我们描述了一种从人类膀胱标本中制备单一新分离的分离性肌细胞的方法,采用两步酶程序。获得可行的DSM细胞可以通过各种单细胞技术进行研究,包括所述的amphotericin-B贴片-钳电生理学,以揭示生理和药理特性。
膀胱壁内的缓除肌平滑肌(DSM)细胞最终促进尿液储存和排空。制备可行、新鲜和分离的DSM细胞是一项重要的技术挑战,其成果为后续的功能和分子研究提供了最佳细胞。本文开发和阐述的方法,由我们小组成功使用十多年,描述了从开放膀胱手术中获得的人类膀胱标本的解剖,然后对DSM片件进行酶式两步处理和机械三聚获得新鲜分离的DSM细胞。第一步是解剖,将DSM层(也称为肌肉体)从粘管(尿毒症、拉米纳皮面和肌肉粘管)和相邻的连接、血管和脂肪组织中分离出来。然后,DSM 在标称 Ca2+包含解剖/消化溶液 (DS) 中切成片(2-3 mm x 4-6 mm)。下一步是在+37°C下,用含有木瓜蛋白和胶原酶的DS单独转移到并依次处理,每步30-45分钟。在用含有无酶牛血清的DS进行乳液和用火抛光移液器进行三聚体处理后,这些碎片释放出单个DSM细胞。新鲜分离的 DSM 细胞非常适合对电通道进行贴片夹电生理和药理表征。具体来说,我们表明TRPM4通道阻滞剂9-phenanthrol减少了电压步进引起的阳离子电流记录与安培林-B穿孔贴片夹方法。DSM 细胞也可以通过其他技术进行研究,如单细胞RT-PCR、微阵列分析、免疫细胞化学、原位接近结扎测定和Ca2+成像。利用单个 DSM 细胞的主要优点是所观察到的与显示的单细胞特性直接相关。对新鲜分离的人类DSM细胞的研究提供了重要的见解,揭示了各种离子通道(包括膀胱中的可渗透的阳离子)的特性,并将继续作为阐明DSM细胞特性和监管机制的黄金标准。
去向肌平滑肌(DSM)细胞构成膀胱中最丰富的细胞类型,最终分别通过放松和收缩控制尿液储存和排空。DSM细胞形成平滑的肌肉束,与相邻的结缔组织、神经过程、间质细胞和其他细胞类型1交织在一起。目前对DSM细胞在膀胱功能中的作用的理解是通过多层次的集成方法实现的。每种实验方法——无论是基于体外分离的单细胞、体外/体外平滑肌肉束的组织条,还是体内测定(如细胞学和排空功能评估)——都为DSM的生理和药理特性提供了重要而具体的见解(详情请参阅评论1、2、3、4、5、6)。然而,对从分离的单细胞获得的结果的解释允许将结论具体归因于单个细胞类型本身。这一认识是建立可靠和可重复的方法,从整个厚度膀胱标本获得新鲜分离的DSM细胞的驱动力。与许多其他细胞类型不同,平滑肌细胞由于失去其原生表型(包括其电生理和收缩特性的特异性变化)而无法可靠地培养。这一事实进一步强化了对生理活性新分离的DSM细胞进行研究的重要性。
在20世纪80年代末和90年代初,伊森伯格的研究小组(德国)发表了一系列电生理学研究,研究从豚鼠膀胱9、10、11、12、13(表1)中新分离的DSM细胞。该方法强调了两个重要观察结果,这两个观察方法有助于获得重要的细胞,并作为其他人应遵循的初始指南。在酶治疗之前,用Ca2+无溶液/介质预处理分离的DSM片件,2)使用含有胶原酶的溶液进行组织消化。这两个关键步骤已纳入DSM细胞分离程序的所有后续变体中(表1)。目前,我们集团采用两步顺序木瓜蛋白-胶原酶解离方法。DSM 片首先使用含有木瓜的酶溶液进行处理,然后用胶原酶 II 型在同一溶液中溶解(DS、解剖/消化溶液)。这种方法产生来自各种物种的单一DSM细胞,包括豚鼠、猪、大鼠、小鼠,以及重要的人类(表1)。
单DSM细胞为多种分子生物学和生理实验提供了来源。到目前为止,用免疫细胞化学研究了蛋白质和mRNA表达, 或RT-PCR/qRT-PCR测定揭示了各种电通道的高检测水平,包括大电导电压和Ca2+-激活(BK)、小电导Ca2+-激活K+类型3(SK3)、电压门K+(K v)、L型电压门控Ca2+(Ca v)和瞬态受体电位麦莱他素4型(TRPM4)通道14,15,16,17,18,19,20,21,22 。它们都被认为控制DSM兴奋性、细胞内Ca2+水平和收缩性。修补钳电生理方法,直接在豚鼠、小鼠、大鼠或人类DSM细胞上执行,直接演示了L型Cav、K v(Kv2.x.Kv7)、SK、BK和TRPM4通道17、19、20、21、22、23、24、25的生物物理和药理特性,26,27,28,29,30,31。这些方法包括传统的全单元电压夹、穿孔电压夹和单通道记录(单元连接、内向和外出配置)。此外,使用电流钳对DSM进行膜电位记录提供了证据,证明靶向作用药理剂会改变细胞的兴奋性。例如,从人类、豚鼠和大鼠膀胱19、20、22、31获得的DSM细胞中的TRPM4抑制剂9-phenanthrol诱导超极化。在各种电生理方法中,五聚他林-B(和尼他汀、克霉素和β-escin)穿孔贴片夹记录通过保留细胞内固有的信号分子和通路提供了关键优势。只有低分子量阳离子和在较小程度上,Cl- – 但不是蛋白质或信号分子,包括Ca2+-渗透通过血浆膜孔形成五氯霉素-B或尼他汀32。穿孔贴片夹实验的成功结果取决于此技术特有的几个一般变量。在这里,我们描述了我们小组在15年、22年、33年、34年、35年、36年、37年、38年、39年成功使用amphotericin-B的程序的细节。
可以说,非选择性阳离子通道仍然是DSM细胞中最不为人所知的通道类型之一。非选择性阳离子通道的第一个报告可追溯到 1993 年。Wellner 和 Isenberg11的论文描述了一个 33 pS 拉伸激活的单通道,显示离子渗透性的以下排名顺序:K=>Na=> >> Ba 2 = > Ca2+,以及由 Gd3+抑制通道活性,这是非选择性阳离子通道的一般抑制剂。近十年后,Thorneloe和Nelson40使用全细胞记录描述了小鼠DSM细胞中的Na+渗透阳离子电流,Gd3+抑制了。由于非选择性阳离子通道的分子特性及其生物物理特征仍有待确定,因此有必要在此研究领域开展未来的研究。本文描述的用于记录非选择性阳离子通道电流的协议- 使用含有Cs+、TEA+和nifedipine的细胞外和移液器细胞内溶液(表2),在生理和药理上缓解Kv和Cav电流——已经并将继续在非选择性阳离子通道的电生理研究中有用。我们利用这个特定的协议来确定在豚鼠、大鼠和人类DSM细胞19、20、22中TRPM4通道阻滞剂9-phenanthrol抑制全细胞阳离子电流的程度。
综上所述从人类膀胱中获取新鲜分离的单 DSM 细胞的方法提供了非常适用于电生理研究的活细胞,使用贴片夹技术、Ca2+-成像、免疫细胞化学、原位近端诉讼测定、单细胞 RT-PCR/qRT-PCR 以及包括微阵列分析、RNA-seq 和 CHIP-sq 在内的高级分子生物学技术。与其他配置不同,使用 amphotericin-B 穿孔贴片夹法可保留本机单元环境。当使用此处概述的特定条件进行时,旨在抵消 DSM 电池中 K+和 Ca2+电流的贡献时,电压步进感应电流显示适用于生物物理和药理表征的非选择性阳离子电流的特性。
此处描述的程序解释了使用酶消化和记录对TRPM4通道抑制剂9-phenanthrol敏感的全细胞阳离子电流,使用amphotericin-B穿孔贴片夹法从全厚度人类膀胱标本制备活的、新鲜分离的DSM细胞的步骤。酶过程依赖于两步顺序暴露,本文称为顺序木瓜蛋白-胶原酶消化方法。DSM组织首先在名义Ca2+无条件下使用木瓜蛋白和二硫乙醇(一种酶稳定剂)进行治疗,第二步在低Ca2+的情况下由胶原酶II型进行治疗。在平滑肌细胞的低Ca2+条件下进行木瓜消化的原理可追溯到20世纪80年代末。新鲜分离的胡萝卜动脉平滑肌细胞与木瓜显示一个拉长的形状,显示活力(抵抗对Trypan蓝色吸收)和反应收缩刺激(更高的Ca2+和组胺)65。多年后,这种方法应用于DSM细胞的制备(见表1)。胶原酶II型的选择,而不是其他类型的,与其相对较高的蛋白解细胞活性有关,非常适合平滑的肌肉组织,包括DSM。事实上,光胶原酶治疗可以产生单一的DSM细胞,尽管需要大量的酶暴露(+60分钟)53,54。由于胶原酶活性取决于Ca2+,并且酶在Ca2+无条件下处于非活性状态,因此DSM片块的最佳酶消化需要Ca2+66的存在。在我们的例子中,DS-C包含100-200[M[Ca2](表2)。酶处理后,消化的DSM片件用冷DS轻轻清洗多次,不带酶或Ca2+,以去除任何与组织结合的酶。冰冷的DS有助于保持DSM细胞的完整性,并限制任何剩余的木瓜蛋白或胶原酶的酶活性。在最后一步中,用经过火抛光的巴斯德移液器对酶处理的 DSM 片进行三聚化可释放单个 DSM 细胞。DSM 细胞要么立即放置在记录室进行贴片夹研究或其他类型的实验,要么储存在 DS 中的冰上,以便当天晚些时候使用(通常在制备后 8 小时内使用,但细胞最多可存活 24 小时)。
我们确定了成功获得单一 DSM 细胞的几个重要考虑因素。第一种涉及人类DSM标本源质量。为了最佳地保持组织的完整性,从开放膀胱手术中获得的 DSM 样本将尽快放入冰冷的 DS 中,并在寒冷的环境中保存。具体来说,从患者身上手术提取后,膀胱标本立即放在手术室准备充分准备的侧桌上。整个标本的毛检查(通常在激进或简单的囊肿切除术期间获得)及其开口。目视检查后,从严重与肿瘤无关的标本的偏远地区取出一块全厚度的尿梯试样,并立即放入装有冷(+4°C)解剖溶液(DS)的杯子(50或100 mL)中,然后用盖子紧紧闭合。由于组织采集的计划性质,手术室人员和进行收获的辅助人员在手术开始时得到提醒,以便在组织提取时在手术室内提供材料。这些预防措施以及处理步骤的常规重复性,使组织的温暖缺血时间( 从提取到放置在带有 DS 溶液的冷冻容器中 ) 保持不到 5 分钟。然后将容器放在冰箱中或放在冷却器的冰上,以保持寒冷环境,并将(冰冷)运送到实验室。一旦标本到达实验室,解剖和酶分离步骤开始。很难预测给定的DSM样本在酶解散后是否会产生高质量的DSM细胞,因此我们继续酶分离步骤。在许多情况下,在电生理学实验的同时,我们小组对从同一DSM试样制备的DSM条进行等轴测张力记录。我们发现,我们通常可以从制剂中获得高质量的DSM细胞,这些制剂也成功地为等轴测收缩研究(我们未发表的观察)提供了可行的条带。
第二个因素与不同的酶位变异有关。我们观察到,对于二型木瓜蛋白和胶原酶,每次从供应商处收到新的酶时,用于组织消化的DS中的酶活性可能会有所不同。因此,我们定期优化每个新批次的酶浓度和孵育间隔。为了尽量减少批次变异性贡献,我们订购大量相同批次,并在 2 mL 等分酶中生产大量库存溶液,并将其储存在 +-20°C,直到使用。然而,随着时间的推移,冷冻库存(储存长达2周)可能会失去其酶活性。第三个变量与酶消化处理的温度有关。木瓜蛋白和胶原酶的酶活动表现出温度依赖性。帕帕因和胶原酶II型在温度范围内表现出活性,包括正常身体生理67,68。因此,我们的目标是保持酶处理在+37°C下保持稳定,避免高温,以保持DSM细胞的完整性。第四个考虑因素涉及每个制剂中存在 DSM 细胞质量的可变性,从高度可行(表现出出色的经典平滑肌特性)到非健康、过度消化的细胞。酶潜伏间隔延长是获得大量受损细胞的主要原因之一。过度的酶处理也会损害电一通道、受体和输送机的蛋白质结构,对其功能产生不利影响。解释从酶获得的结果,新鲜分离的细胞应牢记这一点。优化酶消化条件的目的是增加高度可行的细胞的百分比。与在较少细胞(如单细胞贴片夹电生理学或 Ca2+成像)上成功进行的优化相比,依赖更多可行细胞(如微阵列分析)的实验方法需要更强健的优化。考虑到上述因素,我们在过去十年中一直在进行研究,以获得高质量的单一DSM细胞。
穿孔贴片钳技术是四分之一个多世纪以来一直研究的主要电生理方法。若干出版物详细介绍了技术注意事项69,70,71,72,73.细胞穿孔可使用安培林-B、尼他汀、克霉素或β-escin获得(参见参考32用于每个概述)。与其他电生理方法不同,穿孔贴片夹记录的主要优点是原生细胞内环境 – 包括细胞内 Ca2+和信号分子(如cAMP、PKA、磷酸盐和磷酸酯酶) – 被保存。因此,该技术非常适合在接近生理条件下研究全细胞电通道电流及其调节机制。一个关键的警告是,细胞内细胞组成不能与其他电生理方法(如传统的全细胞和单通道切除贴片(内和外)记录不同,无法精确控制。根据我们的经验,有三个因素通常有助于安培林-B穿孔贴片夹实验的成功实验结果。第一个是选择尝试录制的 DSM 单元的质量。当 DSM 细胞高度可行时,显示半收缩(蛇形样),高对比度的闪亮外观,在细胞表面周围具有定义明确的光晕,并紧密地固定在记录室的玻璃底部,然后千兆密封形成和细胞穿孔发生相对容易。成功的第二和第三个因素分别涉及安培-B的来源质量和溶解(二甲基磺酸/DMSO和细胞内移液器溶液)。我们观察到不同供应商在来源和批次差异方面存在差异。我们每天从粉末中制备一种新的五氯环生-B库存溶液溶液,随后在细胞内移液器溶液中稀释。这些步骤需要大量的声波和涡流。使用新制作的含安培林-B移液器溶液,成功进行细胞穿孔(+约2+,以及来自人类、豚鼠、小鼠和/或大鼠 DSM 细胞的非选择性阳离子电流17,21,22,23,29,30,31,35,60.在这里,我们描述了记录人类DSM细胞中非选择性阳离子电流的条件。9-Phenanthrol 是 TRPM4 通道的阻滞器,衰减电压步进感应电流支持这些通道在控制 DSM 兴奋性中的作用。作为说明,它通常需要至少45分钟后获得千兆密封和启动穿孔,以记录最佳稳定电压步进诱导的非选择性阳离子电流。电压斜带也可用作电压步进协议的替代品30,64.在这里,采用超极化保持膜电位的电压步法是首选,而不是斜坡协议,因为前一种方法将电压依赖性失活的影响降至最低,并允许在持续时间内平均振流电压步长,其中斜坡提供每个电压的单个数据点。后一点尤其适用于人类 DSM 电池,因为电流显示电压步长期间的可变活动(图 5和图 6).amphotericin-B穿孔贴片夹技术对于识别DSM细胞和其他细胞类型的特性至关重要,并将继续为将来提供新的发现提供辅助。此外,新分离的单 DSM 细胞可成功地用于测量全细胞 K+Cl–、和卡2+采用贴片夹技术的传统模式的电流、使用电流钳夹进行膜电位记录以及单通道记录,如我们以前的报告所证明的那样23,29,35,64.
除了单细胞贴片夹方法外,新分离的DSM细胞还可以与其他技术方法进行研究,包括Ca2+成像、RT-PCR/q-RT-PCR、免疫细胞化学、原位接近结扎测定和基因组方法(例如微阵列、RNA-seq、CHIP-seq)15、18、30、33、34 。随着单细胞转录组测定方法的不断发展,并变得高度敏感,我们设想在未来能够定期和具体地将单个DSM细胞的电或药理特性与其转录组/蛋白酶谱联系起来。这将通过首先从DSM细胞记录,然后提取mRNA或蛋白质,然后转录组/蛋白质组分析来实现。虽然这些方法已经在非DSM细胞中进行了测试,但它们目前在技术上具有挑战性,缺乏敏感性,不能被视为常规,并且仅限于成功检测出一些选定的基因产物74。功能-分子轮廓表达链接研究,当从从从从膀胱获得的从控制和患病的患者-捐赠者获得的DSM细胞,将提供对生理过程的见解,对驱动正常的DSM功能,发病机制,和在识别有效的新治疗方法。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了NIH-R01DK106964和P20DK123971赠款的支持。作者感谢维克多·亚罗茨基博士和莎拉·麦克斯韦尔女士对手稿的批判性评价。我们也感谢MUSC和UTHSC的泌尿科工作人员外科医生:托马斯·基恩博士、哈利·克拉克、斯蒂芬·萨维奇、罗斯·拉姆斯、桑迪普·普拉萨德、乔纳森·皮卡德、克里斯托弗·莱德贝特和安东尼·帕特森以及MUSC和UTHSC泌尿科居民:泰勒博士沃恩、塞缪尔·沃克·尼克斯、马修·杨、艾琳·伯恩斯、贾斯汀·埃莱特、瑞安·莱维、奥斯汀·扬格、马克·库林、尼玛·巴拉达兰、奥卢贝米索·麦科伊、特雷西·蒂普顿、布莱斯·怀亚特、阿莉莎·格里曼、莎拉·斯塔罗斯塔、亚伦·布洛赫、克里斯蒂娜·卡拉韦、露西尔·考克斯、克里斯蒂安·德万、艾琳·海特曼、布拉德利·休斯顿、斯蒂芬·莱格、罗伯特·利比、科尔·洛克利尔、克里斯汀·马利、莫妮卡·奥汉隆、帕特里克·普罗布斯特、辛西娅·沙拉丁、伊丽莎白·图尔维尔、丹尼尔·萨帕塔帮助收集人体组织。
5 ml polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps |
9-Phenanthrol | Sigma-Aldrich | 211281 | TRPM4 channel inhibitor |
Amphotericin-B | Fisher | BP928-250 | Used for patch/cell perforation |
Amphotericin-B | European Pharmacopoeia Reference Standards | 5 | Used for patch/cell perforation |
Amphotericin-B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | Used for patch/cell perforation |
Analog vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9006 | Intracellular pipette solution |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | DS |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | Extracellular solution and DS |
Capillary Glass | Sutter | BF150-110-7.5 | Capillary for preparation of pulled patch electrodes |
Cesium hydroxide hydrate | Sigma-Aldrich | C8518 | Intracellular pipette solution |
Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs | Axon Instruments/ Molecular Devices | pCLAMP-10 | Commerical software and part of patch-clamp rig setup |
Collagenase type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | DS-C |
CsCl | Sigma-Aldrich | 203025 | Extracellular and intracellular solutions |
Dental wax | Miltex Dental Wax Technologies, Inc. | 18058351 | |
Digital Thermometer with Probe | Fisher Scientific | 15-077-32 | Placed in tissue bath to monitor temperature |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Solvent |
DL-Dithiothreitol (DDT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Reducing agents used together with Papain |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | P-97 | Required to pull electrodes with very fine tips |
Floating foam tube rack/holder | VWR Scientific | 82017-634 | Used for holding tubes with enzymes for temperature control |
Glucose | Sigma | G8270 | |
Glutamic acid (Na salt) | Sigma-Aldrich | G1626 | DS |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | pH Buffer |
KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | Extracellular solution |
Low Noise Data Acquisition System | Axon Instruments/ Molecular Devices | Digidata 1440A | Part of patch-clamp rig setup |
Magnetic stirrer | VWR | 01-442-684 | |
MgCl2 (hexahydrate) | Sigma-Aldrich | M2670 | Extracellular and intracellular solutions |
MicroForge | Narishige | MF-830 | Used for fire-polishing electrodes |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Extracellular and intracellular solutions |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Nifedipine | Sigma-Aldrich | N7634 | L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker |
Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives | Nikon | Discontinued | Part of Patch-clamp rig setup |
Non-metalic syringe needle, MicroFil | WPI | MF-34G-5 | Filling of intracellular pipette solution |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | DS-P |
Pasteur pipette | FisherBrand | 13-678-20A | Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces |
Patch-clamp amplifier | Axon Instruments/ Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | Part of patch-clamp rig setup |
PC computer | DELL | Custom configuration | Part of patch-clamp rig setup |
pH Meter | Aspera Instruments | PH700 | |
Polyethylene tubing | Intramedic | 427-436 | Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber |
Tetraethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | T2265 | Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution |
Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870) | Thermo Scientific | Discontinued | Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup |
Tissue bath, 100 mL | Radnoti | 1583-101 | Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps |
Vinyl tubing | ColePalmer | 06405-3 | Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath |
Water circulator bath, Haake D1 L | Haake | Discontinued | Connected to tissue bath |
Weighting scale | Mettler Toledo | XS64 | |
ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives | Carl-Zeiss | Discontinued | Part of patch-clamp rig setup |