Summary
Her presenterer vi en protokoll for å generere høykvalitets, store transcriptome data av enkeltceller fra isolerte menneskelige bukspyttkjertel holmer ved hjelp av en dråpe BAS ert mikrovæskebasert med én celle RNA-sekvensering.
Abstract
Bukspyttkjertelen holmer består av endokrine celler med karakteristiske hormon uttrykk mønstre. De endokrine cellene viser funksjonelle forskjeller som svar på normale og patologiske tilstander. Målet med denne protokollen er å generere høy kvalitet, stor skala transcriptome data for hver endokrine celle type med bruk av en dråpe-basert mikrovæskebasert enkelt celle RNA sekvensering teknologi. Slike data kan utnyttes til å bygge genet uttrykk profil av hver endokrine celle type i normale eller spesifikke forhold. Prosessen krever nøye håndtering, nøyaktig måling og streng kvalitetskontroll. I denne protokollen beskriver vi detaljerte trinn for dissosiasjon av menneskelige bukspyttkjertel, sekvensering og dataanalyse. Representative resultatene av ca 20 000 menneskelige enkelt Holme celler demonstrere vellykket anvendelse av protokollen.
Introduction
Bukspyttkjertelen holmer frigjør endokrine hormoner for å regulere blodsukkernivået. Fem endokrine celletyper, som skiller funksjonelt og morfologisk, er involvert i denne viktige rollen: α-celler produserer glukagon, β-celler insulin, δ-celler somatostatin, PP celler bukspyttkjertelen polypeptid, og ε-celler ghrelin1. Gene Expression profilering er en nyttig tilnærming for å karakterisere endokrine celler i normale eller spesifikke forhold. Historisk sett ble hele Holmen genuttrykket profilering generert ved hjelp av Microarray og neste generasjons RNA-sekvensering2,3,4,5,6,7 , 8. selv om hele Holmen transcriptome er informativ å identifisere organ-spesifikke transkripsjoner og sykdom kandidat gener, unnlater den å avdekke den molekylære heterogenitet av hver Holme celle type. Laser Capture microdissection (LCM) teknikken har blitt brukt til å direkte hente bestemte celletyper fra holmer9,10,11,12 men faller kort av renhet av målrettede celle Befolkningen. For å overkomme disse begrensningene, har fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) blitt brukt til å velge bestemte endokrine celle populasjoner, slik som α-og β-celler13,14,15,16 , 17 i , 18. dess, Dorrell et al. brukte en antistoff BAS ert FACS sorterings tilnærming for å klassifisere β-celler i fire subpopulasjoner19. FACS-sorterte Holme celler kan også være belagt for RNA sekvensering av enkeltceller; de plate-baserte metodene står imidlertid overfor utfordringer i skalerbarhet20,21,22.
For å generere høy kvalitet, stor skala transcriptome data for hver endokrine celle type, brukte vi mikrovæskebasert teknologi til menneskelige Holme celler. Mikrovæskebasert-plattformen genererer transcriptome data fra et stort antall enkeltceller i en høy gjennomstrømming, høy kvalitet og skalerbar måte23,24,25,26,27. I tillegg til å avsløre molekylær karakteristikker av en celle type fanget i en stor mengde, gjør svært skalerbar mikrovæskebasert plattform identifisering av sjeldne celletyper når nok celler er gitt. Derfor, anvendelse av plattformen til menneskelige bukspyttkjertelen holmer tillot profilering av ghrelin-sekresjon ε-celler, en sjelden endokrine celle type med lite kjent funksjon på grunn av sin knapphet28. I de senere årene har flere studier blitt offentliggjort av oss og andre som rapporterer store transcriptome data om menneskelige holmer ved hjelp av teknologien29,30,31,32, i 33. Dataene er allment tilgjengelige og nyttige ressurser for Holmen samfunnet å studere endokrine celle heterogenitet og dens konsekvens i sykdommer.
Her beskriver vi en dråpe-basert mikrovæskebasert enkelt celle RNA sekvensering protokoll, som har blitt brukt til å produsere transcriptome data på ca 20 000 menneskelige Holme celler inkludert α-, β-, δ-, PP, ε-celler, og en mindre andel av ikke-endokrine celler 32. arbeidsflyten starter med isolerte menneskelige holmer og viser trinn på Holme Cell dissosiasjon, enkelt celle fangst og dataanalyse. Protokollen krever bruk av fersk isolerte holmer og kan påføres holmer fra mennesker og andre arter, slik som gnagere. Ved hjelp av denne arbeidsflyten, upartisk og omfattende Holme celle Atlas under Baseline og andre forhold kan bygges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. menneskelig Holme dissosiasjon
- Få menneskelige holmer isolert fra Cadaver organ donorer av begge kjønn, i alderen 15-80 år, uten eksisterende sykdommer, med mindre holmer fra donorer med spesifikke demografi er nødvendig for studie formålet.
- Etter isolasjon, har de isolerte holmer oppbevares i vevet kultur anlegg for 2-3 dager hos leverandøren. Det tar ofte mer enn 1 dag for Holmen skader å bli synlig.
- Plasser holmer i en flaske og senk den helt inn i Holmen medium. Få det til laboratoriet ved levering over natten.
- Få Holmen tilsvarende mengde (IEQ) av de sendte holmer fra Holmen leverandøren.
- Gjenopprette holmer fra forsendelsen på dagen for Holmen ankomst. Utfør dette trinnet ved hjelp av en hette for å minimere sjansen for forurensning.
- Avkjøl hele Holme Media (CMRL-1066, 10% (v/v) FBS, 1x pen-strep, 2 mM glutamin) i et kjøleskap.
- Overfør holmer fra flasken til en 50 mL konisk slange.
- Tilsett 10 mL pre-avkjølt komplett Holme Media til den tømte flasken å vaske ut de resterende holmer. Overfør mediene til det koniske røret.
- Sentrifuger røret ved 200 x g for 2 min for å gjenopprette holmer. Aspirer den supernatanten forlater ca 1-2 mL Media med pellet.
- Resuspend holmer med en ferdig avkjølt Holme Media. Basert på IEQ levert av leverandøren, tilsett 12 mL Media per 5000 IEQ.
- Hell holmer i Media på en 10 cm ikke-behandlet vev kultur parabolen. Ruge overnatter i en vev kultur inkubator ved 37 ° c med 5% CO2 i atmosfærisk luft.
- Distansere holmer som vist nedenfor. Utfør dette trinnet etter overnatting inkubasjons.
- Pre-varm komplett Holme Media og celle dissosiasjon løsning.
- Forbered 1x PBS som inneholder 0,04% BSA ved romtemperatur.
- Telle og håndplukker 200-300 holmer ved hjelp av en P200 pipette og overføre holmer til en 15 mL konisk rør som inneholder 5 mL pre-varmet komplett Holme Media.
- Samle holmer ved sentrifugering ved 200 x g i 2 min. forsiktig aspirer supernatanten uten å forstyrre pellet på bunnen.
- Tilsett 1,0 mL pre-varmet celle dissosiasjon løsning og forstyrre pellet ved pipettering forsiktig opp og ned. Ruge holmer ved 37 ° c for 9-11 min. Hver 3 min pipette opp og ned sakte for 10 s å distansere cellene i enkeltceller.
- Når Holmen celler er godt dissosiert og løsningen blir skyet, tilsett 9 mL komplett Holme Media og filter gjennom en 30 μm celle sil i en ny 15 mL konisk rør.
- Vask røret og celle sil med 2 mL komplette Holmen medier for å samle de resterende holmer og legge til samme rør.
- Samle celler ved sentrifugering ved 400 x g i 5 min.
- Forsiktig aspirer Media og resuspend cellen pellet i 5 mL 1x PBS inneholder 0,04% BSA (PBS-BSA).
- Filtrer gjennom en ny 30 μm celle sil i et 15 mL konisk rør og sentrifuger på 400 x g i 5 min for å samle celler.
- Aspirer supernatanten og resuspend celle pellet i 200-300 μL 1x PBS-BSA-løsning.
- Mål celle konsentrasjonen og juster volumet til en endelig konsentrasjon av 400-500 celler/μL.
2. enkelt celle fjæring kvalitetskontroll
- Bestem celle konsentrasjonen ved hjelp av en fluorescens automatisert celle teller34.
- Bland 10 μL-celler med 0,5 μL AO/DAPI. Pipetter bland godt. Last 10,5 μL på lysbildet og Kjør celle tellings analysen for å bestemme antall og levedyktighet.
- Fortynne og/eller filterene cellen suspensjonen som nødvendig basert på celle tellingen.
3. enkelt celle partisjonering ved hjelp av en mikrovæskebasert chip. Følg protokollen fra mikrovæskebasert chip produsenten35.
- Bring 3 ' gel perler og omvendt transkripsjon (RT) reagenser til romtemperatur (> 30 min). Rekonstituer RT-primer i TE-buffer ved behov.
- Forbered RT Master mix i en lav bind tube som beskrevet i tabell 1.
- Bestem antall celler som skal legges inn for hvert utvalg. Beregn celle fjærings volumet (X) som er nødvendig for å levere ønsket mål celle nummer. Det beregnede volumet av nuklease vann som skal legges til hver prøve vil være 33,8-X μL.
- For hver prøve som skal partisjonert, tilsett 33,8-X μL nuklease vann i 0,2 mL PCR Strip tube. Deretter legger du til 66,2 μL Master Mix til hver stripe rør. Ikke Legg cellene til stripen røret på dette punktet. Pipetter forsiktig for å blande. Plasser forberedt stripe rør på isen.
- Plasser en mikrovæskebasert chip i en chip sak. Orientere chip saken sikre oljebrønner (rad merket 3) er nærmest den personen som utfører eksperimentet.
- Hvis du kjører mindre enn 8 prøver, kan du bruke 50% glyserol til å fylle ubrukte kanaler i følgende rekkefølge:
- Tilsett 90 μL av 50% glyserol i brønnene i rad 1 for alle ubrukte kanaler.
- Tilsett 40 μL av 50% glyserol i brønnene i rad 2 for alle ubrukte kanaler.
- Tilsett 270 μL av 50% glyserol i brønnene i rad 3 for alle ubrukte kanaler.
- Smekk gel perlene i en Vortex. Vortex på full hastighet for 30 s. Trykk på stripen på benken toppen flere ganger for å samle perler. Bekreft at det ikke finnes bobler til stede.
- Tilsett X μL av celler i den preparerte stripen rør. Pipette å blande 5 ganger. Uten å forkaste pipette tipsene, overføre 90 μL av celle blanding til rad 1 av brikken.
- Vent 30 s, deretter lastes 40 μL av gel perler til rad 2. Pipetter svært langsomt for dette trinnet. Dispensere 270 μL av partisjonering olje til brønnene i rad 3.
- Fest chip pakningen på tappene på chip holde ren. Plasser montert chip holderen i én celle partisjonering enhet og trykk på Run-knappen.
- Fjern umiddelbart den monterte chip holde ren når kjøringen er fullført.
- Fjern chip pakningen fra holderen, åpne chip saken ved en 45 ° vinkel, og fjern 100 μL av emulsjon fra brikken inn i en blå plast 96-brønn plate.
4. enkelt celle cDNA forsterkning. Følg protokollen fra mikrovæskebasert chip produsenten35.
- Omvendt transkripsjon.
Merk: Utfør dette trinnet under en ren PCR-bare hette for å forhindre mikrobiell og annen forurensning av unamplified cDNA.- Forsegle 96-brønn blå plate med en folie sel på en oppvarmet plate sealer.
- Kjør omvendt transkripsjon reaksjonen i en termisk cycler som følger: 53 ° c for 45 min à 85 ° c i 5 min à 4 ° c hold.
Merk: Dette er et trygt stoppe punkt. Prøvene kan holde ved 4 ° c i opptil 72 h.
- Etter RT rensing
- Bring nukleinsyre acid bindende magnetiske perler og nukleinsyre yre størrelse utvalg magnetiske perler til romtemperatur og Vortex å re-suspendere. På dette punktet, tine prøven opprydding buffer i 10 min ved 65 ° c. Før alle andre reagenser til romtemperatur og Vortex.
- Klargjør buffere som vist i tabell 2 og tabell 3.
- Kjemisk bryte emulsjon og rens.
- For å gjøre dette, Fjern forsiktig folien fra platen.
- Dispensere 125 μL av rosa emulsjon-bryte reagens i hver emulsjon. Vent i 1 min, og Overfør deretter hele volumet til en ren 0,2 mL stripe rør. Sørg for at det er et lag av klar og et lag med rosa i stripen røret.
- Fjern 125 μL av det rosa laget fra bunnen av stripen røret uten å forstyrre det klare laget. Det er normalt at et lite volum (~ 15 μL) av det rosa laget forblir i slangen.
- Tilsett 200 μL av opprydding Mix fra tabell 2 til stripen røret og ruge ved romtemperatur i 10 min.
- Overfør stripen røret til et magnetisk stativ og la løsningen klare. Fjern supernatanten og kast, vask deretter perlene med 80% etanol to ganger. La perlene tørke i 1 min.
- Fjern stripe røret fra magneten og tilsett 35,5 μL av eluering oppløsning fra tabell 3 til perlene. Pipetter for å resuspend perlene i løsningen. Ruge i 2 minutter ved romtemperatur.
- Overfør stripen røret til et magnetisk stativ og la løsningen klare. Fjern renset cDNA fra strimmelen røret og dispensere det til ren 0,2 mL stripe rør.
- Forsterke cDNA.
- Forbered forsterkning Master mix i Tabell 4, nedenfor.
- Tilsett 65 μL av cDNA forsterkning Master Mix til hver prøve. Plasser stripe røret i en termisk cycler og Kjør følgende program: 98 ° c 3 min à 15 sykluser av [98 ° c 15 s à 67 ° c 20 s à 72 ° c 1 min] à 72 ° c 5 min à 4 ° c Hold
Merk: Dette er et trygt stoppe punkt. Prøvene kan holde ved 4 ° c i opptil 72 h. - Rens forsterket cDNA med 0,6 x nukleinsyre yre størrelse utvalg magnetiske perler. Vask to ganger med 80% etanol og eluere med 40,5 μL.
- Kjøre kvalitetskontroll cDNA ved hjelp av automatiserte gel elektroforese og fluorescens-basert DNA kvantifisering analysen36,37.
Merk: Dette er et trygt stoppe punkt. Prøvene kan holde ved 4 ° c i inntil 72 h eller ved-20 ° c i det uendelige.
5. sekvensering biblioteket konstruksjon
- Tagmentation og opprydding av cDNA38.
- Normalisere cDNA til 50 ng i 20 μL av det totale volumet. Eksakt kvantifisering er avgjørende i dette trinnet.
- Lag tagmentation blandingen i tabell 5 og Alikvot 30 μL til hver 20 μL cDNA-prøve på is. Sett prøvene i den termiske cycler og Kjør tagmentation protokollen: 55 ° c 5 min à 10 ° c hold.
- Utfør opprydding av tagmented cDNA ved hjelp av kolonnene38. Tilsett 180 μL DNA-bindings buffer i hver prøve. Overfør 230 til en spin-kolonne.
- Sentrifuger på 1300 x g for 2 min og kast flyten gjennom.
- Vask to ganger med 300 for å vaskebuffer. Sentrifuger ytterligere 2 min på 1300 x g for å sikre etanol fjerning.
- Eluere renset tagmented cDNA ved å legge til 31 μL av eluering buffer til kolonnen og ruge ved romtemperatur i 2 min.
- Sentrifuger for 2 min ved 1300 x g for å gjenopprette renset produktet.
- Eksempel indeks PCR.
- Velg strekkoder som ikke overlapper under en multiplekset sekvensering kjøres.
- Lag en eksempel indeks PCR Master Mix som vist i tabell 6.
- Tilsett 60 μL av prøve indeks PCR Master Mix til 30 μL av renset prøven.
- Tilsett 10 μL av en 20 μM, 4-oligo eksempel indeks i hvert utvalg (post indeks brukt). Det totale reaksjons volumet er nå 100 μL.
- Plasser i en termisk cycler med lokket satt til 105 ° c. Kjør følgende program: 98 ° c 45 s à 12-14 sykluser [98 ° c 20 s à 54 ° c 30 s à 72 ° c 20 s] à 72 ° c 1 min à 4 ° c hold.
Merk: Dette er et trygt stoppe punkt. Prøvene kan holde ved 4 ° c i opptil 72 h.
- Rens bibliotekene med dobbel perle rydde opp.
- Tilsett 100 μL av nukleinsyre, magnetiske perler i prøven og bland godt med en pipette. Ruge ved romtemperatur i 5 min.
- Overfør til en magnet og la den stå til løsningen klarner. Fjern og kast supernatanten.
- Vask to ganger med 200 μL av 80% etanol.
- Tørk perlene på magneten i 2 min. Fjern fra magneten og tilsett 50,5 μL av EB buffer til perle pellet. Pipette å re-suspendere perlene i bufferen.
- Ruge ved romtemperatur i 2 min. Overfør til en magnet og la stå i 2 min. Overfør 50 μL av eluert prøve til et rent stripe rør.
- Tilsett 40 μL nukleinsyre yre størrelse utvalg magnetiske perler til prøven og ruge ved romtemperatur i 5 min. Overfør til en magnet og la løsningen være klar. Fjern og kast supernatanten.
- Vask to ganger med 125 μL av 80% etanol.
- Tørk perlene på magneten i 2 min. Fjern fra magneten og tilsett 60,5 μL av EB buffer til perle pellet. Pipette å re-suspendere perlene i bufferen.
- Ruge ved romtemperatur i 2 min. Overfør til en magnet og la den stå i 2 min. Overfør 50 μL av eluert prøve til et rent stripe rør. Dette er det siste biblioteket.
- Hold prøvene ved 4 ° c i opptil 72 h eller ved-20 ° c i det uendelige. Merk at dette er et trygt stoppe punkt.
- Kvantifisere og løpe kvalitet administrere av Final biblioteker benytter automatisert gel elektroforese og fluorescens-basert DNA kvantifisering analysen36,37. Fortynne prøvene 1:10 før du kjører kvalitetskontroll.
6. bibliotek sekvensering
- Normalisere hver prøve for å bli sekvensert til 2 ng/μL og pool 3 μL av hver normalisert prøve sammen.
- Mål konsentrasjonen av bassenget med fluorescens-basert DNA kvantifisering-analysen37.
- Fortynne bassenget til 0,25 ng/μL.
- Denaturere av bassenget på følgende måte: 12 μL av utvannet utvalg (0,25 ng/μL) + 1 μL DNA-kontroll (1 nM), 2 μL EB buffer + 5 μL NaOH (0,4 N). La dette ruge i 5 min, legg deretter til 10 μL av 200 mM Tris pH 8,0.
- Last 4,05 til 1345,95 μL HT1. Load 1,3 mL i Sequencer blekkpatron og kjøre i henhold til produsentens retningslinjer39 bruke en sekvensering oppskrift med 26 sykluser (Les 1) + 8 sykluser (i7 Index) + 0 sykluser (i5 Index) + 55 sykluser (Les 2).
7. lese justering (tilleggsfil 1)
- Løpe cellen Ranger (v 2.0.0) å Demultiplex ømt punkt basis ringe (BCL) fil-størrelse utviklet av sekvensering i FASTQ fil-størrelse. Align FASTQ filer til Human B 37.3 Genova montering og UCSC gen modell for å få uttrykket kvantifisering.
- Justerings kvalitetskontroll.
- Generer justerings beregninger og kontroller Q30 baser, gyldig strekkode brøk, celle-tilknyttet lese brøk, tilordnet lese brøk og leser oppdaget i hver celle.
- Undersøk strekkode rangerings plottet for å forsikre deg om at du har separasjon av de celle-tilknyttede strekkodene og bakgrunnen.
8. data analyse (tilleggsfil 2)
- Celle kvalitetskontroll og forhåndsbehandle.
- Ekskluder celler med < 500 oppdagede gener, < 3000 totalt antall unike molekylær Identifier (UMI), > 0,2 levedyktighet score som tidligere beskrevet32. Juster cutoffs i henhold til vevs-og celletyper.
- Fjern doublets.
- Vurdere de fem endokrine hormon gener (glukagon- GCG, insulin- ins, somatostatin- SST, bukspyttkjertel polypeptid- PPY, og ghrelin- GHRL) for bimodal uttrykk mønster (høy-og lav-uttrykk-modus) ved hjelp av R pakken mclust40.
- Fjern celler som uttrykker mer enn ett hormon gen, dvs., med to eller flere hormon gener i høy uttrykks modus.
- Normalisere genuttrykk ved den totale UMI og multiplisere med skaleringsfaktoren på 10 000 på cellenivå ved hjelp av R-pakken Seurat41.
- Fjern gener som oppdages i mindre enn 3 celler.
- Oppdag variable gener ved hjelp av gjennomsnittlig uttrykk og dispersjon av alle celler. Juster cutoffs i henhold til vevs-og celle typene.
- Utfør den viktigste komponenten analyse med variable gener. Klynge celler med det valgte antallet hovedkomponenter. Utlede celle-klynge beriket gener ved å sammenligne en celle klynge med resten av cellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbeidsflyten med RNA-sekvensering (single-Cell) består av tre trinn: dissociating intakte menneskelige holmer i enkelt celle oppheng, registrering av enkeltceller ved hjelp av en dråpe BAS ert teknologi og analysering av RNA-SEQ-data (figur 1). For det første ble de ervervet menneskelige holmer inkubert over natten. De intakte holmer ble undersøkt under mikroskopet (figur 2a). Integriteten til dissosiert Holme celler har blitt validert ved bruk av RNA fluorescens in situ hybridisering (RNA-fisk). Som vist i figur 2b, ble dissosiert α-og β-celler visualisere ved hjelp av henholdsvis GCG og ins mRNA sonder.
Celle telling og levedyktighet må bestemmes før enkelt celle fangst trinn. Celler med lav levedyktighet eller høyt rusk er ikke egnet for videre behandling. En god celle konsentrasjon varierer vanligvis fra 400 til 500 celler/μL. omtrent 6000 celler ble lastet til mikrovæskebasert chip i enkelt celle partisjonering trinn, og 100 μL av gel perler i emulsjon ble fjernet fra brikken. Figur 3a illustrerer et vellykket eksempel på emulsjon etter trinn i partisjonering. Væsken i hvert pipette tips er ensartet blek skyet med minimal partisjonering olje atskilt fra gel perler. I kontrast, figur 3b viser en dårlig kvalitet emulsjon med klar fase separasjon mellom gel perler og olje. Dette kan skyldes en tresko under chip Run.
Etter en enkelt celle partisjonering ble cDNA forsterkning utført. Figur 4a illustrerer en representativ fragment størrelsesfordeling etter cDNA forsterkning. Den typiske Peak for en god kvalitet cDNA prøven bodde i nærheten 1000-2000 BP. interessant, en pigg nær 600 BP var spesifikk å Holme cDNA. Fragment størrelsesfordelingen for RNA-SEQ-bibliotekene var mellom 300 og 500 BP (figur 4b).
Etter sekvensering brukte vi et sett med målinger for lese justering for å evaluere datakvaliteten RNA-SEQ (Tabell 7) for én celle. De tre første beregningene godt oppsummert single-celle sekvensering biblioteket kvalitet. På et gjennomsnitt, 92% av leser var avledet fra intakte celler og 72% av leser ble kartlagt til exoner. Ut av alle ekson leser fanget i dråper, 90% av dem ble produsert av intakte celler og resten var trolig ambient RNAs i celle-frie dråper. Disse justerings målingene tyder på god datakvalitet. Forholdet mellom ekson leser og UMI var en empirisk måling for å evaluere sekvensering metning og vanligvis, 10:1 ratio var en god indikator. I tillegg var antall oppdagede gener (UMI > 0) en nyttig funksjon for å karakterisere ulike celletyper. For Human Holme celler, er antall oppdagede gener omtrent 1 900 i hver celle.
Vi sekvensert totalt 20 811 Holme celler fra 12 ikke-diabetiker donorer. Uttrykk for mer enn ett hormon ble oppdaget i ca 6% av cellene. Disse multi-hormonelle celler er mest sannsynlig doublets fordi våre tidligere arbeid viste at mindre enn < 0,1% av enkelt Holme celler co-uttrykt mer enn ett endokrine hormon33. Vi fjernet alle identifiserte multi-hormonelle celler. Det er også viktig å ekskludere lav kvalitet celler basert på total UMI, oppdagede gener, og celle levedyktighet33. Etter disse kvalitetskontroll trinnene, forble 19 174 for videre analyse. Clustering analysen avdekket 12 celletyper: α-, β-, δ-, PP, ε-celler, acinar, ductal, Quiescent Stel, aktivert Stel, endothelial, macrophage, og mastceller (figur 5). Som forventet, endokrine celler var flertallet (tabell 8). Den øverste beriket gener i α-celler (dvs. GCG, TTR, CRYBA2, TM4SF4, TMEM176B) og β-celler (dvs. IAPP, ins, HADH, DLK1, RBP4) er forenlig med andre studerer13,15,16,17,18,20,21,22,29 ,30,31,33. Det var interessant at både α-og β-cellene besto av flere subpopulasjoner. Tre β-celle subpopulasjoner, beta sub1, 2 og 3, var like med et lite antall pasientpopulasjonen-beriket gener (18 i beta sub1, 33 i beta sub 2, og 18 i beta sub 3). Den fjerde pasientpopulasjonen hadde 488 beriket gener. Den lille α-celle pasientpopulasjonen (Alpha sub3) omfattet voksende celler, karakterisert ved beriket uttrykk for MKI67, CDK1og TOP2A.
Figur 1: skjematisk diagram over arbeidsflyt for RNA-sekvenser med én celle. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representative bilder av intakte og dissosiert menneskelige holmer. (A) et bilde av holmer tatt etter over natten inkubasjons. (B) dissosiert Holmen celler VISUALISERE av RNA-Fish farging for ins (hvit) og GCG (rød). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: undersøkelse av kvaliteten på enkelt celle emulsjon før omvendt transkripsjon. (A) en enkelt celle emulsjon av god kvalitet. Væsken i hver pipette spissen var homogent skyet. (B) en enkelt celle emulsjon av dårlig kvalitet. Væsken i pipette spissen var ikke homogen og viste separasjon mellom olje og gel perler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: undersøkelse av kvaliteten på single-Cell cDNA og bibliotek. (A) en representant cDNA spor. Dette cDNA var av god kvalitet og utbytte, med de viktigste Peak for prøven forekommende nær 1000-2000 BP. Topp i sporet rundt 600 BP var typisk og karakteristisk for Holmen cDNA. (B) en representativ endelige sekvensering biblioteket spor. Dette biblioteket var av god kvalitet og utbytte, med de viktigste peak oppstår mellom 300-500 BP. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: celletyper og subpopulasjoner som er identifisert i en RNA-sekvens av menneskelige bukspyttkjertel holmer. Celler ble gruppert etter karakteristiske celletyper i løpet av t-distribuerte Stokastisk nabo embedding (tSNE) dimensjoner. Analysen avslørte også tre subpopulasjoner i α-celler og fire i β-celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reagensnavn | Vol. til bruk (μL) per reaksjon |
| RT reagens Mix | 50 |
| RT primer | 3,8 |
| Additiv A | 2,4 |
| RT enzym Mix | 10 |
| Totalt | 66,2 |
Tabell 1: omvendt transkripsjon mix.
| Reagensnavn | Volum til bruk (uL) per reaksjon |
| Nuklease-fritt vann | 9 |
| Buffer prøve opprydding 1 | 182 |
| Dynabeads MyOne Silan | 4 |
| Additiv A | 5 |
| Totalt | 200 |
Tabell 2: opprydding mix.
| Reagensnavn | Volum til bruk (uL) per reaksjon |
| Buffer EB | 98 |
| 10% mellom 20 | 1 |
| Additiv A | 1 |
| Totalt | 100 |
Tabell 3: eluering løsning.
| Reagensnavn | Volum til bruk (uL) per reaksjon |
| Nuklease-fritt vann | 8 |
| Forsterkning Master Mix | 50 |
| cDNA additiv | 5 |
| cDNA primer Mix | 2 |
| Totalt | 65 |
Tabell 4: cDNA forsterkning mix.
| Reagensnavn | Volum til bruk (μL) per reaksjon |
| Tagmentation enzym | 5 |
| Tagmentation buffer | 25 |
| Totalt | 30 |
Tabell 5: Tagmentation mix.
| Reagensnavn | Volum til bruk (μL) per reaksjon |
| Nuklease-fritt vann | 8 |
| Forsterkning Master Mix | 50 |
| SI-PCR primer | 2 |
| Totalt | 60 |
Tabell 6: eksempel indeks PCR Master mix.
| Eksempel-ID | % Leser med gyldige celle strekkoder | % Ekson leser i fanget celler blant totalt celler | % Ekson leser blant totalt leser | Mean ekson leser per celle | Median UMI per celle | Median gener per celle |
| Eksempel-1 | 92 prosent | 93 prosent | 76 prosent | 142 015 | 10 310 | 1 747 |
| Eksempel-2 | 92 prosent | 91 prosent | 74 prosent | 151 395 | 11 350 | 1 754 |
| Eksempel-3 | 94 prosent | 92 prosent | 75 prosent | 120 538 | 19 604 | 2 180 |
| Eksempel-4 | 95 prosent | 93 prosent | 67 prosent | 160 657 | 11 870 | 2 111 |
| Eksempel-5 | 94 prosent | 92 prosent | 62 prosent | 177 809 | 13 821 | 2 288 |
| Eksempel-6 | 95 prosent | 89 prosent | 67 prosent | 138 208 | 8 235 | 1 296 |
| Eksempel-7 | 94 prosent | 89 prosent | 72 prosent | 147 484 | 13 606 | 2 272 |
| Eksempel-8 | 94 prosent | 91 prosent | 69 prosent | 159 793 | 9 505 | 1 865 |
| Eksempel-9 | 95 prosent | 92 prosent | 72 prosent | 168 436 | 12 794 | 2 389 |
| Eksempel-10 | 83 prosent | 83 prosent | 74 prosent | 88 067 | 13 323 | 1 805 |
| Eksempel-11 | 82 prosent | 88 prosent | 77 prosent | 67 752 | 9 295 | 1 278 |
| Eksempel-12 | 91 prosent | 85 prosent | 74 prosent | 194 781 | 14 877 | 1 746 |
Tabell 7: Les justerings målinger.
| Celle type | Antall celler | Ave. celler per giver (standardavvik) |
| Alpha | 6546 | 546 (258) |
| Beta | 7361 | 613 (252) |
| Delta | 922 | 77 (37) |
| Pp | 545 | 45 (25) |
| Epsilon | 11 | 1 (1) |
| Acinar | 836 | 70 (71) |
| Ductal | 1313 | 109 (95) |
| Quiescent Stel | 225 | 19 (14) |
| Aktivert Stel | 890 | 74 (58) |
| Endothelial | 408 | 34 (21) |
| Macrophage | 80 | 7 (6) |
| Schwann | 37 | 3 (3) |
Tabell 8: sammensetning av celle type. Totalt antall celler for hver celle type og gjennomsnitts celler for hver giver i hver celle type.
Tilleggsfil 1: kommandoer som brukes til sekvens justering. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende fil 2: R skript for å utføre celle kvalitetskontroll, celle Clustering, og å identifisere celle-type beriket gener. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Single-Cell teknologier utviklet i de senere år gir en ny plattform for å karakterisere celletyper og studere molekylær heterogenitet i menneskelige bukspyttkjertelen holmer. Vi vedtok en protokoll av dråpe-basert mikrovæskebasert enkelt celle isolasjon og dataanalyse for å studere menneskelige holmer. Vår protokoll vellykket produsert RNA sekvensering data fra over 20 000 enkelt menneske Holme celler med relativt små variasjoner i sekvens kvalitet og batch-effekter.
Spesielt er to trinn avgjørende i denne protokollen for høy kvalitet utfall. Det må utvises forsiktighet ved dissociating av menneske holmer. Det er viktig å ikke fordøye de holmer. Partisjonering med én celle er et annet viktig trinn for et vellykket eksperiment med én celle. Vi demonstrerte eksempler på god-og dårlig kvalitet emulsjoner i Figur 3. En klar emulsjon er vanligvis en indikasjon på utilstrekkelig antall celler som samles i partisjonering trinn.
Tilgangen til isolerte primære menneskelige holmer er en rate-begrensende trinn for å generere store menneskelige Holmen single-Cell transcriptomes. Isolerte holmer fra individuelle Cadaver donorer behandles vanligvis på forskjellige tidspunkter, og dermed bør potensielle prøve avhengige satsvise effekter undersøkes nøye under dataanalyse. Integrerende analyse kan brukes til å identifisere vanlige celletyper og subpopulasjoner på tvers av individuelle partier41. Den satsvise effekten kan også justeres av batch-korrigert uttrykk kvantifisering42. En annen utfordring med å analysere enkelt celle RNA-SEQ-data er å identifisere doublets. I data pre-prosessering, tok vi tiltak for å fjerne endokrine doublets ved å identifisere celler som uttrykker flere hormon gener (GCG, ins, SST, PPY, og GHRL). Identifisering av doublets dannet av to forskjellige celletyper er en relativt enkel oppgave på grunn av den ekstremt høye uttrykk for endokrine hormoner. Den virkelige utfordringen er å identifisere innenfor-celle-type doublets, for eksempel, doublets av to α-celler. Fordi høyere UMI og høyere antall oppdagede gener er tankevekkende for potensielle doublets, er en løsning å fjerne outliers med et høyt antall gener og UMI under cellen QC trinn. I tillegg er verktøy for å oppdage doublets tilgjengelig43,44,45.
En stor begrensning av RNA-sekvenser med én celle er lav følsomhet. Bruke Spike-in eksterne RNA Controls Consortium (ERCC) RNAs, anslår vi at bare 10% av alle uttrykte gener ble oppdaget ved hjelp av gjeldende protokoll og at oppdaget de var forutinntatt mot høy overflod gener46. Bukspyttkjertelen endokrine celler uttrykker ekstremt høyt nivå av hormon gener (dvs. GCG, ins, SST, og PPY). Som et resultat, mRNAs av disse genene har risikoen for å bli ambient RNA. Slike bakgrunnslyder kan ikke unngås helt. Men denne trinn-for-trinn-protokollen vil hjelpe forskerne å minimere uønskede eksperimentelle lyder. Den nåværende protokollen er utformet for ferskt isolert vev. Andre teknologier, for eksempel single-nucleus RNA sekvensering47,48, er tilgjengelig for RNA-SEQ av fersk, frosset, eller lett fast vev. I tillegg kan en nylig utviklet celle hash teknologi49 betraktes som en avansert mikrovæskebasert enkelt celle protokoll som tillater sample multipleksing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere er ansatte og aksjonærer i Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
References
- Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
- Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552 (2012).
- Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
- Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
- Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
- Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
- Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
- van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694 (2015).
- Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499 (2010).
- Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
- Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
- Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
- Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
- Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
- Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
- Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
- Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
- Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
- Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
- Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
- Chemometec. Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
- 10X Genomics. 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , 10X Genomics. (2017).
- Agilent Technologies. Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , Agilent Technologies. (2013).
- Thermo Fischer Scientific. Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , Thermo Fischer Scientific. (2015).
- Illumina. Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , Illumina. (2016).
- Illumina. llumina NextSeq 500 System Guide. , Illumina. (2018).
- Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
- DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
- McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
- Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
