Biz iki adım lı enzimatik prosedür istihdam insan idrar kesesi örnekleri tek taze izole detrusor düz kas hücrelerinin hazırlanması için bir yöntem açıklar. Elde edilen canlı DSM hücreleri fizyolojik ve farmakolojik özellikleri ortaya çıkarmak için açıklanan amphotericin-B patch-clamp elektrofizyolojisi de dahil olmak üzere çeşitli tek hücre teknikleri ile incelenebilir.
İdrar kesesi duvarı içinde bulunan detrusor düz kas (DSM) hücreleri sonuçta idrar depolama ve voiding kolaylaştırmak. Canlı, taze ve izole Edilmiş DSM hücrelerinin hazırlanması, başarıları sonraki fonksiyonel ve moleküler çalışmalar için en uygun hücreleri sağlayan önemli bir teknik zorluk sunar. Burada geliştirilen ve özenle hazırlanmış ve on yılı aşkın bir süredir grubumuz tarafından başarıyla kullanılan yöntem, açık mesane ameliyatlarından elde edilen insan idrar kesesi örneklerinin diseksiyonunu, ardından DSM parçalarının enzimatik iki aşamalı tedavisini ve taze izole Edilmiş DSM hücrelerini elde etmek için mekanik triturasyonunu tanımlar. İlk adım diseksiyon mukoza (ürotelyum, lamina propria ve muscularis mukoza) ve komşu bağ, vasküler ve yağ dokuları mevcut dism asyon içerir . DSM daha sonra nominal Ca2+içeren diseksiyon/sindirim çözeltisi (DS) parçalara (2-3 mm x 4-6 mm) kesilir. DSM parçaları daha sonra adım başına 30-45 dakika boyunca ~37 °C’de papain ve kollajenaz içeren DS ile ayrı ayrı aktarılır ve sırayla işlem göredir. Enzimsiz büyükbaş hayvan serumu içeren DS ile yapılan yıkamalar ve ateşcilli pipetle tritürasyon sonrasında parçalar tek DSM hücreleri salgılar. Yeni izole Edilmiş DSM hücreleri iyon kanallarının yama-kelepçe elektrofizyolojik ve farmakolojik karakterizasyonu için idealdir. Özellikle, TRPM4 kanal bloker 9-phenanthrol amphotericin-B delikli yama-kelepçe yaklaşımı ile kaydedilen voltaj adım uyarılmış katyon akımları azaltır göstermektedir. DSM hücreleri tek hücreli RT-PCR, mikrodizi analizi, immünostokimya, yerinde yakınlık ligasyon tahlil ve Ca2+ görüntüleme gibi diğer tekniklerle de incelenebilir. Tek DSM hücrelerinin kullanılmasının en büyük avantajı yapılan gözlemlerin ortaya çıkan tek hücre özellikleriyle doğrudan ilişkili olmasıdır. Taze izole edilmiş insan DSM hücrelerinin çalışmaları, idrar kesesinde katyon geçirgenliği de dahil olmak üzere çeşitli iyon kanallarının özelliklerini karakterize eden önemli bilgiler sağlamıştır ve DSM hücresel özelliklerinin ve düzenleyici mekanizmaların aydınlatIlmesinde altın bir standart olarak devam edecektir.
Detrusor düz kas (DSM) hücreleri idrar kesesi en bol hücre tipini oluşturur ve sonuçta idrar depolama ve gevşeme ve daralma yoluyla boşluk kontrolü, sırasıyla. DSM hücreleri bitişik bağ dokusu, sinir süreçleri, interstisyel hücreler ve diğer hücre tipleri1ile iç içe düz kas demetleri oluşturur. DSM hücrelerinin idrar kesesi fonksiyonundaki rolünün güncel anlaşılması çok düzeyli entegre bir yaklaşımla sağlanmıştır. Her deneysel yöntem – ister vitro izole tek hücreler, in vitro /ex vivo düz kas demetleri içeren doku şeritleri, ya da in vivo tayini (sitometri ve voiding fonksiyon değerlendirmeleri gibi) – DSM fizyolojik ve farmakolojik özellikleri içine önemli ve özel anlayışlar sağlar (ayrıntılar için değerlendirmeler1,2,3,4,5,6 bakınız). Ancak, izole tek hücrelerden elde edilen sonuçların yorumlanması, sonuçların özellikle tek hücre tipinin kendisine atfedilmesine olanak tanır. Bu gerçekleşme tüm kalınlıkta idrar kesesi örnekleri taze izole DSM hücreleri elde etmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem oluşturmak için itici güç olmuştur. Diğer birçok hücre tipinin aksine, düz kas hücreleri elektrofizyolojik ve kontraktil özellikleri nde belirli değişiklikler de dahil olmak üzere kendi yerli fenotip kaybı nedeniyle güvenilir kültürlü olamaz7,8. Bu durum fizyolojik olarak aktif olan taze izole DSM hücreleri üzerinde yapılan çalışmaların önemini daha da güçlendirmektedir.
1980’lerin sonlarında ve 1990’ların başında, Isenberg grubu (Almanya) kobay idrar kesesi9,10,11,12,13 (Tablo 1)elde edilen taze izole DSM hücreleri üzerinde elektrofizyolojik çalışmalar bir dizi yayınladı. Yöntem, hayati hücrelerin elde edilmesine yardımcı olan ve diğerlerinin izlemesi için bir başlangıç kılavuzu olarak hizmet eden iki önemli gözlemin altını çizdi. Onlar 1) enzimajen tedavi öncesi Ca2 +-serbest çözelti / orta ve 2) kollajenaz içeren bir çözüm ile doku sindirimi ile izole DSM adet ön tedavi edildi. Bu iki kritik adım, DSM hücre dissosiyasyon yordamlarının sonraki tüm türevlerine dahil edilmiştir(Tablo 1). Şu anda, grubumuz iki aşamalı sıralı papain-kollajenaz dissociation yaklaşım kullanır. DSM parçaları önce papain içeren bir enzim çözeltisi ile, daha sonra kollajenaz tip II ile aynı çözeltide (DS, diseksiyon/sindirim çözeltisi) çözünür şekilde tedavi edilir. Bu yaklaşım, kobay, domuz, sıçan, fare ve daha da önemlisi insan dahil olmak üzere çeşitli türlerden tek DSM hücreleri verir(Tablo 1).
Tek DSM hücreleri birden fazla moleküler biyoloji ve fizyolojik deneyler için bir kaynak sağlar. Şimdiye kadar immünositokimya ile çalışılan protein ve mRNA ekspresyonu, veya RT-PCR/qRT-PCR tayinleri, büyük iletkenlik gerilimi ve Ca2+-aktif (BK), küçük iletkenlik Ca2+-aktif K+ tip 3 (SK 33), voltaj kapılı K+ (Kv),L tipi voltaj kapılı Ca2+ (Cav),ve geçici reseptör potansiyeli melastatin tip 4 (TRPM4) kanallarının yanı sıra Na/Ca2+ değiştirici 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Hepsinin DSM uyarılabilirliğini, hücre içi Ca2+ seviyelerini ve kontraktiliteyi kontrol ettikleri düşünülmektedir. Yama-kelepçe elektrofizyolojik yaklaşımlar, doğrudan kobay, fare, sıçan veya insan DSM hücreleri üzerinde gerçekleştirilen, L-tipi Cavbiyofiziksel ve farmakolojik özellikleri doğrudan gösteri sağlanan , Kv (Kv2.x. Kv7), SK, BK, ve TRPM4 kanalları17,19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31. Yaklaşımlar arasında konvansiyonel bir bütün hücre voltaj-kelepçesi, delikli voltaj-kelepçe ve tek kanallı kayıtlar (hücre bağlı, iç-dış ve dış-dış konfigürasyonlar) yer aldı. Buna ek olarak, dsm’nin akım kelepçesi kullanılarak membran potansiyeli kaydı, hedef le ilgili farmakolojik ajanların hücre uyarılabilirliğini değiştirdiğine dair kanıtlar sağlamıştır. Örneğin, TRPM4 inhibitörü 9-phenanthrol dsm hücrelerinde hiperpolarizasyon indüklenen insanlar, kobay, ve sıçan idrar kesesi19,20,22,31. Çeşitli elektrofizyolojik yöntemler arasında, amphotericin-B (ve nystatin, gramicidin ve β-escin) delikli yama-kelepçe kayıtları içsel hücre içi sinyal molekülleri ve yollarını koruyarak önemli bir avantaj sağlar. Sadece düşük molekül ağırlıklı katyonlar ve daha az ölçüde, Cl– ama protein veya Ca2 + dahil sinyal molekülleri – amfiericin-B veya nystatin32tarafından oluşturulan plazma membran gözenekleri ile geçirgen . Delikli yama-kıskaç deneylerinin başarılı sonucu, bu tekniğe özgü birçok genel değişkene bağlıdır. Burada grubumuzun15,22,33,34,35,36,37,38,39yıllarında başarıyla kullandığı amphotericin-B kullanan prosedürün ayrıntılarını açıklıyoruz.
Tartışmasız, non-selektif katyon kanalları DSM hücrelerinde en az anlaşılan kanal türlerinden biri olmaya devam etmektedir. Seçici olmayan katyon benzeri bir kanalın ilk raporu 1993 yılına dayanıyor. Wellner ve Isenberg11 tarafından kağıt iyon geçirgenlik aşağıdaki rütbe sırasını gösteren bir 33 pS streç-aktive tek kanal: K+>Na+>Cs+>>>Ba2+>Ca2+ve Gd3 +tarafından kanal aktivitesinin inhibisyonu , non-selektif katyon kanallarının genel bir inhibitörü. Neredeyse on yıl sonra, Thorneloe ve Nelson40 fare DSM hücrelerinde Na+ geçirgen katyon akımları açıklanan, Gd tarafından inhibe3 +, bütün hücre kayıtları kullanarak. Seçici olmayan katyon kanallarının moleküler kimlikleri ve biyofiziksel karakterizasyonları belirlenmeye devam ettiği için, bu araştırma alanında ileride yapılacak araştırmalar alabı gerekmektedir. Non-selektif katyon kanalı akımlarının kaydı için burada açıklanan protokol – cs+ ,TEA+içeren hücre dışı ve pipet intrasellüler solüsyon lar kullanılarak ve nifedipin(Tablo 2) bu fizyolojik ve farmakolojik olarak Kv ve Cav akımları azaltmak – non-selektif katyon kanallarının elektrofizyolojik araştırmalarda yararlı olmuştur ve olmaya devam edecektir. Biz kobay, sıçan ve insan DSM hücrelerinde TRPM4 kanal bloker 9-phenanthrol tarafından tüm hücre katyon akımlarının inhibisyonu ölçüde belirlemek için bu özel protokolü kullandık19,20,22.
Birlikte ele alındığında, insan idrar kesesi taze izole tek DSM hücreleri elde etmek için burada açıklanan yöntem yama-kelepçe tekniği, Ca2 +görüntüleme, immünositokimya, yerinde proksimal dava tahlil ve tek hücreli RT-PCR/qRT-PCR yanı sıra mikrodizi analizi, RNA-seq, ve CHIPQ-se-se-se-se-se-se-se-se-siq çeşitli yapılandırmaları kullanarak elektrofizyolojik araştırmalar için son derece uygun canlı hücreler sağlar. Amphotericin-B delikli yama-kelepçe yönteminin kullanımı diğer konfigürasyonlardan farklı olarak yerel hücre ortamını korur. Burada özetlenen özel koşullar kullanılarak, DSM hücrelerindeki K+ ve Ca2+ akımlarının katkılarını inkâr etmek üzere tasarlanan voltaj-adım indüklenen akımlar, biyofiziksel ve farmakolojik karakterizasyonlara uygun seçici olmayan katyon akımlarının özelliklerini gösterir.
Burada açıklanan prosedürler, enzimatik sindirim kullanarak tüm kalınlıkta insan üriner mesane örneklerinden canlı, taze izole DSM hücrelerinin hazırlanmasında ve amfisellerin-B delikli yama-kelepçe yaklaşımını kullanan TRPM4 kanal inhibitörü 9-phenanthrol’a duyarlı tüm hücreli katyon akımlarının kaydedilmesinde yer alan adımları açıklar. Enzimatik prosedür, burada sıralı papain-kollajenaz sindirim yöntemi olarak adlandırılan iki aşamalı ardışık maruziyete dayanır. DSM dokuları ilk olarak papain ve dithiothreitol ile tedavi edilir (bir enzim stabilizatör ajan) nominal Ca2 +-serbest durum altında, düşük Ca varlığında kollajenaz tip II tarafından ikinci adımda takip+. Düşük Ca2 + koşulları altında papain sindirim yürütmek için mantığı düz kas hücrelerinde 1980’lerin sonlarına kadar uzanır. Papain ile hazırlanan taze izole karotis arter düz kas hücreleri uzun bir şekil gösterdi, canlılık gösterdi (Trypan Mavi alımına direnç) ve kontraktil uyaranlara yanıt (yüksek Ca2 + ve histamin)65. Yıllar sonra, bu yöntem DSM hücrelerinin hazırlanmasında uygulandı (bkz. Tablo 1). Kollajenaz tip II seçimi yerine diğer türleri nispeten yüksek proteolitik aktivite ideal DSM dahil olmak üzere düz kas dokuları için uygundur ilgilidir. Gerçekten de, kollajenaz tedavisi tek başına kapsamlı enzim maruziyeti gerektiren tek DSM hücreleri verebilir (≥60 dk)53,54. Kollajenaz aktivitesi Ca2+ bağlıdır ve enzim Ca 2+-serbest koşullar altında inaktif olduğundan, DSM parçalarının optimum enzimatik sindirim Ca2 + 66varlığını gerektirir. Bizim durumumuzda, DS-C içerir 100-200 μM [Ca2+] (Tablo 2). Enzimomatik tedaviden sonra, sindirilmiş DSM parçaları dokulara bağlı herhangi bir enzimi çıkarmak için enzimveya Ca2+ olmadan soğuk DS ile birkaç kez hafifçe yıkanır. Buz gibi DS, DSM hücre bütünlüğünün korunmasına ve kalan papain veya kollajenazın enzimatik aktivitesini sınırlamaya yardımcı olur. Son adımda, enzimle tedavi edilmiş DSM parçalarının yangın cilalı Pasteur pipeti ile tritürasyonu tek bir DSM hücresi salgılar. DSM hücreleri ya hemen yama-kıskaç çalışmaları veya diğer deney türleri için bir kayıt odasına yerleştirilir ya da aynı gün daha sonra kullanılmak üzere DS’de buz üzerinde depolanır (genellikle 8 saat içinde hazırlık, ancak hücreler 24 saate kadar canlı kalır).
Tek DSM hücrelerini başarıyla elde etmek için birçok önemli husus belirledik. Bunlardan ilki insan DSM numune kaynağı kalitesiile ilgilidir. Doku bütünlüğünü en iyi şekilde korumak için açık mesane ameliyatlarından elde edilen DSM örnekleri en kısa sürede buz gibi DS’ye yerleştirilir ve soğuk bir ortamda muhafaza edilir. Özellikle, hastadan cerrahi çıkarma üzerine, mesane örneği hemen ameliyathanede tam olarak hazırlanmış bir yan masaya yerleştirilir. Tüm numunenin brüt muayenesi (genellikle radikal veya basit sistektomi sırasında elde edilir) ve açılış ını takip eder. Görsel incelemeden sonra, numunenin tümörle ilgisi olmayan uzak bir bölgesinden tam kalınlıkta idrar merdiveni numunesi çıkarılır ve hemen soğuk (~4 °C) Diseksiyon Solüsyonu (DS)(Tablo 2)içeren bir bardağa (50 veya 100 mL) yerleştirilir ve kapakla sıkıca kapatılır. Doku hasadının planlı niteliği nedeniyle, hasat yapan ameliyathane personeli ve yardımcı personel, doku çıkarma sırasında ameliyathanede bulunan malzemelerin bulunması için cerrahi vakanın başlangıcında alarma geçirilir. İşleme adımlarının rutin, tekrarlayan doğasıyla birlikte alınan bu önlemler, doku için sıcak iskemi süresini korur – çıkarmadan DS solüsyonu ile soğutulmuş kapta yerleştirilmesine kadar – 5 dakikadan daha az. Konteyner daha sonra soğuk ortamı korumak için bir buzdolabı veya buz üzerine bir soğutucu yerleştirilir ve laboratuvara (buz gibi) taşınır. Numune laboratuvara geldiğinde diseksiyon ve enzimatik dissosilasyon adımları başlar. Enzimatik dissosilasyon sonrasında belirli bir DSM örneğinin yüksek kaliteli DSM hücreleri verip veremeyeceğini tahmin etmek çok zordur, bu nedenle enzimatik dissosilasyon adımlarını devam edeceğiz. Birçok durumda, elektrofizyolojik deneylere paralel olarak grubumuz aynı DSM örneklerinden hazırlanan DSM şeritlerinde izometrik gerilim kayıtları yapmaktadır. İzometrik daralma çalışmaları (yayınlanmamış gözlemimiz) için uygun şeritler sağlayan preparatlardan genellikle yüksek kaliteli DSM hücreleri elde edebileceğimizi bulduk.
İkinci faktör farklı enzim çok variabilities ile ilgilidir. Hem papain hem de kollajenaz tip II için, bir tedarikçiden her yeni bir enzim geldiğinde, doku sindirimi için DS’deki enzim aktivitesinin farklılık gösterebileceğini gözlemledik. Biz, bu nedenle, rutin her yeni lot için enzim konsantrasyonu ve kuluçka aralıkları optimize. Lot değişkenliği katkısını en aza indirmek için, aynı lottan daha büyük miktarlarda sipariş ve enzimlerin 2 mL aliquots stok çözümleri büyük bir toplu yapmak ve kullanıma kadar ~-20 °C onları saklayın. Ancak zamanla dondurulmuş stoklar (2 haftaya kadar depolanır) enzimatik aktivitelerini kaybedebilir. Üçüncü değişken enzim sindirim tedavilerinin sıcaklığı ile ilgilidir. Hem papain hem de kollajenaz enzimatik aktivitelerısı sıcaklık bağımlılığını gösterir. Papain ve kollajenaz tip II normal vücut fizyolojisi67,68kapsayan sıcaklık aralıklarında aktivite sergilemek . Bu nedenle, DSM hücre bütünlüğünü korumak için daha yüksek sıcaklıklardan kaçınarak ~37 °C’de enzim tedavilerini sabit tutmayı hedefliyoruz. Dördüncü göz son derece uygun (mükemmel klasik düz kas özellikleri sergileyen) sağlıksız, aşırı sindirilmiş hücrelere kadar her hazırlık içinde mevcut DSM hücrelerinin kalitesinin değişkenliği ile ilgilidir. Uzun süreli enzim kuluçka aralığı hasarlı hücrelerin yüksek sayıda elde edilmesiiçin ana nedenlerinden biridir. Aşırı enzim tedavileri de iyon kanallarının protein yapılarını bozar, reseptörler, ve taşıyıcılar, olumsuz işlevselliğini etkileyen. Enzimatik olarak elde edilen, taze izole edilmiş hücrelerden elde edilen sonuçların yorumlanması bu hususu göz önünde bulundurmalıdır. Enzim sindirim koşullarının optimizasyonu son derece canlı hücrelerin yüzdesini artırmayı amaçlamaktadır. Mikrodizi analizleri gibi daha fazla sayıda canlı hücreye dayanan deneysel yaklaşımlar, tek hücreli yama-kıskaç elektrofizyolojisi veya Ca2+ görüntüleme gibi daha az hücrede başarıyla gerçekleştirilenlerden daha sağlam optimizasyonlar gerektirir. Yukarıda belirtilen faktörlerin göz önünde bulundurulması, yüksek kaliteli tek DSM hücreleri elde edilmesinde son on yılda araştırma çabalarımıza yol açmıştır.
Delikli yama-kelepçe tekniği çeyrek yüzyılı aşkın bir süredir elektrofizyolojik bir yaklaşımdır. Çeşitli yayınlar teknik hususların ayrıntılarını sağlar69,70,71,72,73. Hücre perforasyonu amphotericin-B, nystatin, gramicidin veya β-escin ile elde edilebilir (bkz.32her birine genel bakış için). Delikli yama-kelepçe kayıtlarının diğer elektrofizyolojik yaklaşımlara göre en büyük avantajı, hücre içi hücre içi ortamın – hücre içi Ca dahil2+ve sinyal molekülleri (örneğin, cAMP, PKA, fosfatlar ve fosfodiesterazlar) – korunur. Bu teknik, bu nedenle, ideal yakın fizyolojik koşullar altında tüm hücreli iyon kanal akımları ve düzenleyici mekanizmaları araştırmak için uygundur. Önemli bir uyarı hücre içi bileşiminin konvansiyonel bütün hücre ve tek kanallı ekscised-patch (iç ve dış-dış) kayıtlar gibi diğer elektrofizyolojik yöntemlerden farklı olarak tam olarak kontrol edilemeyeceğidir. Deneyimlerimize göre, üç faktör rutin olarak amphotericin-B-delikli yama-kelepçe deneylerinin başarılı deneysel sonuçlarına katkıda bulunur. Bunlardan ilki, bir kaydı denemek için seçilen DSM hücresinin kalitesidir. DSM hücreleri, hücre yüzeyinin etrafında iyi tanımlanmış bir hale ile yarı kontraktil (serpantin benzeri), yüksek kontrastlı parlak bir görünüm sergileyen ve kayıt odasının cam dibine sıkıca iliştirilebilen yüksek kontrastlı parlak bir görünüm sergilediklerinde giga-mühür oluşumu ve hücre perforasyonu nispeten kolay gerçekleşir. Başarı için ikinci ve üçüncü faktörler, sırasıyla, kaynak kalitesi ve amphotericin-B solubilization (dimetil sülfoksit / DMSO ve hücre içi pipet çözeltisi) ile ilgilidir. Kaynak ve lot çeşitleri açısından farklı tedarikçiler arasında tutarsızlıklar gözlemledik. Her gün tozdan amphotericin-B stok çözeltisi ve ardından hücre içi pipet çözeltisinde seyreltme yeni bir çözüm hazırlıyoruz. Bu adımlar geniş sonication ve girdap gerektirir. Taze yapılmış amphotericin-B içeren pipet çözeltisi ile başarılı hücre perforasyonu (+Ca2+ve insan, kobay, fare ve/veya sıçan DSM hücrelerinden seçici olmayan katyon akımları17,21,22,23,29,30,31,35,60. Burada, insan DSM hücrelerinde seçici olmayan katyon akımlarının kaydedilmesi için koşulları açıklıyoruz. 9-Phenanthrol, TRPM4 kanallarının bir engelleyici, dsm uyarılabilirlik kontrolünde bu kanalların rolünü destekleyen gerilim adım indüklenen akımlar zayıflatılmış. Bir not olarak, genellikle en az 45 dakika bir giga-mühür elde ettikten sonra ve optimum kararlı voltaj adım non-selektif katyon akımları indüklenen kayıt perforasyon başlatılması gerektirir. Voltaj rampaları voltaj-adım protokollerine alternatif olarak da kullanılabilir30,64. Burada, eski yaklaşım voltaj bağımlı inaktivasyon etkisini en aza indirir ve bir süre boyunca uyarılmış akımın ortalama sağlar, çünkü bir hiperpolarize tutma membran potansiyelinden bir voltaj-adım protokolü bir rampa protokolü yerine tercih edildi rampa nın gerilim başına tek bir veri noktası sağladığı bir gerilim-adım. İkinci nokta özellikle insan DSM hücreleri için geçerlidir, zira akımlar gerilim adımları sırasında değişken aktivite gösterirler (Şekil 5VeŞekil 6). Amphotericin-B delikli yama-kelepçe tekniği DSM hücrelerinin ve diğer hücre türlerinin özelliklerini belirlemede gerekli olmuştur ve gelecekte yeni keşifler sağlamada yardımcı olmaya devam edecektir. Ayrıca, taze izole tek DSM hücreleri başarıyla tüm hücreli K ölçmek için kullanılabilir+Cl–ve Ca2+yama-kelepçe tekniğinin konvansiyonel moduna sahip akımlar, mevcut kelepçe ile membran potansiyel kaydı ve önceki raporlarımıztarafından örneklenen tek kanallı kayıtlar23,29,35,64.
Tek hücreli yama-kıskaç yöntemlerine ek olarak, taze izole DSM hücreleri Ca2 + görüntüleme, RT-PCR/q-RT-PCR, immünositokimya, yerinde yakınlık ligasyon testleri ve genomik yaklaşımlar (örneğin, mikrodizim, RNA-seq, CHIP-seq)15,18,30,33,34dahil olmak üzere diğer teknik yaklaşımlar ile incelenebilir . Tek hücreli transkripsiyon belirleme yöntemleri gelişmeye ve son derece hassas olmaya devam ettikçe, bireysel DSM hücrelerinin elektriksel veya farmakolojik özelliklerini transkripsiyon/proteom profilleriile rutin ve özel olarak birbirine bağlama yı öngörüyoruz. Bu, önce bir DSM hücresinden kaydedilmesi ve ardından mRNA veya protein alınması ve ardından transkripsiyonel/proteomik analizler ile elde edilecektir. Bu tür yöntemler zaten DSM olmayan hücrelerde test edilmiş olmasına rağmen, şu anda teknik olarak zorlu, rutin olarak kabul edilecek duyarlılık eksikliği, ve birkaç seçilmiş gen ürünleri başarılı tespiti ile sınırlıdır74. Kontrol ve hastalıklı hasta donörlerinden elde edilen idrar kesesi hücrelerinde yapılan fonksiyon-moleküler profil ekspresyonu, normal DSM fonksiyonlarını, patogenezi ve etkili yeni tedavi yaklaşımlarını belirlemek için gerekli fizyolojik süreçlere dair öngörüler sağlayacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIH-R01DK106964 ve P20DK123971 tarafından Georgi V. Petkov’a hibeler ile desteklenmiştir. Yazarlar makalenin eleştirel değerlendirmesi için Dr Viktor Yarotskyy ve Bayan Sarah Maxwell teşekkür ederiz. Biz de MUSC ve UTHSC üroloji personeli cerrahlar için müteşekkiriz: Dr Thomas Keane, Harry Clarke, Stephen Savage, Ross Rames, Sandip Prasad, Jonathan Picard, Christopher Ledbetter ve Anthony Patterson yanı sıra MUSC ve UTHSC Üroloji sakinleri: Dr Taylor Taylor Vaughan, Samuel Walker Nickles, Matthew Young, Erin Burns, Justin Ellett, Ryan Levey, Austin Younger, Mark Currin, Nima Baradaran, Olugbemisola McCoy, Tracy Tipton, Bryce Wyatt, Alyssa Greiman, Sarah Starosta, Aaron Bloch, Christine Callaway, Lucille Cox, Christian Dewan, Erin Heitman, Bradley Houston, Stephen Legg, Robert S. Libby, Cole Locklear, Kristen Marley, Monica O’Hanlon, Patrick Probst, Cynthia Sharadin, Elizabeth Tourville, Daniel Zapata insan doku toplama ile yardım için.
5 ml polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps |
9-Phenanthrol | Sigma-Aldrich | 211281 | TRPM4 channel inhibitor |
Amphotericin-B | Fisher | BP928-250 | Used for patch/cell perforation |
Amphotericin-B | European Pharmacopoeia Reference Standards | 5 | Used for patch/cell perforation |
Amphotericin-B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | Used for patch/cell perforation |
Analog vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9006 | Intracellular pipette solution |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | DS |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | Extracellular solution and DS |
Capillary Glass | Sutter | BF150-110-7.5 | Capillary for preparation of pulled patch electrodes |
Cesium hydroxide hydrate | Sigma-Aldrich | C8518 | Intracellular pipette solution |
Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs | Axon Instruments/ Molecular Devices | pCLAMP-10 | Commerical software and part of patch-clamp rig setup |
Collagenase type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | DS-C |
CsCl | Sigma-Aldrich | 203025 | Extracellular and intracellular solutions |
Dental wax | Miltex Dental Wax Technologies, Inc. | 18058351 | |
Digital Thermometer with Probe | Fisher Scientific | 15-077-32 | Placed in tissue bath to monitor temperature |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Solvent |
DL-Dithiothreitol (DDT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Reducing agents used together with Papain |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | P-97 | Required to pull electrodes with very fine tips |
Floating foam tube rack/holder | VWR Scientific | 82017-634 | Used for holding tubes with enzymes for temperature control |
Glucose | Sigma | G8270 | |
Glutamic acid (Na salt) | Sigma-Aldrich | G1626 | DS |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | pH Buffer |
KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | Extracellular solution |
Low Noise Data Acquisition System | Axon Instruments/ Molecular Devices | Digidata 1440A | Part of patch-clamp rig setup |
Magnetic stirrer | VWR | 01-442-684 | |
MgCl2 (hexahydrate) | Sigma-Aldrich | M2670 | Extracellular and intracellular solutions |
MicroForge | Narishige | MF-830 | Used for fire-polishing electrodes |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Extracellular and intracellular solutions |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Nifedipine | Sigma-Aldrich | N7634 | L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker |
Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives | Nikon | Discontinued | Part of Patch-clamp rig setup |
Non-metalic syringe needle, MicroFil | WPI | MF-34G-5 | Filling of intracellular pipette solution |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | DS-P |
Pasteur pipette | FisherBrand | 13-678-20A | Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces |
Patch-clamp amplifier | Axon Instruments/ Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | Part of patch-clamp rig setup |
PC computer | DELL | Custom configuration | Part of patch-clamp rig setup |
pH Meter | Aspera Instruments | PH700 | |
Polyethylene tubing | Intramedic | 427-436 | Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber |
Tetraethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | T2265 | Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution |
Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870) | Thermo Scientific | Discontinued | Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup |
Tissue bath, 100 mL | Radnoti | 1583-101 | Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps |
Vinyl tubing | ColePalmer | 06405-3 | Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath |
Water circulator bath, Haake D1 L | Haake | Discontinued | Connected to tissue bath |
Weighting scale | Mettler Toledo | XS64 | |
ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives | Carl-Zeiss | Discontinued | Part of patch-clamp rig setup |