Summary
Aquí, presentamos un protocolo para generar datos de transcriptoma de alta calidad y a gran escala de células individuales de islotes pancreáticos humanos aislados utilizando una tecnología de secuenciación de ARN microfluídico microfluídico basada en gotas.
Abstract
Los islotes pancreáticos comprenden células endocrinas con patrones distintivos de expresión hormonal. Las células endocrinas muestran diferencias funcionales en respuesta a condiciones normales y patológicas. El objetivo de este protocolo es generar datos de transcriptoma de alta calidad y a gran escala de cada tipo de célula endocrina con el uso de una tecnología de secuenciación de ARN microfluídico basada en gotas. Estos datos se pueden utilizar para construir el perfil de expresión génica de cada tipo de célula endocrina en condiciones normales o específicas. El proceso requiere un manejo cuidadoso, una medición precisa y un riguroso control de calidad. En este protocolo, describimos pasos detallados para la disociación, secuenciación y análisis de datos de islotes pancreáticos humanos. Los resultados representativos de unas 20.000 células de islet único humano demuestran la aplicación exitosa del protocolo.
Introduction
Los islotes pancreáticos liberan hormonas endocrinas para regular los niveles de glucosa en sangre. Cinco tipos de células endocrinas, que difieren funcional y morfológicamente, están implicados en este papel esencial: las células producen glucagón, insulina de células, somatostatina de células de células PP, polipéptido pancreático de células PP y células de la ghrelina1. La generación de perfiles de expresión génica es un enfoque útil para caracterizar las células endocrinas en condiciones normales o específicas. Históricamente, todo el perfil de expresión génica del islet se generó utilizando microarray y secuenciación de ARN de próxima generación2,3,4,5, 7 , 8. Aunque todo el transcriptoma de islet es informativo para identificar las transcripciones específicas de órganos y los genes candidatos a la enfermedad, no logra descubrir la heterogeneidad molecular de cada tipo de célula de isla. La técnica de microdisección de captura láser (LCM) se haaplicado para obtener directamente tipos de células específicas de los islotes 9,10,11,12, pero se queda corto de pureza de la célula objetivo Población. Para superar estas limitaciones, se ha utilizado la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para seleccionar poblaciones específicas de células endocrinas, como las células13,14,15,16 , 17 , 18. Por otra parte, Dorrell y otros utilizaron un enfoque de clasificación facS basado en anticuerpos para clasificar las células en cuatro subpoblaciones19. Las células de los isletes ordenadas por FACS también se pueden chapar para la secuenciación de ARN de células individuales; sin embargo, los métodos basados en placas se enfrentan a desafíos en escalabilidad20,21,22.
Para generar datos de transcriptoma de alta calidad y a gran escala de cada tipo de célula endocrina, aplicamos tecnología microfluídica a las células de los isletes humanos. La plataforma microfluídica genera datos de transcriptoma a partir de un gran número de células individuales de una manera escalable, de alto rendimiento, alta calidad y escalable23,24,25,26,27. Además de revelar las características moleculares de un tipo de célula capturada en una gran cantidad, la plataforma microfluídica altamente escalable permite la identificación de tipos de células raras cuando se proporcionan suficientes células. Por lo tanto, la aplicación de la plataforma a los islotes pancreáticos humanos permitió perfilar células de ghrelina-secreting, un tipo de célula endocrina rara con función poco conocida debido a su escasez28. En los últimos años, varios estudios han sido publicados por nosotros y otros informando datos de transcriptoma a gran escala de islotes humanos utilizando la tecnología29,30,31,32, 33. Los datos están a disposición del público y recursos útiles para que la comunidad de islote estudie la heterogeneidad de células endocrinas y su implicación en las enfermedades.
Aquí, describimos un protocolo de secuenciación de ARN microfluídico microfluídico basado en gotas, que se ha utilizado para producir datos de transcriptoma de aproximadamente 20.000 células de islos humanos, incluyendo las células de ", ", ", ", ", ", ", "y" y una proporción más pequeña de células no endocrinas 32. El flujo de trabajo comienza con islotes humanos aislados y representa los pasos de disociación de células de islotes, captura de una sola célula y análisis de datos. El protocolo requiere el uso de islotes recién aislados y se puede aplicar a los islotes de los seres humanos y otras especies, como los roedores. Con este flujo de trabajo, se pueden crear atlas de celda de islet imparciales y completos bajo línea base y otras condiciones.
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Protocol
1. Disociación de isla humana
- Obtener islotes humanos aislados de donantes de órganos cadáveres de ambos sexos, con edades entre 15 y 80 años, sin enfermedades preexistentes, a menos que se requieran islotes de donantes con datos demográficos específicos para el propósito del estudio.
- Después del aislamiento, haga que los islotes aislados se mantengan en la instalación de cultivo de tejidos durante 2-3 días en el proveedor. A menudo se tarda más de 1 día en hacerse visibles los daños en los islos.
- Coloque los islotes en una botella y sumerja completamente en el medio del isla. Llevarlo al laboratorio por envío nocturno.
- Obtenga la cantidad equivalente de islotes (IEQ) de los islotes enviados del proveedor de islotes.
- Recuperar islotes del envío el día de la llegada del islotes. Realice este paso utilizando una capucha para minimizar la posibilidad de contaminación.
- Enfriar el medio de isla completo (CMRL-1066, 10% (v/v) FBS, 1x Pen-Strep, 2 mM de glutamina) en nevera.
- Transfiera los islotes de la botella a un tubo cónico de 50 ml.
- Agregue 10 ml de medios de islotes completos preenfriados al frasco vaciado para lavar los islotes restantes. Transfiera el soporte al tubo cónico.
- Centrifugar el tubo a 200 x g durante 2 min para recuperar islotes. Aspirar el sobrenadante dejando alrededor de 1-2 mL medios con el pellet.
- Resuspenda los islotes con medios de islotes completos preenfriados. Basado en el IEQ proporcionado por el proveedor, agregue 12 ml de medios por 5000 IEQ.
- Vierta los islotes en los medios en un plato de cultivo de tejido no tratado de 10 cm. Incubar durante la noche en una incubadora de cultivos tisulares a 37 oC con un 5% deCO2 en el aire atmosférico.
- Islotes disociados como se muestra a continuación. Realice este paso después de la incubación durante la noche.
- Precalentamiento completo de medios de isla y solución de disociación celular.
- Preparar 1pbS que contenga 0,04% de BSA a temperatura ambiente.
- Cuente y recoja a mano 200-300 islotes utilizando una pipeta P200 y transfiera los islotes a un tubo cónico de 15 ml que contenga medios de islotes completos precalentados de 5 ml.
- Recoger los islotes por centrifugación a 200 x g durante 2 min. Aspirar suavemente el sobrenadante sin perturbar el pellet en la parte inferior.
- Añadir 1.0 mL solución de disociación celular precalentada y interrumpir el pellet pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Incubar los islotes a 37oC durante 9-11 min. Cada pipeta de 3 minutos hacia arriba y hacia abajo lentamente durante 10 s para disociar las células en células individuales.
- Una vez que las células del islet estén bien disociadas y la solución se vuelva turbia, agregue medios de islet completos de 9 ml y filtre a través de un colador de celda de 30 m en un nuevo tubo cónico de 15 ml.
- Lave el tubo y el colador celular con medios de islotes completos de 2 ml para recoger los islotes restantes y agregarlo al mismo tubo.
- Recoger las células por centrifugación a 400 x g durante 5 min.
- Aspirar suavemente los medios y resuspender el pellet celular en 5 ml 1x PBS que contenga 0,04% de BSA (PBS-BSA).
- Filtrar a través de un nuevo colador de células de 30 m en un tubo cónico de 15 ml y centrífuga a 400 x g durante 5 minutos para recoger las células.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 200-300 sl 1x solución PBS-BSA.
- Mida la concentración celular y ajuste el volumen a una concentración final de 400-500 células/ L.
2. Control de calidad de la suspensión de una sola célula
- Determine la concentración celular utilizando un contador de células automatizado basado en fluorescencia34.
- Mezclar células de 10 ml con AO/DAPI de 0,5 ml. Las pipetas se mezclan bien. Cargue 10,5 l en la diapositiva y ejecute el ensayo de recuento de celdas para determinar el recuento y la viabilidad.
- Diluir y/o filtrar la suspensión celular según sea necesario en función del recuento de células.
3. Partición de una sola célula utilizando un chip microfluídico. Siga el protocolo del fabricante de chips microfluídicos35.
- Lleve 3' perlas de gel y reactivos de transcripción inversa (RT) a temperatura ambiente (>30 min). Reconstituya la imprimación RT en el búfer TE si es necesario.
- Prepare la mezcla maestra RT en un tubo de unión baja como se describe en la Tabla1.
- Determine el número de celdas que se introducirán para cada muestra. Calcule el volumen de suspensión de celda (X) necesario para entregar el número de celda de destino deseado. El volumen calculado de agua libre de nucleasas para añadir a cada muestra será de 33,8-X de L.
- Para que cada muestra se particione, añada agua libre de nucleasas de 33,8-X X en un tubo de tira de PCR de 0,2 ml. A continuación, agregue una mezcla maestra de 66,2 l a cada tubo de tira. No agregue las células al tubo de la tira en este punto. Pipetear suavemente para mezclar. Coloque los tubos de tiras preparados sobre hielo.
- Coloque un chip microfluídico en una caja de viruta. Orientar la caja de viruta asegurando que los pozos de aceite (fila etiquetada 3) estén más cerca de la persona que realiza el experimento.
- Si ejecuta menos de 8 muestras, utilice 50% de glicerol para rellenar los canales no utilizados en el siguiente orden:
- Añadir 90 l de glicerol al 50% de glicerol en los pozos de la fila 1 para todos los canales no utilizados.
- Añadir 40 s de 50% de glicerol en los pozos de la fila 2 para todos los canales no utilizados.
- Añadir 270 l de glicerol al 50% de glicerol en los pozos de la fila 3 para todos los canales no utilizados.
- Enganche las cuentas de gel en un vórtice. Vortex a toda velocidad durante 30 s. Toque la tira en la parte superior del banco varias veces para recoger cuentas. Confirme que no hay burbujas presentes.
- Agregue X l de células en los tubos de tiras preparados. Pipeta para mezclar 5 veces. Sin desechar las puntas de la pipeta, transfiera 90 ml de mezcla celular a la fila 1 del chip.
- Espere 30 s y, a continuación, cargue 40 s de perlas de gel en la fila 2. Pipetear muy lentamente para este paso. Dispensar 270 l de aceite de partición a los pozos de la fila 3.
- Enganche la junta de la viruta a las pestañas del soporte de la viruta. Coloque el soporte de chip montado en el dispositivo de particionamiento de una sola celda y pulse el botón de ejecución.
- Retire inmediatamente el soporte de viruta montado al finalizar el funcionamiento.
- Retire la junta de la viruta del soporte, abra la caja de la viruta en un ángulo de 45o y retire 100 s de la emulsión del chip en una placa de plástico azul de 96 pocillos.
4. Amplificación de ADNc de una sola célula. Siga el protocolo del fabricante de chips microfluídicos35.
- Transcripción inversa.
NOTA: Realice este paso bajo una capucha limpia sólo pcR para evitar la contaminación microbiana y de otro tipo del ADNC no amplificado.- Selle la placa azul de 96 pocillos con un sello de papel de aluminio en un sellador de placas calentada.
- Ejecuta la reacción de transcripción inversa en un ciclor térmico de la siguiente manera: 53oC durante 45 min a 85oC durante una retención de 5 min a 4 oC.
NOTA: Este es un punto de parada seguro. Las muestras pueden aguantar a 4oC hasta 72 h.
- Purificación post-RT
- Lleve las perlas magnéticas de unión a ácido nucleico y las perlas magnéticas de selección de tamaño de ácido nucleico a temperatura ambiente y vórtice para volver a suspender. En este punto, descontese el búfer de limpieza de muestras durante 10 minutos a 65 oC. Lleve todos los demás reactivos a temperatura ambiente y vórtice.
- Prepare los buffers tal y como se muestra en de las Tablas 2 y Tablas3.
- Romper químicamente la emulsión y purificar.
- Para ello, retire suavemente el sello de la lámina de la placa.
- Dispensar 125 ml de reactivo de ruptura de emulsión rosa en cada emulsión. Espere 1 min y, a continuación, transfiera todo el volumen a un tubo de tira limpio de 0,2 ml. Asegúrese de que haya una capa de clara y una capa de color rosa en el tubo de la tira.
- Retire 125 l de la capa rosa de la parte inferior del tubo de la tira sin perturbar la capa transparente. Es normal que un pequeño volumen (-15 l) de la capa rosa permanezca en el tubo.
- Añadir 200 l de mezcla de limpieza de la Tabla 2 al tubo de tira e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
- Transfiera el tubo de tira a un soporte magnético y deje que la solución se despeje. Retire el sobrenadante y deseche, luego lave las perlas con 80% de etanol dos veces. Deje que las perlas se sequen durante 1 min.
- Retire el tubo de la tira del imán y agregue 35,5 l de solución de elución de la Tabla 3 a las perlas. Pipetear para resuspender las perlas en la solución. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente.
- Transfiera el tubo de tira a un soporte magnético y deje que la solución se despeje. Retire el ADNc purificado del tubo de tira y dispérdalo para limpiar los tubos de tira de 0,2 ml.
- Amplifica rinde el ADNc.
- Prepare la mezcla maestra de amplificación en la Tabla4, a continuación.
- Añadir 65 s de mezcla maestra de amplificación de ADNc a cada muestra. Colocar el tubo de la tira en un ciclor térmico y ejecutar el siguiente programa: 98 oC 3 min a 15 ciclos de [98 oC 15 s a 67 s 20 s a 72 oC 1 min] a 72 oC 5 minutos a 4 oC de retención
NOTA: Este es un punto de parada seguro. Las muestras pueden aguantar a 4oC durante un máximo de 72 h. - Purificar el ADNc amplificado con 0.6x de tamaño de ácido nucleico selección de perlas magnéticas. Lavar dos veces con 80% de etanol y elute con 40,5 l.
- Ejecute el cDNA de control de calidad utilizando electroforesis de gel automatizada y el ensayo de cuantificación de ADN basado en fluorescencia36,37.
NOTA: Este es un punto de parada seguro. Las muestras pueden sostenerse a 4 oC durante un máximo de 72 h o a -20 oC indefinidamente.
5. Construcción de bibliotecas de secuenciación
- Tagmentación y limpieza de cDNA38.
- Normalizar el ADNc a 50 ng en 20 s del volumen total. La cuantificación exacta es fundamental en este paso.
- Haga la mezcla de etiquetas en la Tabla 5 y la alícuota de 30 l a cada muestra de ADNc de 20 l sobre hielo. Coloque las muestras en el ciclor térmico y ejecute el protocolo de etiquetación: 55 oC 5 min a 10 oC de retención.
- Realice la limpieza del ADNes tagmented usando las columnas38. Agregue un búfer de unión de ADN de 180 l a cada muestra. Transfiera 230 l a una columna de giro.
- Centrifugar a 1300 x g durante 2 min y desechar el flujo.
- Lavar dos veces con un tampón de lavado de ADN de 300 ml. Centrifugar 2 min adicionales a 1300 x g para garantizar la eliminación del etanol.
- Eluir elAD tagmentado purificado añadiendo 31 sl de tampón de elución a la columna e incubar a temperatura ambiente durante 2 min.
- Centrífuga durante 2 min a 1300 x g para recuperar el producto purificado.
- PCR de índice de ejemplo.
- Elija códigos de barras que no se superpongan durante una ejecución de secuenciación multiplexada.
- Haga una mezcla maestra de PCR de índice de muestra como se muestra en la Tabla6.
- Añadir 60 l de mezcla maestra de PCR de índice de muestra a 30 l de la muestra purificada.
- Añadir 10 ml de un índice de muestra de 20 m y 4 oligoes a cada muestra (índice de registro utilizado). El volumen total de reacción es ahora de 100 l.
- Colocar en un ciclor térmico con la tapa fijada a 105oC. Ejecutar el siguiente programa: 98 oC 45 s a 12-14 ciclos de [98 oC 20 s a 54 s a 72 oC 20 s] a 72 oC 1 min a 4 oC de retención.
NOTA: Este es un punto de parada seguro. Las muestras pueden aguantar a 4oC hasta 72 h.
- Purifique las bibliotecas con doble limpieza de cuentas.
- Añadir 100 l de perlas magnéticas de selección de tamaño de ácido nucleico a la muestra y mezclar bien con una pipeta. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
- Transfiera a un imán y déjelo reposar hasta que la solución se despeje. Retire y deseche el sobrenadante.
- Lavar dos veces con 200 ml de etanol al 80%.
- Secar las perlas en el imán durante 2 min. Retire del imán y agregue 50,5 ml de EB Buffer al pellet de perla. Pipeta para volver a suspender las perlas en el búfer.
- Incubar a temperatura ambiente durante 2 min. Pasar a un imán y dejar reposar durante 2 min. Transfiera 50 l de muestra eluida a un tubo de tira limpia.
- Añadir perlas magnéticas de selección de tamaño de ácido nucleico de 40 l a la muestra e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Transfiera a un imán y deje que la solución se despeje. Retire y deseche el sobrenadante.
- Lavar dos veces con 125 s l de etanol al 80%.
- Secar las perlas en el imán durante 2 min. Retire del imán y agregue 60,5 ml de EB Buffer al pellet de perla. Pipeta para volver a suspender las perlas en el búfer.
- Incubar a temperatura ambiente durante 2 min. Transferir a un imán y dejar reposar durante 2 min. Transfiera 50 l de muestra eluida a un tubo de tira limpia. Esta es la biblioteca final.
- Sostenga las muestras a 4 oC durante un máximo de 72 h o a -20 oC indefinidamente. Tenga en cuenta que este es un punto de parada seguro.
- Cuantifique y ejecute el control de calidad de las bibliotecas finales utilizando electroforesis de gel automatizada y el ensayo de cuantificación de ADN basado en fluorescencia36,37. Diluir las muestras 1:10 antes de ejecutar el control de calidad.
6. Secuenciación de bibliotecas
- Normalizar cada muestra a secuenciar a 2 ng/L y agrupación de 3 l de cada muestra normalizada juntas.
- Mida la concentración de la piscina con el ensayo de cuantificación de ADN basado en fluorescencia37.
- Diluir la piscina a 0,25 ng/L.
- Desnaturalizar la piscina de la siguiente manera: 12 l de muestra agrupada diluida (0,25 ng/L) + 1 l de control de ADN (1 nM), 2 l de búfer EB + 5 l de NaOH (0,4 N). Dejar que esta incubación durante 5 min, luego añadir 10 sL de 200 mM Tris pH 8.0.
- Cargue 4,05 s en 1345,95 ht1. Cargue 1,3 ml en el cartucho del secuenciador y ejecute de acuerdo con las directrices del fabricante39 utilizando una receta de secuenciación con 26 ciclos (Lectura 1) + 8 ciclos (i7 Index) + 0 ciclos (i5 Index) + 55 ciclos (Lectura 2).
7. Alineación de lectura (Archivo suplementario 1)
- Ejecute Cell Ranger (v2.0.0) para demultiplexar archivos de llamada base sin procesar (BCL) generados por la secuenciación en archivos FASTQ. Alinee los archivos FASTQ con el ensamblaje humano del genoma B37.3 y el modelo de gen UCSC para obtener la cuantificación de la expresión.
- Control de calidad de alineación.
- Genere métricas de alineación y compruebe las bases Q30, la fracción de código de barras válida, la fracción de lectura asociada a la celda, la fracción de lectura asignada y las lecturas detectadas en cada celda.
- Examine la gráfica de clasificación del código de barras para asegurarse de que la separación de los códigos de barras asociados a la celda y el fondo.
8. Análisis de datos (Archivo Suplementario 2)
- Control de calidad celular y preproceso.
- Excluya las células con < 500 genes detectados, < 3000 número total de identificador molecular único (UMI), > 0,2 puntuación de viabilidad como se describió anteriormente32. Ajuste los cortes de acuerdo con los tipos de tejido y células.
- Retire los dobletes.
- Evaluar los cinco genes de la hormona endocrina (glucagón - GCG, insulina - INS, somatostatina - SST, polipéptido pancreático - PPYy ghrelina - GHRL) para el patrón de expresión bimodal (modo de alta y baja expresión) utilizando R paquete mclust40.
- Retire las células que expresan más de un gen hormonal, es decir, con dos o más genes hormonales en el modo de alta expresión.
- Normalizar la expresión génica por el UMI total y multiplicar por el factor de escala de 10.000 a nivel celular utilizando el paquete R Seurat41.
- Eliminar genes detectados en menos de 3 células.
- Detectar genes variables utilizando la expresión media y la dispersión de todas las células. Ajuste los cortes de acuerdo con los tipos de tejido y células.
- Realice el análisis del componente principal con los genes variables. Clúster de celdas con el número seleccionado de componentes principales. Derivar genes enriquecidos de cúmulo de células comparando un cúmulo de células con el resto de las células.
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Representative Results
El flujo de trabajo de secuenciación de ARN de una sola célula consta de tres pasos: disociar islotes humanos intactos en suspensión de una sola célula, capturar células individuales utilizando una tecnología basada en gotas y analizar datos de ARN-seq (Figura1). En primer lugar, los islotes humanos adquiridos fueron incubados de la noche a la mañana. Los islotes intactos se examinaron bajo el microscopio (Figura2A). La integridad de las células islotes disociadas se ha validado utilizando la hibridación in situ de fluorescencia de ARN (RNA-FISH). Como se muestra en la Figura 2B,las células disociadas de las células -y de la figura se visualizaron utilizando sondas de ARNm GCG e INS, respectivamente.
El recuento de celdas y la viabilidad deben determinarse antes del paso de captura de una sola celda. Las células con baja viabilidad o alta resistencia a los residuos no son adecuadas para el procesamiento posterior. Una buena concentración celular generalmente oscila entre 400 y 500 células/ L. Aproximadamente 6000 células fueron cargadas al chip microfluídico en el paso de partición de una sola célula, y 100 l de perlas de gel en emulsión fueron retiradas del chip. La Figura 3A ejemplifica un ejemplo exitoso de emulsión después del paso de particionamiento. El líquido en cada punta de pipeta es uniforme pálido turbio con aceite de partición mínima separado de las perlas de gel. Por el contrario, la Figura 3B muestra una emulsión de mala calidad con una clara separación de fase entre las perlas de gel y el aceite. Esto podría deberse a un obstrucción durante la ejecución del chip.
Después de la partición de una sola célula, se realizó la amplificación del ADNc. La Figura 4A ilustra una distribución representativa del tamaño del fragmento después de la amplificación del ADNc. El pico típico para una muestra de ADNc de buena calidad residía cerca de 1000-2000 bp. Curiosamente, un pico cerca de 600 bp era específico de los cDNA de los isla. La distribución del tamaño del fragmento para las bibliotecas RNA-seq estaba entre 300 y 500 bp (Figura4B).
Después de la secuenciación, empleamos un conjunto de métricas de alineación de lectura para evaluar la calidad de datos DE ARN-seq de una sola célula (Tabla 7). Las tres primeras métricas bien resumidas calidad de la biblioteca de secuenciación de una sola célula. En promedio, el 92% de las lecturas se derivaron de celdas intactas y el 72% de las lecturas fueron mapeadas a exons. De todas las lecturas de exón capturadas en gotas, el 90% de ellas fueron producidas por células intactas y el resto probablemente fueron ARN ambientales en gotas libres de células. Estas métricas de alineación sugieren una buena calidad de los datos. La relación entre las lecturas de exón y LA UMI fue una medida empírica para evaluar la saturación de secuenciación y, por lo general, la relación 10:1 era un buen indicador. Además, el número de genes detectados (UMI > 0) era una característica útil para caracterizar diferentes tipos de células. Para las células de los isletes humanos, el número de genes detectados es de aproximadamente 1.900 en cada célula.
Secuenciamos un total de 20.811 células de islos de 12 donantes no diabéticos. La expresión de más de una hormona se detectó en aproximadamente el 6% de las células. Estas células multihormonales son probablemente dobletes porque nuestro trabajo anterior mostró que menos de < 0.1% de las células de un solo islet co-expresa más de una hormona endocrina33. Eliminamos todas las células multihormonales identificadas. También es importante excluir las células de baja calidad basadas en el UMI total, los genes detectados y la viabilidad celular33. Después de estos pasos de control de calidad, 19.174 permanecieron para un análisis posterior. El análisis de agrupamiento reveló 12 tipos de células: células de PP, células, células, células, células, écelis, célgones, estelares activadas, endoteliales, macrófagos y mástiles (Figura5). Como era de esperar, las células endocrinas fueron la mayoría (Tabla8). Los genes enriquecidos superiores en las células (es decir, GCG, TTR, CRYBA2, TM4SF4, TMEM176B)y las células (es decir, IAPP, INS, HADH, DLK1, RBP4)son coherentes con otros 13,15,16,17,18,20,21,22,29 ,30,31,33. Curiosamente, tanto las células de la célula como las de la célula consistían en varias subpoblaciones. Tres subpoblaciones de células, Beta sub1, 2 y 3, eran similares con un pequeño número de genes enriquecidos con subpoblación (18 en Beta sub1, 33 en Beta sub 2 y 18 en Beta sub 3). La cuarta subpoblación tenía 488 genes enriquecidos. La pequeña subpoblación de células (Alpha sub3) comprendía células proliferantes, caracterizadas por una expresión enriquecida de MKI67, CDK1y TOP2A.
Figura 1: Diagrama esquemático del flujo de trabajo de secuenciación de ARN de una sola célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes representativas de islotes humanos intactos y disociados. (A) Una imagen de islotes tomados después de la incubación durante la noche. (B) Células de islet disociadas visualizadas por tinción DE ARN-FISH para INS (blanco) y GCG (rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Examen de la calidad de la emulsión de una sola célula antes de la transcripción inversa. (A) Una emulsión de una sola célula de buena calidad. El líquido en cada punta de pipeta estaba homogéneamente turbio. (B) Una emulsión de una sola célula de mala calidad. El líquido en la punta de la pipeta no era homogéneo y mostraba separación entre el aceite y las perlas de gel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Examen de la calidad del ADNc y la biblioteca de una sola célula. (A) Un representante de los rastros de ADNc. Este ADNc fue de buena calidad y rendimiento, con el pico principal para la muestra que se produce cerca de 1000-2000 bp. El pico en el rastro alrededor de 600 bp era típico y distintivo de la placa de entrada de isla. (B) Un seguimiento representativo de la biblioteca de secuenciación final. Esta biblioteca era de buena calidad y rendimiento, con el pico principal que ocurre entre 300-500 bp. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Tipos de células y subpoblaciones identificadas en la secuenciación de ARN de una sola célula de islotes pancreáticos humanos. Las celdas se agrupaban mediante tipos de celdas distintivos en el espacio de dimensiones de incrustación de vecinos estocásticos distribuidas en t (tSNE). El análisis también reveló tres subpoblaciones en las células de la célula y cuatro en las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre del reactivo | Vol. a usar (L) por reacción |
| MEZCLA de reactivos RT | 50 |
| RT Primer | 3.8 |
| Aditivo A | 2.4 |
| Mezcla de enzimas RT | 10 |
| Total | 66.2 |
Tabla 1: Mezcla de transcripción inversa.
| Nombre del reactivo | Volumen a usar (uL) por reacción |
| Agua libre de nucleasas | 9 |
| Limpieza de la muestra de búfer 1 | 182 |
| Dynabeads MyOne Silane | 4 |
| Aditivo A | 5 |
| Total | 200 |
Tabla 2: Mezcla de limpieza.
| Nombre del reactivo | Volumen a usar (uL) por reacción |
| Buffer EB | 98 |
| 10% Tween 20 | 1 |
| Aditivo A | 1 |
| Total | 100 |
Tabla 3: Solución de elución.
| Nombre del reactivo | Volumen a usar (uL) por reacción |
| Agua libre de nucleasas | 8 |
| Amplificación Master Mix | 50 |
| aditivo cDNA | 5 |
| cDNA Primer Mix | 2 |
| Total | 65 |
Tabla 4: mezcla de amplificación de ADNc.
| Nombre del reactivo | Volumen a usar (L) por reacción |
| Enzima de tagmentación | 5 |
| Zona de influencia de la etiqueta | 25 |
| Total | 30 |
Tabla 5: Mezcla de etiquetas.
| Nombre del reactivo | Volumen a usar (L) por reacción |
| Agua libre de nucleasas | 8 |
| Amplificación Master Mix | 50 |
| SI-PCR Primer | 2 |
| Total | 60 |
Tabla 6: Mezcla maestra pcR de índice de muestra.
| ID de muestra | % Lecturas con códigos de barras de celda válidos | % Exon Lee en células capturadas entre células totales | % Exon Lee entre lecturas totales | Lecturas medias de Exon por celda | Mediana de UMI por célula | Genes medios por célula |
| Muestra-1 | 92% | 93% | 76% | 142.015 | 10.310 | 1.747 |
| Muestra-2 | 92% | 91% | 74% | 151.395 | 11.350 | 1.754 |
| Muestra-3 | 94% | 92% | 75% | 120.538 | 19.604 | 2.180 |
| Muestra-4 | 95% | 93% | 67% | 160.657 | 11.870 | 2.111 |
| Muestra-5 | 94% | 92% | 62% | 177.809 | 13.821 | 2.288 |
| Muestra-6 | 95% | 89% | 67% | 138.208 | 8.235 | 1.296 |
| Muestra-7 | 94% | 89% | 72% | 147.484 | 13.606 | 2.272 |
| Muestra-8 | 94% | 91% | 69% | 159.793 | 9.505 | 1.865 |
| Muestra-9 | 95% | 92% | 72% | 168.436 | 12.794 | 2.389 |
| Muestra-10 | 83% | 83% | 74% | 88.067 | 13.323 | 1.805 |
| Muestra-11 | 82% | 88% | 77% | 67.752 | 9.295 | 1.278 |
| Muestra-12 | 91% | 85% | 74% | 194.781 | 14.877 | 1.746 |
Tabla 7: Leer métricas de alineación.
| Tipo de celda | Número de células | Células Ave. por donante (desviación estándar) |
| Alfa | 6546 | 546 (258) |
| Beta | 7361 | 613 (252) |
| Delta | 922 | 77 (37) |
| Pp | 545 | 45 (25) |
| Epsilon | 11 | 1 (1) |
| Acinar | 836 | 70 (71) |
| Ductal | 1313 | 109 (95) |
| El celosimo del reposo | 225 | 19 (14) |
| Estelar activado | 890 | 74 (58) |
| Endoteliales | 408 | 34 (21) |
| Macrófago | 80 | 7 (6) |
| Schwann | 37 | 3 (3) |
Tabla 8: Composición del tipo de celda. Número total de celdas para cada tipo de celda y celdas promedio para cada donante en cada tipo de celda.
Archivo suplementario 1: Comandos utilizados para la alineación de secuencias. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo suplementario 2: Scripts de R para realizar el control de calidad celular, agrupación de células e identificar genes enriquecidos de tipo celular. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Las tecnologías de una sola célula desarrolladas en los últimos años proporcionan una nueva plataforma para caracterizar los tipos celulares y estudiar la heterogeneidad molecular en islotes pancreáticos humanos. Adoptamos un protocolo de aislamiento microfluídico de una sola célula basado en gotas y análisis de datos para estudiar islotes humanos. Nuestro protocolo produjo con éxito datos de secuenciación de ARN de más de 20.000 células de islotes humanos individuales con variaciones relativamente pequeñas en la calidad de la secuencia y los efectos por lotes.
En particular, dos pasos son críticos en este protocolo para obtener resultados de alta calidad. Se debe tener precaución al disociar los islotes humanos. Es importante no digerir demasiado los islotes. La partición de una sola celda es otro paso clave para un experimento de una sola célula correcto. Demostramos ejemplos de emulsiones de buena y mala calidad en la Figura3. Una emulsión clara suele ser un indicativo del número inadecuado de células que se recopilan en el paso de partición.
El acceso a islotes humanos primarios aislados es un paso limitador para generar transcriptomes de una sola célula de islotes humanos a gran escala. Los islotes aislados de donantes individuales de cadáveres generalmente se procesan en diferentes momentos, por lo que los posibles efectos por lotes dependientes de la muestra deben examinarse cuidadosamente durante el análisis de datos. El análisis integrador se puede utilizar para identificar tipos de células y subpoblaciones comunes en lotes individuales41. El efecto de lote también se puede ajustar mediante la cuantificación de expresiones corregidas por lotes42. Otro desafío para analizar los datos de ARN-seq de una sola célula es identificar dobletes. En el preprocesamiento de datos, tomamos medidas para eliminar los dobletes endocrinos mediante la identificación de células que expresan múltiples genes hormonales (GCG, INS, SST, PPYy GHRL). La identificación de dobletes formados por dos tipos de células diferentes es una tarea relativamente fácil debido a la expresión extremadamente alta de hormonas endocrinas. El verdadero desafío es identificar dobletes dentro de tipo cell, por ejemplo, dobletes por dos células. Debido a que un mayor UMI y un mayor número de genes detectados sugieren posibles dobletes, una solución es eliminar los valores atípicos con un alto número de genes y UMI durante el paso de control de calidad celular. Además, las herramientas para detectar dobletes están disponibles43,44,45.
Una limitación importante de la secuenciación de ARN de una sola célula es la baja sensibilidad. Utilizando ARN del Consorcio de Controles de ARN Externo (ERCC), estimamos que sólo el 10% de todos los genes expresados se detectaron utilizando el protocolo actual y que los detectados estaban sesgados hacia genes de alta abundancia46. Las células endocrinas pancreáticas expresan un nivel extremadamente alto de genes hormonales (es decir, GCG, INS, SSTy PPY). Como resultado, los ARNm de estos genes tienen el riesgo de convertirse en ARN ambiental. Estos ruidos de fondo no se pueden evitar por completo. Sin embargo, este protocolo paso a paso ayudará a los investigadores a minimizar los ruidos experimentales no deseados. El protocolo actual está diseñado para tejidos recién aislados. Otras tecnologías, como la secuenciación de ARN de un solo núcleo47,48, están disponibles para ARN-seq de tejidos frescos, congelados o ligeramente fijos. Además, una tecnología de hash de células desarrollada recientemente49 se puede considerar como un protocolo microfluídico avanzado de una sola célula que permite la multiplexación de muestras.
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Disclosures
Todos los autores son empleados y accionistas de Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Acknowledgments
Ninguno
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
References
- Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
- Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552 (2012).
- Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
- Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
- Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
- Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
- Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
- van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694 (2015).
- Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499 (2010).
- Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
- Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
- Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
- Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
- Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
- Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
- Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
- Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
- Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
- Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
- Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
- Chemometec. Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
- 10X Genomics. 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , 10X Genomics. (2017).
- Agilent Technologies. Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , Agilent Technologies. (2013).
- Thermo Fischer Scientific. Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , Thermo Fischer Scientific. (2015).
- Illumina. Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , Illumina. (2016).
- Illumina. llumina NextSeq 500 System Guide. , Illumina. (2018).
- Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
- DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
- McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
- Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
