Summary
Здесь мы представляем протокол для создания высококачественных, крупномасштабных транскриптомных данных одиночных клеток из изолированных островков поджелудочной железы человека с использованием капли на основе микрофлюидной одноклеточной технологии секвенирования РНК.
Abstract
Островки поджелудочной железы состоят из эндокринных клеток с отличительными шаблонами экспрессии гормонов. Эндокринные клетки показывают функциональные различия в реакции на нормальные и патологические состояния. Целью этого протокола является создание высококачественных крупномасштабных транскриптомных данных каждого типа эндокринных клеток с использованием микрофлеатной микрофлюйдной одноклеточной технологии секвенирования РНК. Такие данные могут быть использованы для создания профиля экспрессии генов каждого типа эндокринных клеток в нормальных или конкретных условиях. Этот процесс требует тщательной обработки, точного измерения и строгого контроля качества. В этом протоколе мы описываем подробные шаги для диссоциации островков поджелудочной железы человека, секвенирования и анализа данных. Репрезентативные результаты около 20 000 человек одиночных клеток-аклетов свидетельствуют об успешном применении протокола.
Introduction
Островки поджелудочной железы высвобождают эндокринные гормоны для регулирования уровня глюкозы в крови. Пять типов эндокринных клеток, которые отличаются функционально и морфологически, участвуют в этой важной роли: клетки производят глюкагон, инсулин, соматостатин, pp-клетки поджелудочной железы полипептид, и грелин1. Профилирование экспрессии генов является полезным подходом для характеристики эндокринных клеток в нормальных или специфических условиях. Исторически сложилось так, что весь вид экспрессии генов на протяжениивсего йога генерировался с помощью микроаррей и секвенирования РНК следующего поколения 2,3,4,5,6,7 , 8. Хотя весь транскриптом островка информативн для того чтобы определить орган-специфически еранты и гены кандидата заболевания, оно не сумеет расчехлить молекулярную неоднородность каждого типа клетки островка. Лазерный захват микродиссекции (LCM) техника была применена непосредственно для получения конкретных типов клеток из островков9,10,11,12, но не дотягивает до чистоты целевой клетки Населения. Для преодоления этих ограничений для выбора конкретных популяций эндокринных клеток, таких как q- и q-клетки13,14,15,16 , 17 Лет , 18. Кроме того, Dorrell et al. использовали сортированный подход на основе антител, основанный на FACS, чтобы классифицировать к-клетки на четыре субпопуляции19. Сортированные FACS аортированные абонеминированные клетки также могут быть покрыты для секвенирования РНК одиночных ячеек; однако, методы на основе пластин сталкиваются с проблемами в масштабируемости20,21,22.
Для получения высококачественных крупномасштабных транскриптомных данных каждого типа эндокринных клеток мы применили микрофлюидную технологию к островным клеткам человека. Микрофлюидная платформа генерирует транскриптомные данные из большого количества одиночных ячеек в высокой пропускной, высококачественной и масштабируемой манере23,24,25,26,27. В дополнение к выявлению молекулярных характеристик типа клеток, захваченных в большом количестве, высокомасштабируемая микрофлюидная платформа позволяет идентифицировать редкие типы клеток, когда обеспечивается достаточное количество клеток. Таким образом, применение платформы для человека островки поджелудочной железы позволило профилирования грелина-секретирования- клеток, редкий тип эндокринной клетки с малоизвестной функции из-за его дефицита28. В последние годы, несколько исследований были опубликованы нами и другими отчетности крупномасштабных транскриптомных данных человеческих островков с использованием технологии29,30,31,32, 33. Эти данные являются общедоступными и полезными ресурсами для островного сообщества для изучения неоднородности эндокринной клетки и ее последствий при заболеваниях.
Здесь мы описываем микрофлюидный протокол секвенирования РНК на основе капель, который использовался для получения транскриптомных данных примерно 20 000 островковых клеток человека, включая q-, -, q-, PP, q-cells и меньшую долю неэндокринных клеток 32. Рабочий процесс начинается с изолированных островков человека и изображает шаги диссоциации островковых клеток, одноклеточного захвата и анализа данных. Протокол требует использования свежеизолированных островков и может применяться к островкам от человека и других видов, таких как грызуны. Используя этот рабочий процесс, можно построить беспристрастный и всеобъемлющий атлас клеток на иактов в соответствии с базовыми и другими условиями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Диссоциация человеческого наидолетов
- Получение человеческих островков, изолированных от доноров органов трупа обоих полов, в возрасте от 15-80 лет, без уже существующих заболеваний, если островки от доноров с конкретной демографии не требуется для этой цели исследования.
- После изоляции, изолированные островки хранятся в ткани культуры объекта в течение 2-3 дней на поставщика. Это часто занимает более 1 дня для повреждения на абонете, чтобы стать видимым.
- Поместите островки в бутылку и погрузите его полностью в островной среде. Отнеси его в лабораторию на ночную отгрузку.
- Получить эквивалентный объем островка (ИЭЗ) отгруженных островков от поставщика островка.
- Восстановление островков от отгрузки в день прибытия островка. Выполните этот шаг с помощью капюшона, чтобы свести к минимуму вероятность загрязнения.
- Охладите полный абоцины (CMRL-1066, 10% (v/v) FBS, 1x Pen-Strep, 2 mM глутамин) в холодильнике.
- Перенесите островки из бутылки в коническую трубку 50 мл.
- Добавьте 10 мл предварительно охлажденных полных островковых носителей в опорожненный флакон, чтобы промыть оставшиеся островки. Перенесите носители в коническую трубку.
- Центрифуга трубки на 200 х г в течение 2 минут для восстановления островков. Аспирируйте супернатант оставляя около 1-2 мл носителей с гранулами.
- Отчетыте островки с предварительно охлажденных полных островковых носителей. На основе ИЭЗ, предоставленных поставщиком, добавьте 12 мЛ носителей на 5000 МЭз.
- Налейте островки в средствах массовой информации на 10 см необработанных ткани культуры блюдо. Инкубировать на ночь в инкубаторе культуры тканей при температуре 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 в атмосферном воздухе.
- Диссоциативные островки, как показано ниже. Выполните этот шаг после ночной инкубации.
- Предварительно разогревая полный простой аклетсми и решение диссоциации ячейки.
- Подготовка 1x PBS, содержащий 0,04% BSA при комнатной температуре.
- Подсчитайте и вручную выберите 200-300 островков с помощью пипетки P200 и перенесите островки в коническую трубку 15 мл, содержащую 5 мл предварительно прогретых полных островных носителей.
- Соберите островки центрифугированием при 200 х г в течение 2 мин. Аккуратно аспирировать супернатант, не нарушая гранулы на дне.
- Добавьте 1,0 мл предварительно разогретого клеточного раствора и нарушить гранулы, мягко прокладывая вверх и вниз. Инкубировать островки при 37 градусах по Цельсию в течение 9-11 мин. Каждые 3 мин пипетка вверх и вниз медленно в течение 10 с, чтобы разъединить клетки в одиночные клетки.
- После того, как клетки на клетчатке хорошо разобщены и раствор станет облачным, добавьте 9 мл полного развязки и процедите через 30 мкм-образный ситечко в новую коническую трубку 15 мл.
- Вымойте трубку и клеточный ситечко с 2 мл полного островковых носителей для сбора оставшихся островков и добавить в ту же трубку.
- Собирайте клетки центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин.
- Аккуратно аспирируйте носители и повторно приостанавливайте действие клеточной гранулы в 5 мл 1x PBS, содержащий 0,04% BSA (PBS-BSA).
- Фильтр через новый 30 мкм ячейки ситечко в 15 мл конической трубки и центрифуги на 400 х г в течение 5 минут для сбора клеток.
- Призадыхать супернатант и повторно гостеклетки в 200-300 Л 1x PBS-BSA раствор.
- Измерьте концентрацию клеток и регулировка объема до конечной концентрации 400-500 клеток/Л.
2. Одноэлементный контроль качества подвески
- Определите концентрацию клеток с помощью автоматизированного счетчика клеток на основе флуоресценции34.
- Смешайте 10 клеток Л с 0,5 л АО/ДаПИ. Пипетка тщательно перемешать. Загрузите 10,5 л на слайд и запустите пересчет клеток, чтобы определить количество и жизнеспособность.
- Разбавить и/или фильтровать суспензию ячейки по мере необходимости на основе количества клеток.
3. Одноклеточная перегородка с помощью микрофлюидного чипа. Следуйте протоколу от производителя микрофлюидных чипов35.
- Доведите 3' гелевые бусы и реагенты обратной транскрипции (RT) до комнатной температуры (30 мин). При необходимости восстановите грунтОВку RT в буфере TE.
- Подготовка RT мастер смеси в низкой трубки связывания, как указано в таблице 1.
- Определите количество ввода клеток для каждого образца. Рассчитайте объем суспензии ячейки (X), необходимый для доставки нужного целевого номера ячейки. Расчетный объем безнужной воды для добавления к каждому образцу составит 33,8-Х Л.
- Для того, чтобы каждый образец был разделен, добавьте 33,8-X безнущечную воду в 0,2 мл ПЦР прокладки трубки. Затем добавьте 66,2 л мастер-микски к каждой полоске трубки. Не добавляйте клетки в полоску трубки в этой точке. Пипетка аккуратно перемешать. Поместите подготовленные полоски на лед.
- Поместите микрофлюидный чип в корпус чипа. Ориентируйте корпус чипа, гарантируя, что нефтяные скважины (строка с пометкой 3) ближе всего к лицу, выполняющему эксперимент.
- При запуске менее 8 образцов, используйте 50% глицерола для заполнения неиспользованных каналов в следующем порядке:
- Добавьте 90 л из 50% глицерола в скважины в строке 1 для всех неиспользованных каналов.
- Добавьте 40 qL 50% глицерола в колодцы в строке 2 для всех неиспользованных каналов.
- Добавьте 270 л 50% глицерола в скважины в ряду 3 для всех неиспользованных каналов.
- Прикрепите гель-бусы в вихрь. Вихрь на полной скорости в течение 30 с. Нажмите на полосу на скамейке сверху несколько раз, чтобы собрать бисер. Подтвердите, что пузырьков нет.
- Добавьте X Зл клеток в подготовленные полосы труб. Пипетку смешать 5 раз. Не отбрасывая пипетки советы, передача 90 Зл клеточной смеси в строку 1 чипа.
- Подождите 30 с, затем загрузите 40 qL гелевого шарика, чтобы грести 2. Пипетка очень медленно для этого шага. Распределить 270 л раздела нефти к скважинам строки 3.
- Крюк чип прокладки на вкладки держателя чипа. Поместите собранный держатель чипа в одноклеточное устройство и нажмите кнопку выполнения.
- Немедленно удалите собранный держатель чипа после завершения.
- Снимите прокладку с чипа с держателя, откройте корпус чипа под углом 45 градусов и удалите 100 л эмульсии из чипа в синюю пластиковую пластину 96-ну колодцу.
4. Одноклеточное усиление кДНК. Следуйте протоколу от производителя микрофлюидных чипов35.
- Обратная транскрипция.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг под чистым пЦР только капот для предотвращения микробов и других загрязнений неусиленной кДНК.- Запечатайте 96-хорошую синюю тарелку с уплотнением фольги на нагретой плите герметика.
- Запустите обратную реакцию транскрипции в тепловом циклическом цикле следующим образом: 53 кв. м в течение 45 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это безопасная остановка. Образцы могут вместить при 4 градусах по Цельсию до 72 ч.
- Очистка RT
- Принесите нуклеиновой кислоты связывания магнитных бусин и нуклеиновой кислоты размер выбора магнитных бусин комнатной температуры и вихря, чтобы вновь приостановить. В этот момент оттапьте буфер очистки образца в течение 10 минут при 65 градусах Цельсия. Доведите все остальные реагенты до комнатной температуры и вихря.
- Подготовьте буферы, как показано в таблицах 2 и таблицах 3.
- Химически разорвать эмульсию и очистить.
- Для этого аккуратно снимите уплотнение фольги с тарелки.
- Распределите 125 л розового эмульсионного реагента в каждую эмульсию. Подождите 1 минуту, затем перенесите весь объем на чистую полоску 0,2 мл. Убедитесь, что есть слой ясно и слой розового в полоске трубки.
- Удалите 125 л розового слоя со дна полоски, не нарушая ясный слой. Это нормально для небольшого объема (15 евро) розового слоя, чтобы остаться в трубке.
- Добавьте 200 кл.л. очистки смесь из таблицы 2 в полоску трубки и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут.
- Перенесите прокладку на магнитную подставку и дайте раствору очиститься. Удалить супернатант и выбросить, затем вымыть бисер с 80% этанола в два раза. Дайте бисеру высохнуть в течение 1 мин.
- Снимите полоску из магнита и добавьте 35,5 л раствора из таблицы 3 в бисер. Пипетка, чтобы повторно приостановить шарики в растворе. Инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Перенесите прокладку на магнитную подставку и дайте раствору очиститься. Удалите очищенную кДНК из полоски трубки и раздать его для очистки 0,2 мл полосы труб.
- Усиль кДНК.
- Подготовка усиления мастер смесь в таблице 4, ниже.
- Добавьте 65 зЛ мастер-миксу ккднк-усилению. Поместите полоску трубки в термальный циклик и запустить следующую программу: 98 КК 3 мин 15 циклов из 98 C 15 с 67 C 20 с 72 C 1 мин»
ПРИМЕЧАНИЕ: Это безопасная остановка. Образцы могут вместить при 4 градусах по Цельсию до 72 ч. - Очистите усиленную кДНК с 0.6x нуклеиновой кислоты размер размера магнитных бусин. Вымойте дважды с 80% этанола и elute с 40,5 л.
- Выполнить контроль качества cDNA с помощью автоматизированного геля электрофореза и флуоресценции на основе анализа ДНК-квантита36,37.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это безопасная остановка. Образцы могут держать сятвые на 4 C для up to 72 h или на -20'C неопределенно.
5. Секвенирование библиотечного строительства
- Тегментация и очистка кДНК38.
- Нормализовать cDNA до 50 нг в 20 л от общего объема. Точная количественная оценка имеет решающее значение на этом этапе.
- Сделайте смесь тегмента в таблице 5 и aliquot 30 qL к каждому образцу кДНК qDNA на льду. Поместите образцы в тепловой циклик и запустите протокол тегментации: 55 градусов по Цельсию 5 мин и 10 градусов по Цельсию.
- Выполните очистку tagmented cDNA с помощью столбцов38. Добавьте 180 буфер связывания ДНК в каждом образце. Передача 230 Зл в колонку спина.
- Центрифуга при 1300 х г в течение 2 мин и отбросить поток через.
- Вымойте дважды с 300 мл БУФЕРа для мытья ДНК. Центрифуге дополнительные 2 мин на 1300 х г для обеспечения удаления этанола.
- Elute очищенный тегом cDNA, добавив 31 злицита буфера в колонку и инкубировать при комнатной температуре в течение 2 мин.
- Центрифуга в течение 2 мин при 1300 х г для восстановления очищенного продукта.
- Пример индекса ПЦР.
- Выберите штрих-коды, которые не перекрываются во время мультиплексного секвенирования.
- Сделайте мастер-микс индекса ПЦР образца, как показано в таблице6.
- Добавьте 60 зл и тысячу образцов индекса ПЦР мастер-микс к 30 злителю очищенного образца.
- Добавьте в каждый образец 10 qL из 20 мкм, 4-олиго образец индекса (используемый индекс записи). Общий объем реакции в настоящее время составляет 100 л.
- Поместите в тепловой циклатор с крышкой, установленной до 105 градусов по Цельсию. Выполнить следующую программу: 98 C 45 s s 12-14 циклов в размере 98 c 20 s 54 C 30 s s 72 C 20 s» 72 C 1 мин 4 c hold.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это безопасная остановка. Образцы могут вместить при 4 градусах по Цельсию до 72 ч.
- Очистите библиотеки с двойной бис очистки.
- Добавьте 100 л из магнитных бусин окрады размером нуклеиновой кислоты и тщательно перемешайте с пипеткой. Инкубировать при комнатной температуре 5 мин.
- Перенесите к магниту и дайте ему постоять до тех пор, пока раствор не расчистит. Удалите и отбросьте супернатант.
- Вымойте дважды с 200 зл 80% этанола.
- Высушите бусинки на магните в течение 2 мин. Снимите с магнита и добавьте 50,5 л EB Buffer к шариковой грануле. Пипетка повторно приостановить бисер в буфере.
- Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 мин. Перенесите к магниту и дайте постоять 2 мин. Перенесите 50 л электора в чистую полоску трубки.
- Добавьте в образец 40 зл. размернулизуя ядочной кислоты магнитными бусинами и инкубизируете при комнатной температуре в течение 5 мин. Перенесите в магнит и дайте раствору очиститься. Удалите и отбросьте супернатант.
- Вымойте дважды с 125 зл 80% этанола.
- Высушите бусинки на магните в течение 2 мин. Снимите с магнита и добавьте 60,5 л EB Buffer к шариковой грануле. Пипетка повторно приостановить бисер в буфере.
- Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 мин. Перенесите к магниту и дайте ему постоять 2 мин. Перенесите 50 л электора в чистую полоску трубки. Это последняя библиотека.
- Держите образцы при 4 градусах по Цельсию до 72 ч или при -20 градусов по Цельсию на неопределенный срок. Обратите внимание, что это безопасная остановка.
- Количественно и запустить контроль качества окончательных библиотек с помощью автоматизированного геля электрофорусии и флуоресценции на основе анализа ДНК-квантита36,37. Разбавить образцы 1:10 до выполнения контроля качества.
6. Секвенирование библиотеки
- Нормализуйте каждый образец, который будет секвенирован до 2 нг/КЛ и объединяют 3 КЛ каждого нормализованного образца вместе.
- Измерьте концентрацию пула с помощью анализа количественных показателей ДНК на основе флуоресценции37.
- Разбавить бассейн до 0,25 нг/Л.
- Денатурная бассейн следующим образом: 12 л разбавленного объединенного образца (0,25 нг/Л) - 1 л днк-контроля (1 нМ), 2 Л EB Buffer 5 Л НаОХ (0,4Н). Пусть это инкубировать в течение 5 мин, а затем добавить 10 зл и л 200 мм Tris pH 8.0.
- Загрузка 4,05 л в 1345,95 л HT1. Загрузите 1,3 мл в картридж секвенсора и запустите в соответствии с руководящими принципами производителя39, используя рецепт секвенирования с 26 циклами (Читать 1) 8 циклов (i7 Index) - 0 циклов (i5 Index) и 55 циклов (читать 2).
7. Чтение выравнивания (Дополнительный файл 1)
- Запустите Cell Ranger (v2.0.0) в demultiplex необработанные базовые файлы (BCL), генерируемые путем секвенирования в файлы FAST. Выравнивание файлов FAST с человеческой сборкой B37.3 Генома B37.3 и моделью гена UCSC для получения количественной оценки экспрессии.
- Контроль качества выравнивания.
- Создайте показатели выравнивания и проверьте базы no30, действительную фракцию штрих-кода, ячейку, связанную с чтением фракцию, отображенные фракции чтения и считывания, обнаруженные в каждой ячейке.
- Изучите график ранга штрих-кода, чтобы убедиться в разделении связанных с ячейкой штрих-кодов и фона.
8. Анализ данных (Дополнительный файл 2)
- Контроль качества ячейки и предварительный процесс.
- Исключить клетки с злт; 500 обнаруженных генов, злт; 3000 общее количество уникального молекулярного идентификатора (UMI), Отрегулируйте отсечения в зависимости от типов тканей и клеток.
- Удалите дублеты.
- Оцените пять генов эндокринного гормона (глюкагон - GCG,инсулин - INS,соматостатин - SST,полипептид поджелудочной железы - PPY,и грелин - GHRL) для бимодального экспрессионного шаблона (режим высокой и низкой экспрессии) с использованием R пакет mclust40.
- Удалить клетки, которые выражают более одного гена гормона, т.е. с двумя или более генами гормонов в режиме высокой экспрессии.
- Нормализовать экспрессию генов на общий UMI и умножить на коэффициент масштаба 10000 на клеточном уровне с помощью R пакет Seurat41.
- Удалить гены, обнаруженные в менее чем 3 клетках.
- Обнаружить переменные гены, используя среднее выражение и дисперсию всех клеток. Отрегулируйте отсечения в зависимости от типа ткани и клеток.
- Выполните анализ основных компонентов с переменными генами. Кластерные ячейки с выбранным числом основных компонентов. Вывод клеток кластера обогащенных генов, сравнивая один кластер клеток с остальными клетками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Одноклеточный процесс секвенирования РНК состоит из трех этапов: диссоциирование нетронутых островков человека на одноклеточную подвеску, захват одиночных ячеек с помощью технологии на основе капель и анализ данных РНК-сек(рисунок 1). Во-первых, приобретенные островки человека были инкубированы в одночасье. Нетронутые островки были исследованы под микроскопом(рисунок 2A). Целостность разрозненных клеток острова была подтверждена с помощью РНК флуоресценции в гибридизации ситу (RNA-FISH). Как показано на рисунке 2B,разъединенные q- и q-клетки были визуализированы с помощью зондов GCG и INS mRNA, соответственно.
Количество ячеек и жизнеспособность должны быть определены до шага захвата одноклеточных клеток. Клетки с низкой жизнеспособностью или высоким содержанием мусора не подходят для дальнейшей обработки. Хорошая концентрация клеток обычно колеблется от 400 до 500 ячеек/КЛ. Приблизительно 6000 клеток были загружены на микрофлюидный чип в одноклеточной частиционной ступени, и 100 л гелеобразующих шариков в эмульсии были удалены из чипа. Рисунок 3A является примером успешного примера эмульсии после шага раздела. В каждой пипетке однородная бледная облачность с минимальным раздельным маслом, отделенным от гелевого шарика. На рисунке 3B, напротив, показана некачественная эмульсия с четким фазовым разделением между гелевыми шариками и маслом. Это может быть связано с засорение во время запуска чипа.
После одноклеточного раздела была проведена усиление кДНК. На рисунке 4A иллюстрируется репрезентативное распределение размера фрагмента после усиления кДНК. Типичный пик для хорошего качества образца кДНА проживал около 1000-2000 bp. Интересно, что всплеск около 600 bp был специфичен для кДНК на конкретном уровне. Распределение размера фрагментов для библиотек РНК-сек было между 300 и 500 bp(рисунок 4B).
После секвенирования мы использовали набор метрик считывания выравнивания для оценки качества данных с одноклеточными РНК-сек(таблица 7). Первые три метрики хорошо обобщены одноклеточным качеством библиотеки. В среднем, 92% считываний были получены из нетронутых клеток и 72% считываний были отображены в экзоны. Из всех экзонов, захваченных в каплях, 90% из них были произведены нетронутыми клетками, а остальные, вероятно, были эмбиентрны в клетках свободных капель. Эти показатели выравнивания предполагают хорошее качество данных. Соотношение между экзоном и UMI было эмпирическим измерением для оценки последовательности насыщения и, как правило, соотношение 10:1 было хорошим показателем. Кроме того, количество обнаруженных генов (UMI) было полезной особенностью для характеристики различных типов клеток. Для клеток человека, выявляемых генов, составляет около 1900 в каждой клетке.
Мы секвенировали в общей сложности 20 811 клеток-аклетов от 12 недиабетических доноров. Выражение более чем одного гормона было обнаружено примерно в 6% клеток. Эти мульти-гормональные клетки, скорее всего, дублеты, потому что наша предыдущая работа показала, что меньше, чем lt; 0,1% от одного газолетовых клеток совместно выразили более одного эндокринного гормона33. Мы удалили все выявленные мультигормональные клетки. Важно также исключить низкокачественные клетки на основе общего UMI, обнаруженных генов и жизнеспособности клеток33. После этих мер по контролю качества 19 174 остались для дальнейшего анализа. Анализ кластеризации выявил 12 типов клеток: з-, З-, З-, PP, q-cells, acinar, проток, тихая стеллат, активированный stellate, эндотелиальный, макрофаг, и тучные клетки (Рисунок 5). Как и ожидалось, эндокринные клетки были большинство(Таблица 8). Верхние обогащенные гены в клетках (т.е. GCG, TTR, CRYBA2, TM4SF4, TMEM176B) и к-клеткам (т.е., IAPP, INS, HADH, DLK1, RBP4) согласуются с другими исследования13,15,16,17,18,20,21,22,29 ,30,31,33. Интересно, что и к-, и к-клетки состояли из нескольких субпопуляций. Три субпопуляции, бета-суб1, 2 и 3, были схожи с небольшим числом субпопуляционных генов (18 в бета-суб1, 33 в бета-под-2 и 18 в бета-под-3). Четвертая субпопуляция имела 488 обогащенных генов. Небольшая субпопуляция (Альфа sub3) состояла из размножающихся клеток, характеризующихся обогащенным выражением MKI67, CDK1и TOP2A.
Рисунок 1: Схематическая диаграмма одноклеточного рабочего процесса секвенирования РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативные изображения нетронутых и разъединенных человеческих островков. (A) Изображение островков, принятых после ночной инкубации. (B) Диссоциированные разрозненные клеток-изолечивания, визуализированные РНК-FISH окрашивание для INS (белый) и GCG (красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Изучение качества одноклеточной эмульсии до обратной транскрипции. (A) Одноклеточная эмульсия хорошего качества. В каждой трубе была однороднооблачной жидкость. (B) Одноклеточная эмульсия низкого качества. В наконечнике пипетки жидкость не была однородной и показала разделение между маслом и гелевыми шариками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Изучение качества одноклеточной кДНК и библиотеки. (A) Представитель кДНК следы. Эта кДНК была хорошего качества и урожайности, с основным пиком для образца происходит около 1000-2000 bp. Пик в след около 600 bp был типичным и отличительным кДНК на кДНК. (B) Представитель окончательного последовательности библиотеки след. Эта библиотека была хорошего качества и урожайности, с основным пиком, происходящим между 300-500 bp. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Типы клеток и субпопуляции, выявленные в одноклеточной РНК секвенирования человеческих островков поджелудочной железы. Клетки были сгруппированы по отличительным типам клеток в пространстве т-распределенных стохастических размеров соседа встраивания (tSNE). Анализ также выявил три субпопуляции в клетках и четыре в клетках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Имя реагента | Vol. для использования (КЛ) в реакции |
| RT Реагент Mix | 50 лет |
| RT Праймер | 3,8 |
| Добавка A | 2.4 |
| RT Фермент микс | 10 Лет |
| Общая | 66,2 |
Таблица 1: Обратная смесь стенограммы.
| Имя реагента | Объем для использования (uL) за реакцию |
| Безнущее вода | 9 До 9 |
| Образец буфера Очистка 1 | 182 год |
| Динабиады MyOne Silane | 4 |
| Добавка A | 5 |
| Общая | 200 г. |
Таблица 2: Очистка смеси.
| Имя реагента | Объем для использования (uL) за реакцию |
| Буфер EB | 98 лет |
| 10% Твина 20 | 1 |
| Добавка A | 1 |
| Общая | 100 |
Таблица 3: Решение elution.
| Имя реагента | Объем для использования (uL) за реакцию |
| Безнущее вода | 8 |
| Усиление Мастер Mix | 50 лет |
| кДНК Добавка | 5 |
| cDNA Праймер Микс | 2 |
| Общая | 65 |
Таблица 4: смесь усиления кДНК.
| Имя реагента | Объем для использования (Зл) на одну реакцию |
| Фермент тегментации | 5 |
| Тегментация буфера | 25 |
| Общая | 30 год |
Таблица 5: Тегментация смесь.
| Имя реагента | Объем для использования (Зл) на одну реакцию |
| Безнущее вода | 8 |
| Усиление Мастер Mix | 50 лет |
| SI-PCR Праймер | 2 |
| Общая | 60 лет |
Таблица 6: Пример индекса PCR мастер-микс.
| Идентификатор образца | % читает с действительными штрих-кодами ячейки | % Exon читает в захваченных ячеек среди общего числа клеток | % Exon читает среди всего читает | Средний Exon читает на ячейку | Медианный UMI на ячейку | Медианные гены на клетку |
| Образец-1 | 92% | 93% | 76% | 142 015 | 10 310 | 1 747 |
| Образец-2 | 92% | 91% | 74% | 151 395 | 11 350 | 1 754 |
| Образец-3 | 94% | 92% | 75% | 120 538 | 19 604 | 2180 |
| Образец-4 | 95% | 93% | 67% | 160 657 | 11 870 | 2111 |
| Образец-5 | 94% | 92% | 62% | 177 809 | 13 821 | 2 288 |
| Образец-6 | 95% | 89% | 67% | 138 208 | 8 235 | 1 296 |
| Образец-7 | 94% | 89% | 72% | 147 484 | 13 606 | 2 272 |
| Образец-8 | 94% | 91% | 69% | 159 793 | 9 505 | 1 865 |
| Образец-9 | 95% | 92% | 72% | 168 436 | 12 794 | 2 389 |
| Образец-10 | 83% | 83% | 74% | 88 067 | 13 323 | 1 805 |
| Образец-11 | 82% | 88% | 77% | 67 752 | 9 295 | 1 278 |
| Образец-12 | 91% | 85% | 74% | 194 781 | 14 877 | 1 746 |
Таблица 7: Прочитайте метрики выравнивания.
| Тип ячейки | Количество ячеек | Ave. клетки на одного донора (стандартное отклонение) |
| Альфа | 6546 г. | 546 (258) |
| Бета-версия | 7361 год | 613 (252) |
| Дельта | 922 г. | 77 (37) |
| Pp | 545 г. | 45 (25) |
| Эпсилон | 11 Год | 1 (1) |
| Асинар | 836 | 70 (71) |
| Дуктал | 1313 год | 109 (95) |
| Квисентс стеллат | 225 год | 19 (14) |
| Активированный стеллат | 890 | 74 (58) |
| Эндотелиальных | 408 г. | 34 (21) |
| Макрофаг | 80 | 7 (6) |
| Шванн | 37 | 3 (3) |
Таблица 8: Композиция типа ячейки. Общее количество клеток для каждого типа клеток и средние клетки для каждого донора в каждом типе клеток.
Дополнительный файл 1: Команды, используемые для выравнивания последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2: R-скрипты для выполнения контроля качества клеток, кластеризации клеток и идентификации обогащенных генов клеточного типа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одноклеточные технологии, разработанные в последние годы, обеспечивают новую платформу для характеристики типов клеток и изучения молекулярной неоднородности островков поджелудочной железы человека. Мы приняли протокол микрофлюидной одноклеточной изоляции и анализа данных для изучения островков человека. Наш протокол успешно подготовил данные по секвенированию РНК из более чем 20 000 отдельных клеток человека с относительно небольшими вариациями качества последовательности и пакетных эффектов.
В частности, два шага имеют решающее значение в этом протоколе для получения высококачественных результатов. Необходимо проявлять осторожность при разъединении человеческих островков. Важно не переваривать островки. Одноклеточная перегородка является еще одним ключевым шагом для успешного одноклеточного эксперимента. Мы продемонстрировали примеры хороших и некачественных эмульсий на рисунке 3. Явная эмульсия обычно свидетельствует о недостаточном количестве клеток, собираемых в шаге раздела.
Доступ к изолированным первичным островкам человека является меропредельным шагом для создания крупномасштабных одноклеточных транскриптомов островка человека. Изолированные островки от отдельных доноров трупов обычно обрабатываются в разное время, поэтому потенциальные побочные эффекты партии должны быть тщательно изучены в ходе анализа данных. Интегративный анализ может быть использован для определения общих типов клеток и субпопуляций между отдельными партиями41. Эффект пакетов также может быть скорректирован с помощью пакетно-исправленной количественной оценки выражения42. Еще одна задача анализа одноклеточных данных РНК-сек является выявление дублетов. В данных предварительной обработки, мы приняли меры по удалению эндокринных дублетов путем выявления клеток, выражающих несколько генов гормонов(GCG, INS, SST, PPY, и GHRL). Идентификация дублетов, образованных двумя различными типами клеток, является относительно легкой задачей из-за чрезвычайно высокого выражения эндокринных гормонов. Реальная задача состоит в том, чтобы определить в пределах-клеточного типа дублетов, например, дублетов на две клетки. Поскольку более высокий UMI и большее количество обнаруженных генов наводит на мысль о потенциальных дублетах, одним из решений является удаление выбросов с большим количеством генов и UMI во время этапа контора. Кроме того, инструменты для обнаружения дублетов доступны43,44,45.
Основным ограничением одноклеточного секвенирования РНК является низкая чувствительность. Используя спик-в внешнего РНК-контроля РНК(ERCC) РНК, мы подсчитали, что только 10% всех выраженных генов были обнаружены с помощью текущего протокола и что обнаруженные были предвзяты к высоким содержанием генов46. Эндокринные клетки поджелудочной железы выражают чрезвычайно высокий уровень генов гормонов (т.е. GCG, INS, SSTи PPY). В результате мРНК этих генов могут стать эмбиентной РНК. Таких фоновых шумов полностью избежать нельзя. Однако этот пошаговой протокол поможет исследователям свести к минимуму нежелательные экспериментальные шумы. Текущий протокол предназначен для свежеизолированных тканей. Другие технологии, такие как одноядерное секвенирование РНК47,48,доступны для РНК-сек свежих, замороженных или слегка фиксированных тканей. Кроме того, недавно разработанная технология хэширования клеток49 может рассматриваться как передовой микрофлюидный одноклеточный протокол, позволяющий мультиплексировать образец.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы являются сотрудниками и акционерами Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Acknowledgments
Ни один
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
References
- Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
- Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552 (2012).
- Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
- Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
- Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
- Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
- Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
- van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694 (2015).
- Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499 (2010).
- Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
- Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
- Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
- Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
- Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
- Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
- Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
- Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
- Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
- Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
- Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
- Chemometec. Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
- 10X Genomics. 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , 10X Genomics. (2017).
- Agilent Technologies. Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , Agilent Technologies. (2013).
- Thermo Fischer Scientific. Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , Thermo Fischer Scientific. (2015).
- Illumina. Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , Illumina. (2016).
- Illumina. llumina NextSeq 500 System Guide. , Illumina. (2018).
- Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
- DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
- McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
- Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
