 사용하여 가시화시켰다.
세포 수 와 생존력은 단일 셀 포획 단계 전에 결정될 필요가 있다. 생존 가능성이 낮거나 이물질이 높은 셀은 추가 처리에 적합하지 않습니다. 양호한 세포 농도는 보통 400~500세포/μL범위. 약 6000개의 세포가 단일 세포 분할 단계에서 미세유체 칩에 적재되었고, 100 μL의 겔 비드를 에멀젼으로 칩으로부터 제거하였다. 그림 3A는 분할 단계 다음에 에멀젼의 성공적인 예를 예시한다. 각 파이펫 팁의 액체는 젤 비드에서 분리된 최소한의 분할 오일로 균일한 창백한 흐린 것입니다. 대조적으로, 도 3B는 겔 비드와 오일 사이의 명확한 상 분리를 가진 열악한 품질의 에멀젼을 나타낸다. 이는 칩 실행 중에 막힘 때문일 수 있습니다.
단일 세포 분할 후, cDNA 증폭을 수행했다. 도 4A는 cDNA 증폭 후 대표적인 단편 크기 분포를 도시한다. 양질의 cDNA 샘플에 대한 전형적인 피크는 1000-2000 bp 부근에 상주했습니다. 흥미롭게도 600 bp 에 가까운 스파이크는 아일렛 cDNA에 특이적이었습니다. RNA-seq 라이브러리에 대한 단편 크기 분포는 300~500 bp(도 4B)였다.
시퀀싱 후, 우리는 단일 세포 RNA-seq 데이터 품질을 평가하기 위해 일련의판독 정렬 메트릭을 사용했습니다(표 7). 처음 세 개의 메트릭은 잘 요약된 단일 셀 시퀀싱 라이브러리 품질입니다. 평균적으로 읽기의 92%는 손상되지 않은 세포에서 파생되었으며 읽기의 72%는 exons에 매핑되었습니다. 액적에서 포착된 모든 엑온 읽기 중에서, 그 중 90%는 손상되지 않은 세포에 의해 생성되었고 나머지는 무세포 액적에서 주변 RNA일 가능성이 있었습니다. 이러한 정렬 메트릭은 양호한 데이터 품질을 제안합니다. 엑온 판독과 UMI 사이의 비율은 시퀀싱 포화를 평가하는 경험적 측정이었고, 보통 10:1 비율은 좋은 지표였다. 부가적으로, 검출된 유전자의 수 (UMI > 0)는 상이한 세포 유형을 특성화하는 유용한 특징이었다. 인간 적인 본도 세포를 위해, 검출된 유전자의 수는 각 세포에서 대략 1,900입니다.
우리는 12명의 비 당뇨병 기증자에게서 총 20,811개의 췌도 세포를 연속했습니다. 하나 이상의 호르몬의 발현은 세포의 약 6%에서 검출되었다. 이러한 다중 호르몬 세포는 우리의 이전 작업이 단일 아일렛 세포의 0.1% 미만이 하나 이상의 내분비 호르몬33이상을공동 발현한다는 것을 보여주었기 때문에 가장 가능성이 두배가 된다. 확인된 모든 다중 호르몬 세포를 제거했습니다. 또한 총 UMI, 검출된 유전자 및 세포 생존가능성(33)에기초하여 저품질 세포를 배제하는 것이 중요하다. 이러한 품질 관리 단계 후, 19,174 추가 분석을 위해 남아 있었다. 군집 분석 결과 α-β-, δ-, PP, θ 세포, 아시나르, 덕트, 정지성 스텔레이트, 활성화된 스텔레이트, 내피, 대식세포및 비만 세포 (그림 5)의 12가지 세포 유형을 밝혀냈다. 예상대로, 내분비 세포는 대부분이었다(표 8). α 세포 (즉, GCG, TTR, CRYBA2, TM4SF4, TMEM176B)및 β 세포 (즉, IAPP, INS, HADH, DLK1, RBP4)의상위 농축 유전자는 다른 유전자와 일치합니다. 연구13,15,16,17,18,20,21,22,29 ,30,31,33. 흥미롭게도, α-및 β 세포는 모두 몇몇 소집단으로 이루어져 있었다. 3개의 β 세포 소집단, 베타 서브1, 2 및 3은 소수의 하위 집단 농축 유전자(베타 서브1에서 18개, 베타 서브2에서 33개, 베타 서브3에서 18개)와 유사하였다. 네 번째 하위 인구는 488 개의 농축 된 유전자를 가지고 있었습니다. 작은 α 세포 하위 집단 (알파 서브3)은 증식 세포로 구성, MKI67의풍부한 발현을 특징으로, CDK1,및 TOP2A.
그림 1: 단일 셀 RNA 시퀀싱 워크플로의 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 손상되지 않고 해리된 인간 섬의 대표적인 이미지입니다. (A) 하룻밤 배양 후 찍은 작은 섬의 이미지. (B)INS(흰색) 및 GCG(적색)에 대한 RNA-FISH 염색에 의해 시각화된 해리된 아일렛 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 역전사 전에 단세포 에멀젼의 품질에 대한 검사. (A) 좋은 품질의 단일 셀 에멀젼. 각 파이펫 팁의 액체는 균일하게 흐린. (B) 품질이 좋지 못한 단일 셀 에멀젼. 피펫 팁내의 액체는 균질하지 않았고 오일과 겔 비드 사이의 분리를 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 단세포 cDNA 및 도서관의 질 검사. (A) 대표적인 cDNA 추적. 이 cDNA는 1000-2000 bp 근처에서 발생하는 샘플의 주요 피크와 함께 양호한 품질과 수율이었습니다. 약 600 bp의 흔적에 있는 스파이크는 전형적이고 아일레 cDNA의 특유했습니다. (B) 대표적인 최종 시퀀싱 라이브러리 추적. 이 라이브러리는 좋은 품질과 수율, 300-500 bp 사이 발생 하는 주요 피크. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 5: 인간 췌도의 단세포 RNA 시퀀싱에서 확인된 세포 유형 및 소집단. 세포는 t-분산 형층 선진 적 이웃 임베딩(tSNE) 치수의 공간에서 독특한 세포 유형에 의해 군집되었다. 분석은 또한 α 세포에 있는 3개의 소집단 및 β 세포에 있는 4를 밝혔습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 이름 | Vol. 반응당 사용(μL) |
| RT 시약 믹스 | 50개 |
| RT 프라이머 | 3.8 |
| 첨가제 A | 2.4 |
| RT 엔자임 믹스 | 10개 |
| 총 | 66.2 |
표 1: 역성적전사 혼합.
| 시약 이름 | 반응당 사용 부피(uL) |
| 뉴클레아제 없는 물 | 9개 |
| 버퍼 샘플 정리 1 | 182년 |
| 다이나비드 마이원 일레인 | 4개 |
| 첨가제 A | 5개 |
| 총 | 200개 |
표 2: 정리 믹스.
| 시약 이름 | 반응당 사용 부피(uL) |
| 버퍼 EB | 98세 |
| 10% 트웬 20 | 1개 |
| 첨가제 A | 1개 |
| 총 | 100개 |
표 3: 용출 용액.
| 시약 이름 | 반응당 사용 부피(uL) |
| 뉴클레아제 없는 물 | 8개 |
| 증폭 마스터 믹스 | 50개 |
| cDNA 첨가제 | 5개 |
| cDNA 프라이머 믹스 | 2개 |
| 총 | 65세 |
표 4: cDNA 증폭 혼합.
| 시약 이름 | 반응당 사용 부피(μL) |
| 태축 효소 | 5개 |
| 태그 버퍼 | 25개 |
| 총 | 30개 |
표 5: 태그 혼합.
| 시약 이름 | 반응당 사용 부피(μL) |
| 뉴클레아제 없는 물 | 8개 |
| 증폭 마스터 믹스 | 50개 |
| SI-PCR 프라이머 | 2개 |
| 총 | 60 |
표 6: 샘플 인덱스 PCR 마스터 믹스.
| 샘플 ID | 유효한 셀 바코드로 읽는 비율 | % 엑소온은 총 셀 중 캡처 된 셀에서 읽습니다. | 총 읽기 중 % 엑슨 읽기 | 셀당 평균 엑슨 읽기 | 셀당 중앙값 UMI | 세포 당 중앙값 유전자 |
| 샘플 1 | 92% | 93% | 76% | 142,015 | 10,310 | 1,747 |
| 샘플-2 | 92% | 91% | 74% | 151,395 | 11,350 | 1,754 |
| 샘플-3 | 94% | 92% | 75% | 120,538 | 19,604 | 2,180 |
| 샘플-4 | 95% | 93% | 67% | 160,657 | 11,870 | 2,111 |
| 샘플-5 | 94% | 92% | 62% | 177,809 | 13,821 | 2,288 |
| 샘플-6 | 95% | 89% | 67% | 138,208 | 8,235 | 1,296 |
| 샘플-7 | 94% | 89% | 72% | 147,484 | 13,606 | 2,272 |
| 샘플-8 | 94% | 91% | 69% | 159,793 | 9,505 | 1,865 |
| 샘플-9 | 95% | 92% | 72% | 168,436 | 12,794 | 2,389 |
| 샘플-10 | 83% | 83% | 74% | 88,067 | 13,323 | 1,805 |
| 샘플-11 | 82% | 88% | 77% | 67,752 | 9,295 | 1,278 |
| 샘플-12 | 91% | 85% | 74% | 194,781 | 14,877 | 1,746 |
표 7: 정렬 메트릭을 읽습니다.
| 셀 타입 | 셀 수 | Ave. 기증자당 세포 (표준 편차) |
| 알파 | 6546 | 546 (258) |
| Beta | 7361년 | 613 (252) |
| 델타 | 922 | 77 (37) |
| Pp | 545 | 45 (25) |
| 엡실론 | 11세 | 1 (1) |
| 아시나르 (주) | 836 | 70 (71) |
| Ductal | 1313년 | 109 (95) |
| 정지성 스텔레이트 | 225 | 19 (14) |
| 활성화된 스텔레이트 | 890 | 74 (58) |
| 내피 | 408 | 34 (21) |
| 대식세포 | 80 | 7 (6) |
| 슈완 (미국) | 37세 | 3 (3) |
표 8: 셀 유형 조성물. 각 세포 유형에서 각 기증자에 대한 각 세포 유형 및 평균 세포에 대한 총 셀 수.
추가 파일 1: 시퀀스 정렬에 사용되는 명령입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: R 스크립트는 세포 품질 관리, 세포 군집화, 세포 형 농축 유전자를 식별하기 위한 것입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
최근 개발된 단세포 기술은 인간 췌도에서 세포 유형을 특성화하고 분자 이질성을 연구하는 새로운 플랫폼을 제공합니다. 우리는 인간 섬을 연구하기 위해 액적 기반 미세 유체 단일 세포 격리 및 데이터 분석 프로토콜을 채택했습니다. 우리의 프로토콜은 서열 품질 및 배치 효과에 상대적으로 작은 변화를 가진 20,000 개 이상의 단일 인간 아일렛 세포에서 RNA 시퀀싱 데이터를 성공적으로 생산했습니다.
특히 고품질 결과를 위해 이 프로토콜에서는 두 단계가 중요합니다. 인간의 섬을 해리 할 때주의가 필요합니다. 섬을 과도하게 소화하지 않는 것이 중요합니다. 단일 셀 분할은 성공적인 단일 셀 실험을 위한 또 다른 핵심 단계입니다. 그림3에서 양호하고 품질이 낮은 에멀젼의 예를 보여 주었으며. 명확한 에멀젼은 일반적으로 분할 단계에서 수집되는 셀의 부적당한 수를 나타냅니다.
단리된 1차 인간 섬에 대한 접근은 대규모 인간 섬 단세포 전사체를 생성하는 속도 제한 단계이다. 개별 시체 기증자에서 격리 된 섬은 일반적으로 다른 시간에 처리, 따라서 잠재적인 샘플 의존 배치 효과 신중 하 게 데이터 분석 하는 동안 검사 해야 합니다. 통합 분석은 개별 배치41에서일반적인 세포 유형 및 하위 집단을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 배치 효과는 또한 배치 보정식 정량화(42)에 의해 조정될 수 있다. 단세포 RNA-seq 데이터를 분석하는 또 다른 과제는 이중을 식별하는 것입니다. 데이터 전처리에서, 우리는 다중 호르몬 유전자 (GCG, INS, SST, PPY,및 GHRL)를발현하는 세포를 식별하여 내분비 이두배를 제거하는 조치를 취했습니다. 2개의 다른 세포 모형에 의해 형성된 이중의 확인은 내분비 호르몬의 극단적으로 높은 발현 때문에 상대적으로 쉬운 작업입니다. 진짜 과제는 세포 형 더블트, 예를 들어, 2개의 α 세포에 의해 더블을 확인하는 것입니다. 더 높은 UMI 및 검출된 유전자의 더 높은 수는 잠재적인 doublets의 암시이기 때문에, 1개의 해결책은 세포 QC 단계 도중 유전자 및 UMI의 높은 수와 이상값을 제거하는 것입니다. 또한, 더블을 감지하는 도구는43,44,45를사용할 수 있습니다.
단세포 RNA 염기서열 분석의 주요 제한은 낮은 감도이다. 스파이크인 외부 RNA 대조군 컨소시엄(ERCC) RNA를 사용하여, 우리는 모든 발현된 유전자의 단지 10%가 현재 프로토콜을 사용하여 검출되고 검출된 것들은 높은 풍부 유전자46쪽으로편향되었다는 것을 추정했습니다. 췌장 내분비 세포는 호르몬 유전자의 극단적으로 높은 수준을 표현합니다 (즉, GCG, INS, SST,및 PPY). 그 결과, 이 유전자의 mRNAs는 주변 RNA가 되기 위하여 리스크가 있습니다. 이러한 배경 소음은 완전히 피할 수 없습니다. 그러나 이 단계별 프로토콜은 연구원이 원치 않는 실험 소음을 최소화하는 데 도움이 됩니다. 현재 프로토콜은 새로 분리된 조직을 위해 설계되었습니다. 단일 핵 RNA 시퀀싱47,48과같은 다른 기술은 신선, 냉동 또는 가볍게 고정된 조직의 RNA-seq에 사용할 수 있습니다. 부가적으로, 최근에 개발된 세포 해싱 기술(49)은 시료 다중화를 허용하는 진보된 미세유체 단일 세포 프로토콜로 간주될 수 있다.
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Disclosures
모든 저자는 Regeneron 제약, Inc.의 직원과 주주입니다.
Acknowledgments
없음
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
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