हम मानव मूत्राशय के नमूनों से एक ताजा अलग detrusor चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की तैयारी के लिए एक विधि का वर्णन एक दो कदम एंजाइमैटिक प्रक्रिया को रोजगार । प्राप्त व्यवहार्य डीएसएम कोशिकाओं का अध्ययन विभिन्न एकल सेल तकनीकों द्वारा किया जा सकता है जिसमें वर्णित एम्फोटेरिसिन-बी पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी शामिल है ताकि शारीरिक और औषधीय गुणों को प्रकट किया जा सके।
मूत्राशय की दीवार के भीतर मौजूद डिट्रसर चिकनी मांसपेशी (डीएसएम) कोशिकाएं अंततः मूत्र भंडारण और शून्य की सुविधा प्रदान करती हैं। व्यवहार्य, ताजा और अलग-थलग पड़ी डीएसएम कोशिकाओं की तैयारी एक महत्वपूर्ण तकनीकी चुनौती प्रस्तुत करती है जिसकी उपलब्धि बाद के कार्यात्मक और आणविक अध्ययनों के लिए इष्टतम कोशिकाएं प्रदान करती है। विधि विकसित और यहां सविस्तार, सफलतापूर्वक एक दशक से अधिक के लिए हमारे समूह द्वारा इस्तेमाल किया, मानव मूत्राशय खुले मूत्राशय सर्जरी से प्राप्त नमूनों के विच्छेदन का वर्णन करता है एक एंजाइमैटिक दो डीएसएम टुकड़े और यांत्रिक trituration के कदम उपचार के बाद हौसले से अलग DSM कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए । प्रारंभिक चरण में म्यूकोसा (यूरोथेलियम, लेमिना प्रोपेरिया, और मस्कुलिस म्यूकोसा) और आसन्न संयोजी, संवहनी और मौजूद ऊतकों से डीएसएम परत (जिसे मस्कुलिस प्रोपरिया के रूप में भी जाना जाता है) को अलग करने के लिए विच्छेदन शामिल है। इसके बाद डीएसएम को नाममात्र सीए2 +में टुकड़ों (2-3 मिमी x 4-6 मिमी) में काट दिया जाता है-जिसमें विच्छेदन/पाचन समाधान (डीएस) होता है । डीएसएम टुकड़े अगले स्थानांतरित कर रहे है और क्रमिक रूप से प्रति कदम 30-45 मिन के लिए ~37 डिग्री सेल्सियस पर papain और कोलेजेनेज युक्त डीएस के साथ अलग से इलाज किया जाता है । एंजाइम-मुक्त गोजातीय सीरम और आग पॉलिश पिपेट के साथ त्रितुएं के साथ डीएस युक्त धोता के बाद, टुकड़े एकल डीएसएम कोशिकाओं को छोड़ते हैं। हौसले से अलग डीएसएम कोशिकाएं आदर्श रूप से आयन चैनलों के पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और औषधीय लक्षणों के लिए अनुकूल हैं। विशेष रूप से, हम बताते हैं कि TRPM4 चैनल अवरोधक 9-phenanthrol वोल्टेज-कदम पैदा की गई cation धाराओं को कम कर देता है जो एम्फोटेरिसिन-बी छिद्रित पैच-क्लैंप दृष्टिकोण के साथ दर्ज की गई है। डीएसएम कोशिकाओं का अध्ययन अन्य तकनीकों जैसे एकल सेल आरटी-पीसीआर, माइक्रोऐरे विश्लेषण, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री, सीटू निकटता लिगामेंट परख में और सीए2 + इमेजिंग द्वारा भी किया जा सकता है। एकल डीएसएम कोशिकाओं का उपयोग करने का मुख्य लाभ यह है कि किए गए अवलोकन सीधे एकल कोशिका विशेषताओं से संबंधित हैं। हौसले से अलग मानव डीएसएम कोशिकाओं के अध्ययनों ने मूत्राशय में सेशन-चाली योग्य सहित विभिन्न आयन चैनलों के गुणों की विशेषता वाली महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है और डीएसएम सेलुलर गुणों और नियामक तंत्र ों को स्पष्ट करने में सोने के मानक के रूप में जारी रहेगा।
Detrusor चिकनी मांसपेशी (डीएसएम) कोशिकाएं मूत्राशय में सबसे प्रचुर मात्रा में कोशिका प्रकार का गठन करती हैं और अंततः मूत्र भंडारण को नियंत्रित करती हैं और क्रमशः विश्राम और संकुचन के माध्यम से शून्य होती हैं। डीएसएम कोशिकाएं चिकनी मांसपेशियों के बंडल बनाती हैं जो आसन्न संयोजी ऊतक, तंत्रिका प्रक्रियाओं, इंटरस्टिशियल कोशिकाओं और अन्य कोशिकाप्रकारों केसाथ आपस में जुड़े होते हैं। मूत्राशय समारोह में डीएसएम कोशिकाओं की भूमिका की वर्तमान समझ एक बहु-स्तरीय एकीकृत दृष्टिकोण के माध्यम से हासिल की गई है। प्रत्येक प्रयोगात्मक विधि – चाहे विट्रो में अलग-अलग एकल कोशिकाओं पर आधारित हो, विट्रो/पूर्व वीवो में चिकनी मांसपेशियों के बंडलों वाले ऊतक स्ट्रिप्स, या वीवो निर्धारण (जैसे साइटोमेट्री और शून्य समारोह आकलन) में – डीएसएम के शारीरिक और औषधीय गुणों में महत्वपूर्ण और विशिष्ट अंतर्दृष्टि प्रदान करता है (कृपया विवरण के लिए समीक्षा1,2,3,4,5,6 देखें)। हालांकि, अलग-थलग एकल कोशिकाओं से प्राप्त परिणामों की व्याख्या निष्कर्षों को विशेष रूप से एकल कोशिका प्रकार के लिए जिम्मेदार ठहराने की अनुमति देती है। यह बोध पूरी मोटाई मूत्राशय के नमूनों से हौसले से अलग DSM कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक विश्वसनीय और प्रजनन विधि की स्थापना के लिए प्रेरक शक्ति रहा है । कई अन्य सेल प्रकारों के विपरीत, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को उनके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और अनुबंधित गुणों7,8में विशिष्ट परिवर्तन सहित उनके देशी फेनोटाइप के नुकसान के कारण मज़बूती से सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है। यह तथ्य शारीरिक रूप से सक्रिय हौसले से अलग डीएसएम कोशिकाओं पर किए गए अध्ययनों के महत्व को और पुष्ट करता है।
1 9 80 के उत्तरार्ध और 1 99 0 के दशक की शुरुआत में, इसेनबर्ग के समूह (जर्मनी) ने गिनी पिग मूत्राशय9,10,11,12,13 (टेबल 1)से प्राप्त ताजा अलग-थलग डीएसएम कोशिकाओं पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययनों की एक श्रृंखला प्रकाशित की। विधि दो महत्वपूर्ण टिप्पणियों कि महत्वपूर्ण कोशिकाओं को प्राप्त करने में सहायता प्राप्त है और दूसरों के लिए एक प्रारंभिक दिशानिर्देश के रूप में कार्य करने के लिए पालन पर प्रकाश डाला । वे 1 थे) पूर्व सीए के साथ अलग DSM टुकड़े का इलाज+मुक्त समाधान/मध्यम एंजाइमैटिक उपचार से पहले और 2) कोलेजेनेस युक्त समाधान के साथ ऊतक पाचन । इन दो महत्वपूर्ण चरणों को डीएसएम सेल विच्छेदन प्रक्रियाओं(तालिका 1)के बाद के सभी वेरिएंट में शामिल किया गया है । वर्तमान में, हमारा समूह दो कदम अनुक्रमिक पापिन-कोलेजेनेज़ विसोशन दृष्टिकोण को नियोजित करता है। डीएसएम टुकड़ों को पहले एक एंजाइम समाधान के साथ इलाज किया जाता है जिसमें पाकिन होता है और फिर कोलेजेनेज टाइप II के साथ एक ही समाधान (डीएस, विच्छेदन/पाचन समाधान) में घुलनशील होता है। यह दृष्टिकोण गिनी सुअर, सुअर, चूहा, माउस, और महत्वपूर्ण रूप से मानव(तालिका 1)सहित विभिन्न प्रजातियों से एकल डीएसएम कोशिकाओं की पैदावार करता है।
एकल डीएसएम कोशिकाएं कई आणविक जीव विज्ञान और शारीरिक प्रयोगों के लिए एक स्रोत प्रदान करती हैं। अब तक, प्रोटीन और एमआरएनए एक्सप्रेशन ्सइम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के साथ अध्ययन किया, या आरटी-पीसीआर/क्यूआरटी-पीसीआर निर्धारण ों ने बड़े आचरण वोल्टेज और सीए2 +-सक्रिय (बीके), छोटे आचरण सीए2 +-सक्रिय कश्मीर+ टाइप 3 (SK3) सहित विभिन्न आयन चैनलों के लिए पता लगाने के उच्च स्तर का पता चला, वोल्टेज-gated कश्मीर+ (कश्मीरv),एल प्रकार वोल्टेज gated Ca2 + (Ca v),और क्षणिक रिसेप्टर संभावित मेलेस्टोनिन प्रकार 4 (TRPM4) चैनलों, साथ ही एक Na/Ca2 + एक्सचेंजर 14,15,16,17,18,19,20,21,22. वे सभी डीएसएम एक्सीबिलिटी, इंट्रासेलर सीए2 + स्तर और संकुचन को नियंत्रित करने के लिए सोचा जाता है। पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोण, गिनी पिग, माउस, चूहा, या मानव डीएसएम कोशिकाओं पर सीधे प्रदर्शन किया, एल प्रकार सीएवी,कश्मीरवी (Kv2.x.K v7), एसके, बीके, और TRPM4चैनल17,19,20,21,22,23, 24,25 के जैव भौतिक और औषधीय गुणों का प्रत्यक्ष प्रदर्शन प्रदान किया 26,27,28,29,30,31. दृष्टिकोण में एक पारंपरिक पूरे सेल वोल्टेज-क्लैंप, एक छिद्रित वोल्टेज-क्लैंप, और एकल चैनल रिकॉर्डिंग (सेल संलग्न, अंदर-बाहर और बाहर-बाहर विन्यास) शामिल थे। इसके अतिरिक्त, वर्तमान-क्लैंप का उपयोग करके डीएसएम की झिल्ली संभावित रिकॉर्डिंग ने सबूत प्रदान किए कि लक्ष्य-आकर्षक औषधीय एजेंट सेल एक्सीबिलिटी को बदल देते हैं। उदाहरण के लिए, टीआरपीएम4 अवरोधक 9-फेनांथरोल ने मनुष्यों, गिनी पिग और चूहे मूत्राशय19,20,22,31से प्राप्त डीएसएम कोशिकाओं में हाइपरपोलराइजेशन को प्रेरित किया। विभिन्न इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तरीकों में, एम्फोटेरिसिन-बी (और नास्टेटिन, ग्रामिसिडिन, और ए-एस्सिन) छिद्रित पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग आंतरिक इंट्रासेलुलर सिग्नलिंग अणुओं और रास्तों को संरक्षित करके एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करते हैं। केवल कम आणविक वजन के सेशन और एक हद तक,सीएल-लेकिन प्रोटीन या सीए2 + सहित संकेत अणुओं नहीं-एम्फोटेरिसिन-बी या nystatin३२द्वारा गठित प्लाज्मा झिल्ली छिद्रों के माध्यम से पारगम्य हैं । छिद्रित पैच-क्लैंप प्रयोगों का सफल परिणाम इस तकनीक के लिए अद्वितीय कई सामान्य चरों पर निर्भर करता है। यहां, हम एम्फोटेरिसिन-बी का उपयोग करने वाली प्रक्रिया के विवरणों का वर्णन करते हैं कि हमारे समूह ने वर्ष15,22,33,34,35,36,37,38,39वर्षों में सफलतापूर्वक उपयोग किया है।
यकीनन, गैर चयनात्मक cation चैनल डीएसएम कोशिकाओं में सबसे कम समझ चैनल प्रकारों में से एक रहते हैं । गैर-चयनात्मक सेशन जैसे चैनल की पहली रिपोर्ट १९९३ की तारीखें हैं । The paper by Wellner and Isenberg11 described a 33 pS stretch-activated single channel displaying the following rank order of ion permeability: K+>Na+>Cs+>>>Ba2+>Ca2+, and inhibition of channel activity by Gd3+, a general inhibitor of non-selective cation channels. लगभग एक दशक बाद, थोर्नलो और नेल्सन40 ने पूरे सेल रिकॉर्डिंग का उपयोग करके, जीडी3 +द्वारा बाधित माउस डीएसएम कोशिकाओं में एनए+ चालू cation धाराओं का वर्णन किया। चूंकि गैर-चयनात्मक cation चैनलों और उनके जैव भौतिक लक्षणों की आणविक पहचान निर्धारित की जानी बाकी है, इसलिए इस शोध क्षेत्र में भविष्य की जांच की आवश्यकता है । गैर-चयनात्मक cation चैनल धाराओं की रिकॉर्डिंग के लिए यहां वर्णित प्रोटोकॉल – सीएस+,टी+और निफेडिपाइन(तालिका 2)वाले बाह्युलर और पिपेट इंट्रासेलर समाधानों का उपयोग करके, जो शारीरिक और औषधीय रूप से Kv और Cav धाराओं को कम करता है – गैर-चयनात्मक cation चैनलों की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल जांच में उपयोगी रहा है और जारी रहेगा। हमने इस विशिष्ट प्रोटोकॉल का उपयोग गिनी पिग, चूहा और मानव डीएसएम कोशिकाओं19,20,22में TRPM4 चैनल अवरोधक 9-फेनांथरोल द्वारा पूरे सेल cation धाराओं के अवरोध की सीमा निर्धारित करने के लिए किया है।
एक साथ लिया, मानव मूत्राशय से हौसले से अलग एकल DSM कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए यहां वर्णित विधि पैच-क्लैंप तकनीक के विभिन्न विन्यासों का उपयोग करके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल जांच के लिए अत्यधिक उपयुक्त व्यवहार्य कोशिकाओं को प्रदान करती है, Ca2 +-इमेजिंग, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री, सीटू समीपस्थ मुकदमेबाजी परख में, और एकल सेल आरटी-पीसीआर/क्यूआरटी-पीसीआर के साथ-साथ माइक्रोरेरे एनालिसिस, आरएनए-सीक्यू और चिप-सीक्यू सहित उन्नत आणविक जीव विज्ञान तकनीकें । एम्फोटेरिसिन-बी छिद्रित पैच-क्लैंप विधि का उपयोग अन्य विन्यासों के विपरीत देशी सेल वातावरण को बरकरार रखता है। यहां उल्लिखित विशिष्ट शर्तों का उपयोग करके किए जाने पर, डीएसएम कोशिकाओं में कश्मीर+ और सीए2 + धाराओं के योगदान को नकारने के लिए डिज़ाइन किया गया, वोल्टेज-स्टेप प्रेरित धाराएं बायोफिजिकल और औषधीय लक्षणों के लिए उपयुक्त गैर-चयनात्मक cation धाराओं के गुणों को प्रदर्शित करती हैं।
यहां वर्णित प्रक्रियाओं पूरी मोटाई मानव मूत्राशय के नमूनों से व्यवहार्य, हौसले से अलग DSM कोशिकाओं की तैयारी में शामिल कदम ों की व्याख्या एंजाइमैटिक पाचन का उपयोग कर और पूरे सेल cation TRPM4 चैनल अवरोधक 9-phenanthrol के प्रति संवेदनशील धाराओं की रिकॉर्डिंग में एम्फोटेरिसिन-बी छिद्रित पैच-क्लैंप दृष्टिकोण को रोजगार । एंजाइमैटिक प्रक्रिया एक दो कदम अनुक्रमिक जोखिम पर निर्भर करता है जो अनुक्रमिक पापाइन-कोलेजेनेज़ पाचन विधि के रूप में इसके लिए संदर्भित किया जाता है। डीएसएम ऊतकों को पहले नाममात्र सीए2 +-मुक्त स्थिति के तहत पाकिन और डिथियोथ्रेइटॉल (एक एंजाइम स्थिर एजेंट) के साथ इलाज किया जाता है, जिसके बाद कम सीए2 +की उपस्थिति में कोलेजेनेज टाइप II द्वारा दूसरे चरण में पीछा किया जाता है। चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में कम सीए2 + स्थितियों के तहत पापपाचन को बाहर ले जाने का तर्क 1 9 80 के दशक के उत्तरार्ध में है। पाकिन के साथ तैयार ताजा अलग-थलग कैरोटिड धमनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं ने एक लम्बी आकार प्रदर्शित किया, व्यवहार्यता (ट्राइपैन ब्लू तेज करने के लिए प्रतिरोध) दिखाया और संकुचन उत्तेजनाओं (उच्च सीए2 + और हिस्टामाइन)65का जवाब दिया। वर्षों बाद, इस विधि को डीएसएम कोशिकाओं की तैयारी में लागू किया गया था (तालिका 1देखें)। अन्य प्रकारों के बजाय कोलेजेनेज प्रकार II का चुनाव इसकी अपेक्षाकृत उच्च प्रोटेलोलिटिक गतिविधि से संबंधित है जो डीएसएम सहित चिकनी मांसपेशियों के ऊतकों के लिए आदर्श रूप से अनुकूल है। दरअसल, अकेले कोलेजेनेस उपचार एकल डीएसएम कोशिकाओं को उपज सकता है, हालांकि व्यापक एंजाइम एक्सपोजर (60 मिन)53,54की आवश्यकता होती है। चूंकि कोलेजेनेज़ गतिविधि सीए2 + पर निर्भर करती है और एंजाइम सीए2 +-मुक्त स्थितियों के तहत निष्क्रिय है, इसलिए डीएसएम टुकड़ों के इष्टतम एंजाइमीय पाचन के लिए सीए 2+ 66की उपस्थिति की आवश्यकता होती है। हमारे मामले में, डीएस-सी में 100-200 माइक्रोन [सीए2+](तालिका 2)शामिल हैं। एंजाइमों के उपचार के बाद, पचाने वाले डीएसएम टुकड़ों को ऊतकों से बंधे किसी भी एंजाइम को हटाने के लिए एंजाइमों या सीए2 + के बिना ठंडे डीएस के साथ कई बार धीरे-धीरे धोया जाता है। बर्फ ठंडा डीएस डीएसएम सेल अखंडता को संरक्षित करने और किसी भी शेष पाकिन या कोलेजेनेस की एंजाइमैटिक गतिविधि को सीमित करने में मदद करता है। अंतिम चरण में, एंजाइम का इलाज डीएसएम टुकड़ों का त्रिचरन एक आग पॉलिश पाश्चर पिपेट के साथ एकल डीएसएम सेल जारी करता है। डीएसएम कोशिकाओं को या तो तुरंत पैच-क्लैंप अध्ययन या अन्य प्रकार के प्रयोग के लिए रिकॉर्डिंग कक्ष पर रखा जाता है या उसी दिन बाद में उपयोग के लिए डीएस में बर्फ पर संग्रहीत किया जाता है (आमतौर पर तैयारी के 8 बजे के भीतर, लेकिन कोशिकाएं 24 घंटे तक व्यवहार्य रहती हैं)।
हमने एकल डीएसएम कोशिकाओं को सफलतापूर्वक प्राप्त करने के लिए कई महत्वपूर्ण विचारों की पहचान की। पहला मानव डीएसएम नमूना स्रोत गुणवत्ता से संबंधित है। ऊतक अखंडता को बेहतर ढंग से संरक्षित करने के लिए, खुले मूत्राशय की सर्जरी से प्राप्त डीएसएम नमूनों को जितनी जल्दी हो सके बर्फ-ठंडे डीएस में रखा जाता है और ठंडे वातावरण में बनाए रखा जाता है। विशेष रूप से, रोगी से सर्जिकल निष्कर्षण पर, मूत्राशय का नमूना तुरंत ऑपरेटिंग रूम में पूरी तरह से तैयार साइड टेबल पर रखा जाता है। पूरे नमूने की सकल परीक्षा (आमतौर पर कट्टरपंथी या सरल सिस्टेक्टॉमी के दौरान प्राप्त) और इसके उद्घाटन का पालन करें। दृश्य निरीक्षण के बाद, पूरे मोटाई मूत्र सीढ़ी नमूने का एक टुकड़ा ट्यूमर के साथ अत्यधिक शामिल नमूने के एक दूरदराज के क्षेत्र से हटा दिया जाता है और तुरंत एक कप (या तो ५० या १०० मिलील) में रखा जाता है जिसमें ठंड (~4 डिग्री सेल्सियस) विच्छेदन समाधान (डीएस)(तालिका 2)होता है और फिर ढक्कन के साथ कसकर बंद हो जाता है। ऊतक की कटाई की नियोजित प्रकृति के कारण, ऑपरेटिंग रूम कर्मियों और सहायक कर्मचारियों को कटाई कर रहे हैं, जो ऊतक निष्कर्षण के समय ऑपरेटिंग रूम में सामग्री उपलब्ध कराने के लिए शल्य चिकित्सा मामले की शुरुआत में सतर्क हो जाते हैं। प्रसंस्करण चरणों की दिनचर्या, दोहराव प्रकृति के साथ ये सावधानियां ऊतक के लिए गर्म इस्केमिया समय रखते हैं – डीएस समाधान के साथ ठंडा कंटेनर में निष्कर्षण से प्लेसमेंट तक – 5 से कम मिन तक। इसके बाद कंटेनर को ठंडे वातावरण को बनाए रखने के लिए कूलर में फ्रिज में या बर्फ पर रखा जाता है और प्रयोगशाला में (बर्फ-ठंड) ले जाया जाता है। एक बार नमूना प्रयोगशाला में आता है, विच्छेदन और एंजाइमैटिक विच्छेदन कदम शुरू करते हैं । यह भविष्यवाणी करना बहुत मुश्किल है कि क्या दिए गए डीएसएम नमूने से एंजाइमैटिक वियोजन के बाद उच्च गुणवत्ता वाली डीएसएम कोशिकाएं निकलेंगी, इसलिए हम एंजाइमैटिक विच्छेदन चरणों के साथ आगे बढ़ें। कई मामलों में, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों के समानांतर, हमारा समूह एक ही डीएसएम नमूनों से तैयार डीएसएम स्ट्रिप्स पर आइसोमेट्रिक तनाव रिकॉर्डिंग आयोजित करता है। हमने पाया है कि हम आमतौर पर तैयारी से उच्च गुणवत्ता वाले डीएसएम कोशिकाओं को प्राप्त कर सकते हैं जो आइसोमेट्रिक संकुचन अध्ययन (हमारे अप्रकाशित अवलोकन) के लिए व्यवहार्य स्ट्रिप्स भी प्रदान करते हैं।
दूसरा कारक विभिन्न एंजाइम लॉट वेरिएबिलिटी से संबंधित है। हमने देखा कि पाकिन और कोलेजेनेज़ टाइप II दोनों के लिए, हर बार एक आपूर्तिकर्ता से एक नया बहुत एंजाइम आता है, ऊतक पाचन के लिए डीएस में एंजाइम गतिविधि भिन्न हो सकती है। इसलिए, हम नियमित रूप से प्रत्येक नई बहुत कुछ के लिए एंजाइम एकाग्रता और ऊष्मायन अंतराल का अनुकूलन करते हैं। बहुत परिवर्तनशीलता योगदान को कम करने के लिए, हम एक ही बहुत बड़ी मात्रा में आदेश और एंजाइमों के 2 mL aliquots में स्टॉक समाधान का एक बड़ा बैच बनाने के लिए और उपयोग तक ~-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । समय के साथ, हालांकि, जमे हुए स्टॉक (2 सप्ताह तक संग्रहीत) अपनी एंजाइमैटिक गतिविधि खो सकते हैं। तीसरा चर एंजाइम पाचन उपचार के तापमान से संबंधित है। पाकिन और कोलेजेनेज़ दोनों की एंजाइमैटिक गतिविधियां तापमान-निर्भरता प्रदर्शित करते हैं। पाकिन और कोलेजेनेज़ प्रकार-2 सामान्य शरीर के शरीर के शरीर विज्ञान67,68को शामिल करते हुए तापमान पर्वतमाला में गतिविधि प्रदर्शित करते हैं । इसलिए, हमारा उद्देश्य डीएसएम सेल अखंडता को संरक्षित करने के लिए उच्च तापमान से बचने के लिए ~ 37 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम उपचार स्थिर बनाए रखना है। चौथा विचार उच्च व्यवहार्य (उत्कृष्ट शास्त्रीय चिकनी मांसपेशियों की विशेषताओं का प्रदर्शन) से लेकर गैर-स्वस्थ, अधिक पचाने वाली कोशिकाओं तक प्रत्येक तैयारी के भीतर मौजूद डीएसएम कोशिकाओं की गुणवत्ता की परिवर्तनशीलता से संबंधित है। एक लंबे समय तक एंजाइम ऊष्मायन अंतराल क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की एक उच्च संख्या प्राप्त करने के लिए मुख्य कारणों में से एक है । अत्यधिक एंजाइम उपचार आयन चैनलों, रिसेप्टर्स और ट्रांसपोर्टरों की प्रोटीन संरचनाओं को भी ख़राब करते हैं, जिससे उनकी कार्यक्षमता पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है। एंजाइमैटिक रूप से प्राप्त परिणामों की व्याख्या, हौसले से अलग-थलग कोशिकाओं को इस विचार को ध्यान में रखना चाहिए। एंजाइम पाचन स्थितियों के अनुकूलन का उद्देश्य अत्यधिक व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत को बढ़ाना है। सूक्ष्म सरणी विश्लेषण जैसी व्यवहार्य कोशिकाओं की अधिक संख्या पर निर्भर प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों को एकल-कोशिका पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या सीए2 + इमेजिंग जैसी कम कोशिकाओं पर सफलतापूर्वक किए गए लोगों की तुलना में अधिक मजबूत अनुकूलन की आवश्यकता होती है। उपर्युक्त कारकों पर विचार उच्च गुणवत्ता वाले एकल डीएसएम कोशिकाओं को प्राप्त करने में पिछले दशक में हमारे अनुसंधान प्रयासों का मार्गदर्शन किया गया है ।
छिद्रित पैच-क्लैंप तकनीक एक शताब्दी के एक चौथाई से अधिक के लिए एक मुख्य आधार इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोण रहा है। कई प्रकाशन तकनीकी विचारों का विवरण प्रदान करते हैं69,70,71,72,73. सेल छिद्र एम्फोटेरिसिन-बी, नायस्टेटिन, ग्रामिसिडिन, या एसिसिन के साथ प्राप्त किया जा सकता है (संदर्भ देखें32प्रत्येक के अवलोकन के लिए)। अन्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोणों पर छिद्रित पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का मुख्य लाभ यह है कि देशी इंट्रासेलर वातावरण – जिसमें इंट्रासेलर सीए भी शामिल है2+और संकेत अणुओं (जैसे, सीएमपी, पीकेए, फॉस्फेट, और फॉस्फोडिस्टेरेस) – संरक्षित है। इसलिए, यह तकनीक आदर्श रूप से शारीरिक परिस्थितियों के तहत पूरे सेल आयन चैनल धाराओं और उनके नियामक तंत्र की जांच के लिए अनुकूल है। एक प्रमुख चेतावनी यह है कि इंट्रासेलर सेल संरचना को पारंपरिक संपूर्ण सेल और एकल-चैनल उत्पादशुल्क-पैच (अंदर और बाहर-बाहर) रिकॉर्डिंग जैसे अन्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तरीकों के विपरीत ठीक से नियंत्रित नहीं किया जा सकता है। हमारे अनुभव में, तीन कारक नियमित रूप से एम्फोटेरिसिन-बी-छिद्रित पैच-क्लैंप प्रयोगों के सफल प्रयोगात्मक परिणामों में योगदान देते हैं। पहला डीएसएम सेल की गुणवत्ता है जो रिकॉर्डिंग का प्रयास करने के लिए चुना गया है। जब डीएसएम कोशिकाएं अर्ध-संकुचन (टेढ़ा-जैसे) को प्रदर्शित करने के लिए अत्यधिक व्यवहार्य होती हैं, तो सेल सतह के चारों ओर एक अच्छी तरह से परिभाषित प्रभामंडल के साथ उच्च-विपरीत चमकदार उपस्थिति होती है और रिकॉर्डिंग कक्ष के ग्लास बॉटम को कसकर संलग्न करती है तो गीगा-सील गठन और सेल छिद्र अपेक्षाकृत आसान होते हैं। सफलता के लिए दूसरा और तीसरा कारक क्रमशः, स्रोत की गुणवत्ता और एम्फोटेरिसिन-बी (डाइमेथिल सल्फाक्साइड/डीएमएसओ और इंट्रासेलुलर पिपेट समाधान में) के घुलनशीलीकरण से संबंधित है । हमने स्रोत और बहुत भिन्नताओं के मामले में विभिन्न आपूर्तिकर्ताओं के बीच विसंगतियों का अवलोकन किया। प्रत्येक दिन हम पाउडर से एम्फोटेरिसिन-बी स्टॉक समाधान का एक नया समाधान तैयार करते हैं जिसके बाद इंट्रासेलुलर पिपेट समाधान में इसका कमजोर पड़ना होता है। इन चरणों में व्यापक ध्वनि और भंवर की आवश्यकता होती है। हौसले से बनाया एम्फोटेरिसिन-बी युक्त पिपेट समाधान के साथ, सफल सेल छिद्र (+Ca2+, और मानव, गिनी सुअर, माउस, और/या चूहा DSM कोशिकाओं से गैर चयनात्मक cation धाराओं17,21,22,23,29,30,31,35,60. यहां, हम मानव डीएसएम कोशिकाओं में गैर-चयनात्मक cation धाराओं को रिकॉर्ड करने के लिए शर्तों का वर्णन करते हैं। 9-फेनांथ्रोल, TRPM4 चैनलों के अवरोधक, DSM एक्सीबिलिटी के नियंत्रण में इन चैनलों की भूमिका का समर्थन करने वाले वोल्टेज-स्टेप प्रेरित धाराओं को तनु । एक नोट के रूप में, यह आमतौर पर एक गीगा-सील और छिद्र की शुरुआत प्राप्त करने के लिए इष्टतम स्थिर वोल्टेज कदम प्रेरित गैर चयनात्मक cation धाराओं को प्राप्त करने के बाद कम से कम 45 मेंस की आवश्यकता होती है। वोल्टेज रैंप भी वोल्टेज कदम प्रोटोकॉल के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है30,64. यहां, एक हाइपरपोलाइज्ड होल्डिंग झिल्ली क्षमता से एक वोल्टेज-कदम प्रोटोकॉल को रैंप प्रोटोकॉल के बजाय पसंद किया गया था क्योंकि पूर्व दृष्टिकोण वोल्टेज-निर्भर निष्क्रियता के प्रभाव को कम करता है और एक अवधि में पैदा किए गए वर्तमान के औसत के लिए अनुमति देता है एक वोल्टेज-चरण का जहां रैंप प्रति वोल्टेज एक डेटा पॉइंट प्रदान करता है। उत्तरार्द्ध बिंदु विशेष रूप से मानव डीएसएम कोशिकाओं पर लागू होता है क्योंकि धाराएं वोल्टेज चरणों के दौरान चर गतिविधि दिखाती हैं (चित्रा 5औरचित्रा 6). डीएसएम कोशिकाओं और अन्य सेल प्रकारों के गुणों की पहचान करने में एम्फोटेरिसिन-बी छिद्रित पैच-क्लैंप तकनीक आवश्यक रही है और भविष्य में उपन्यास खोजों को प्रदान करने में सहयोगी बनी रहेगी। इसके अलावा, हौसले से अलग एकल DSM कोशिकाओं को सफलतापूर्वक पूरे सेल कश्मीर को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है+Cl–, और सीए2+पैच-क्लैंप तकनीक के पारंपरिक मोड के साथ धाराएं, वर्तमान क्लैंप के साथ झिल्ली संभावित रिकॉर्डिंग, और हमारी पूर्व रिपोर्टों द्वारा उदाहरण के रूप में एकल चैनल रिकॉर्डिंग23,29,35,64.
एकल सेल पैच-क्लैंप विधियों के अलावा, ताजा रूप से अलग-थलग पड़ी डीएसएम कोशिकाओं का अध्ययन सीए2 + इमेजिंग, आरटी-पीसीआर/क्यू-आरटी-पीसीआर, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री, सीटू निकटता लिगेशन परख में, और जीनोमिक दृष्टिकोण (जैसे, माइक्रोऐरे, आरएनए-सीक्यू, चिप-एसईक्यू)15, 18,30,33,सहित अन्य तकनीकी दृष्टिकोणों के साथ किया जा सकता है। के रूप में एकल सेल प्रतिलेखन दृढ़ संकल्प तरीकों को विकसित करने और अत्यधिक संवेदनशील हो जारी है, हम एक भविष्य के लिए नियमित रूप से और विशेष रूप से अपने प्रतिलेखन के साथ व्यक्तिगत DSM कोशिकाओं के विद्युत या औषधीय गुणों को जोड़ने की क्षमता में कल्पना/ यह एक डीएसएम सेल से पहले रिकॉर्डिंग और फिर mRNA या प्रोटीन निकालने के बाद ट्रांसक्रिप्टोमिक/प्रोटेओमिक विश्लेषण द्वारा प्राप्त किया जाएगा । हालांकि इस तरह के तरीकों को पहले से ही गैर-डीएसएम कोशिकाओं में परीक्षण किया गया है, वे वर्तमान में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हैं, नियमित माने जाने वाली संवेदनशीलता की कमी है, और कुछ चयनित जीन उत्पादों74का सफल पता लगाने तक सीमित है। क्रिया-आणविक प्रोफ़ाइल अभिव्यक्ति अध्ययन को जोड़ने जब नियंत्रण और रोगग्रस्त रोगी से प्राप्त मूत्राशय से प्राप्त DSM कोशिकाओं पर किया-दाताओं शारीरिक प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा सामांय DSM कार्यों, रोगजनन ड्राइविंग के लिए आवश्यक है, और प्रभावी उपंयास चिकित्सकीय दृष्टिकोण की पहचान करने में ।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को एनआईएच-आर01डीके 106964 और पी20डीके 123971 अनुदान जॉर्जी वी पेटकोव द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक पांडुलिपि के महत्वपूर्ण मूल्यांकन के लिए डॉ विक्टर यारोटस्की और सुश्री सारा मैक्सवेल का शुक्रिया अदा करते हैं । हम भी MUSC और UTHSC में यूरोलॉजी स्टाफ सर्जन के लिए आभारी हैं: Drs. थॉमस Keane, हैरी क्लार्क, स्टीफन Savage, रॉस Rames, संदीप प्रसाद, जोनाथन Picard, क्रिस्टोफर Ledbetter, और एंथनी पैटरसन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से MUSC और UTHSC यूरोलॉजी निवासियों: Drs. टेलर वॉन, सैमुअल वॉकर निकल्स, मैथ्यू यंग, आयन बर्न्स, जस्टिन एलेट, रयान लेवे, ऑस्टिन यंग, मार्क क्यूरिन, निमा बारार्टन, ओलुगबेमिसोला मैककॉय, ट्रेसी टिप्टन, ब्राइस वायाट, एलिसा ग्रीमैन, सारा स्टारोस्टा, हारून ब्लोच, क्रिस्टीन कॉलवे, ल्यूसिले कॉक्स, क्रिश्चियन दीवान, आयन हेटमैन, ब्रैडली ह्यूस्टन, स्टीफन लेग, रॉबर्ट एस लिब्बी, कोल लॉकलर, क्रिस्टन मार्ले, मोनिका ओ हैनलॉन, पैट्रिक प्रोबस्ट, सिंथिया शार्डिन, एलिजाबेथ टूरविले, डेनियल जपाटा मानव ऊतक संग्रह के साथ उनकी मदद के लिए ।
5 ml polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps |
9-Phenanthrol | Sigma-Aldrich | 211281 | TRPM4 channel inhibitor |
Amphotericin-B | Fisher | BP928-250 | Used for patch/cell perforation |
Amphotericin-B | European Pharmacopoeia Reference Standards | 5 | Used for patch/cell perforation |
Amphotericin-B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | Used for patch/cell perforation |
Analog vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9006 | Intracellular pipette solution |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | DS |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | Extracellular solution and DS |
Capillary Glass | Sutter | BF150-110-7.5 | Capillary for preparation of pulled patch electrodes |
Cesium hydroxide hydrate | Sigma-Aldrich | C8518 | Intracellular pipette solution |
Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs | Axon Instruments/ Molecular Devices | pCLAMP-10 | Commerical software and part of patch-clamp rig setup |
Collagenase type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | DS-C |
CsCl | Sigma-Aldrich | 203025 | Extracellular and intracellular solutions |
Dental wax | Miltex Dental Wax Technologies, Inc. | 18058351 | |
Digital Thermometer with Probe | Fisher Scientific | 15-077-32 | Placed in tissue bath to monitor temperature |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Solvent |
DL-Dithiothreitol (DDT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Reducing agents used together with Papain |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | P-97 | Required to pull electrodes with very fine tips |
Floating foam tube rack/holder | VWR Scientific | 82017-634 | Used for holding tubes with enzymes for temperature control |
Glucose | Sigma | G8270 | |
Glutamic acid (Na salt) | Sigma-Aldrich | G1626 | DS |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | pH Buffer |
KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | Extracellular solution |
Low Noise Data Acquisition System | Axon Instruments/ Molecular Devices | Digidata 1440A | Part of patch-clamp rig setup |
Magnetic stirrer | VWR | 01-442-684 | |
MgCl2 (hexahydrate) | Sigma-Aldrich | M2670 | Extracellular and intracellular solutions |
MicroForge | Narishige | MF-830 | Used for fire-polishing electrodes |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Extracellular and intracellular solutions |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Nifedipine | Sigma-Aldrich | N7634 | L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker |
Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives | Nikon | Discontinued | Part of Patch-clamp rig setup |
Non-metalic syringe needle, MicroFil | WPI | MF-34G-5 | Filling of intracellular pipette solution |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | DS-P |
Pasteur pipette | FisherBrand | 13-678-20A | Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces |
Patch-clamp amplifier | Axon Instruments/ Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | Part of patch-clamp rig setup |
PC computer | DELL | Custom configuration | Part of patch-clamp rig setup |
pH Meter | Aspera Instruments | PH700 | |
Polyethylene tubing | Intramedic | 427-436 | Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber |
Tetraethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | T2265 | Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution |
Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870) | Thermo Scientific | Discontinued | Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup |
Tissue bath, 100 mL | Radnoti | 1583-101 | Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps |
Vinyl tubing | ColePalmer | 06405-3 | Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath |
Water circulator bath, Haake D1 L | Haake | Discontinued | Connected to tissue bath |
Weighting scale | Mettler Toledo | XS64 | |
ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives | Carl-Zeiss | Discontinued | Part of patch-clamp rig setup |