Vi beskriver en metode for fremstilling av enkelt nyisolert detrusor glatte muskelceller fra menneskelige urinblæreprøver som bruker en to-trinns enzymatisk prosedyre. De oppnådde levedyktige DSM-cellene kan studeres av ulike enkeltcelleteknikker, inkludert den beskrevne amfotericin-B patch-clamp elektrofysiologi for å avsløre fysiologiske og farmakologiske egenskaper.
Detrusor glatte muskelceller (DSM) som finnes i urinblæreveggen, letter til slutt urinlagring og annullering. Utarbeidelse av levedyktige, friske og isolerte DSM-celler presenterer en viktig teknisk utfordring hvis prestasjon gir optimale celler for påfølgende funksjonelle og molekylære studier. Metoden utviklet og utarbeidet heri, vellykket brukt av vår gruppe i over et tiår, beskriver disseksjon av menneskelige urinblæreprøver hentet fra åpne blæreoperasjoner etterfulgt av en enzymatisk to-trinns behandling av DSM-stykker og mekanisk triturasjon for å oppnå nyisolerte DSM-celler. Det første trinnet innebærer disseksjon for å skille DSM-laget (også kjent som muscularis propria) fra slimhinnen (urothelium, lamina propria og muscularis mucosa) og tilstøtende binde, vaskulære og fettvev til stede. DSM kuttes deretter i biter (2-3 mm x 4-6 mm) i nominell Ca2+-holdig disseksjon/fordøyelsesløsning (DS). DSM stykker overføres neste til og sekvensielt behandlet separat med DS som inneholder papain og kollagenase ved ~ 37 ° C i 30-45 min per trinn. Etter vask med DS som inneholder enzymfritt storfeserum og tredning med en brannpolert pipette, frigjør bitene enkelt DSM-celler. Nyisolerte DSM-celler er ideelt egnet for elektrofysiologiske og farmakologiske karakteriseringer av ionekanaler. Spesielt viser vi at TRPM4 kanalblokkering 9-feentropi reduserer spenningstrinn fremkalt kation strømmer registrert med amfotericin-B perforert patch-klemme tilnærming. DSM-celler kan også studeres av andre teknikker som encellet RT-PCR, mikroarrayanalyse, immuncytokjemi, in situ nærhetsanalyse og Ca2 + bildebehandling. Den største fordelen med å utnytte enkelt DSM-celler er at observasjonene som er gjort, er direkte relatert til enkeltcelleegenskaper avslørt. Studier av nyisolerte humane DSM-celler har gitt viktig innsikt som karakteriserer egenskapene til ulike ionekanaler, inkludert kation-permeable i urinblæren og vil fortsette som en gullstandard i å belyse DSM cellulære egenskaper og regulatoriske mekanismer.
Detrusor glatte muskelceller (DSM) utgjør den mest tallrike celletypen i urinblæren og til slutt kontrollere urinlagring og annullere gjennom avslapning og sammentrekning, henholdsvis. DSM-celler danner glatte muskelbunter som henger sammen med tilstøtende bindevev, nerveprosesser, interstitielle celler og andre celletyper1. Den nåværende forståelsen av rollen som DSM-celler i urinblærefunksjonen er oppnådd gjennom en multi-level integrert tilnærming. Hver eksperimentell metode – enten basert på isolerte enkeltceller in vitro, vevstrimler som inneholder glatte muskelbunter in vitro/ ex vivo, eller in vivo bestemmelser (som cytometri og annullering funksjonsvurderinger) – gir viktig og spesifikk innsikt i fysiologiske og farmakologiske egenskaper av DSM (se vurderinger1,2,3,4,5,6 for detaljer). Tolkning av resultater hentet fra isolerte enkeltceller gjør det imidlertid mulig å tilskrive konklusjoner spesifikt til skrevet av selve enkeltcelletypen. Denne erkjennelsen har vært drivkraften for å etablere en pålitelig og reproduserbar metode for å skaffe nyisolerte DSM-celler fra hele tykkelsen urinblæreprøver. I motsetning til mange andre celletyper, glatt muskelceller kan ikke være pålitelig kultivert på grunn av tap av deres innfødte fenotype inkludert spesifikke endringer i deres elektrofysiologiske og kontraktile egenskaper7,8. Dette faktum forsterker ytterligere betydningen av studier utført på fysiologisk aktive nyisolerte DSM-celler.
På slutten av 1980-tallet og tidlig på 1990-tallet publiserte Isenbergs gruppe (Tyskland) en rekke elektrofysiologiske studier på nyisolerte DSM-celler hentet fra marsvinurinblære9,10,11,12,13 ( Tabell1). Metoden fremhevet to viktige observasjoner som hjalp til med å skaffe vitale celler og fungerte som en innledende retningslinje for andre å følge. De var 1) pre-behandling isolerte DSM stykker med Ca2 +-fri løsning / medium før enzymatisk behandling og 2) vev fordøyelse med en løsning som inneholder kollagen. Disse to kritiske trinnene er innlemmet i alle de påfølgende variantene av DSM-celledissosiasjonsprosedyrer (tabell 1). For tiden benytter vår gruppe en to-trinns sekvensiell papain-collagenase dissosiasjon tilnærming. DSM-stykker behandles først med en enzymløsning som inneholder papain og deretter med kollagentype II solubilisert i samme løsning (DS, disseksjons-/fordøyelsesløsning). Denne tilnærmingen gir enkelt DSM-celler fra ulike arter, inkludert marsvin, gris, rotte, mus og viktigst menneskelig (Tabell 1).
Enkelt DSM-celler gir en kilde til multippel molekylærbiologi og fysiologiske eksperimenter. Så langt har protein- og mRNA-uttrykk studert med immuncytokjemi, eller RT-PCR/qRT-PCR-bestemmelser viste høye nivåer av deteksjon for ulike ionkanaler, inkludert den store ledningsspenningen- og Ca2+-aktivert (BK), liten ledning Ca2 +-aktivert K+ type 3 (SK3), spenningsgated K+ (Kv),L-type spenningsgated Ca2 + (Cav),og forbigående reseptor potensielle melastatin type 4 (TRPM4) kanaler, samt en Na / Ca2 + veksler 14,15,16,17,18,19,20,21,22. De er alle antatt å kontrollere DSM spenning, intracellulær Ca2 + nivåer og kontraktilitet. Patch-clamp elektrofysiologiske tilnærminger, utført direkte på marsvin, mus, rotte, eller humant DSM celler, gitt direkte demonstrasjon av biofysiske og farmakologiske egenskaper av L-type Cav, Kv (Kv2.x. Kv7), SK, BK, og TRPM4 kanaler17,19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31. Tilnærmingene inkluderte en konvensjonell spenningsklemme i hele cellen, en perforert spenningsklemme og enkeltkanalsopptak (cellefestet, innvendig og utvendig e-konfigurasjoner). I tillegg ga membranpotensiell registrering av DSM ved hjelp av en strømklemme bevis på at målrettede farmakologiske midler endrer cellespenning. For eksempel, TRPM4 hemmeren 9-fenanthrol indusert hyperpolarisering i DSM celler hentet fra mennesker, marsvin, og rotte urinblærer19,20,22,31. Blant de ulike elektrofysiologiske metodene gir amfotericin-B (og nystatin, gramicidin og β-escin) perforerte patch-clamp-opptak en viktig fordel ved å bevare iboende intracellulære signalmolekyler og veier. Bare lav molekylærvekt og i mindre grad, Cl– – men ikke proteiner eller signalmolekyler inkludert Ca2 + – er gjennomtrengeliggjennom plasmamembranporene dannet av amfotericin-B eller nystatin32. Det vellykkede resultatet av perforerte patch-clamp eksperimenter avhenger av flere generelle variabler som er unike for denne teknikken. Her beskriver vi detaljene i prosedyren ved hjelp av amfotericin-B som vår gruppe har brukt med hell gjennom årene15,22,33,34,35,36,37,38,39.
Uten tvil forblir ikke-selektive kationkanaler en av de minst forståtte kanaltypene i DSM-celler. Den første rapporten om en ikke-selektiv kationlignende kanal dateres tilbake til 1993. Papiret av Wellner og Isenberg11 beskrev en 33 pS stretch-aktivert enkeltkanal som viser følgende rangeringsrekkefølge av ion permeabilitet: K+>Na+>Cs+>>>Ba2+>Ca2+, og hemming av kanalaktivitet av Gd3 +, en generell hemmer av ikke-selektive kationkanaler. Nesten et tiår senere beskrev Thorneloe og Nelson40 Na+ gjennomtrengelige kationstrømmer i mus DSM-celler, hemmet av Gd3+, ved hjelp av helcelleopptak. Siden molekylære identiteter av ikke-selektive kationkanaler og deres biofysiske karakteriseringer gjenstår å bli bestemt, er fremtidige undersøkelser i dette forskningsområdet berettiget. Protokollen som er beskrevet her for opptak av ikke-selektive kasjonskanalstrømmer – ved hjelp av ekstracellulære og pipette intracellulære løsninger som inneholder Cs+, TEA+og nifedipine (Tabell 2) som fysiologisk og farmakologisk redusere Kv og Cav strømmer – har vært og vil fortsette å være nyttig i elektrofysiologiske undersøkelser av ikke-selektive kationkanaler. Vi har benyttet denne spesifikke protokollen for å bestemme omfanget av hemming av hele celle kationstrømmer av TRPM4 kanalblocker 9-fenantrop i marsvin, rotte og menneskelige DSM celler19,20,22.
Samlet sett gir metoden som er beskrevet her for å skaffe nyisolerte enkelt DSM-celler fra human urinblære levedyktige celler som er svært egnet for elektrofysiologiske undersøkelser ved hjelp av ulike konfigurasjoner av patch-clamp-teknikken, Ca2 +-imaging, immunocytochemistry, in situ proximal litigation assay, og single cell RT-PCR/qRT-PCR samt avanserte molekylærbiologiteknikker, inkludert mikroarrayanalyse, RNA-seq og CHIP-seq. Bruken av amfotericin-B perforert patch-clamp metoden bevarer det opprinnelige cellemiljøet i motsetning til andre konfigurasjoner. Når utført ved hjelp av de spesifikke forholdene som er skissert her, designet for å bidrag av K+ og Ca2 + strømmer i DSM-celler, viser spenningstrinn induserte strømmer egenskapene til ikke-selektive kationstrømmer egnet for biofysiske og farmakologiske karakteriseringer.
Prosedyrene som er beskrevet her forklarer trinnene som er involvert i utarbeidelsen av levedyktige, nyisolerte DSM-celler fra hele tykkelsen menneskelige urinblæreprøver ved hjelp av enzymatisk fordøyelse og i registrering av helcellekationstrømmer som er følsomme for TRPM4-kanalhemmeren 9-fenantrol som bruker amfotericin-B perforert patch-clamp tilnærming. Den enzymatiske prosedyren er avhengig av en to-trinns sekvensiell eksponering referert til heri som sekvensiell papain-kollagen-kollagennase fordøyelsesmetode. DSM vev behandles først med papain og dithiothreitol (et enzymstabiliserende middel) under en nominell Ca2 +-fri tilstand, etterfulgt i andre trinn av kollagenavtype II i nærvær av lav Ca2 +. Begrunnelsen for å utføre papain fordøyelse under lave Ca2 + forhold i glatte muskelceller dateres tilbake til slutten av 1980-tallet. Nyisolert halspulsåren glatt muskelceller utarbeidet med papain viste en langstrakt form, viste levedyktighet (motstand mot Trypan Blue opptak) og svarte på kontraktile stimuli (høyere Ca2 + og histamin)65. År senere ble denne metoden brukt i utarbeidelsen av DSM-celler (se tabell 1). Valget av kollagenase type II i stedet for andre typer er knyttet til sin relativt høye proteolytiske aktivitet ideelt egnet for glatt muskelvev inkludert DSM. Faktisk kan kollagenbehandling alene gi enkelt DSM-celler som krever omfattende enzymeksponering (≥60 min)53,54. Siden kollagenslikaktivitet avhenger av Ca2+ og enzymet er inaktivt under Ca2 +-frie forhold, krever optimal enzymatisk fordøyelse av DSM-stykker tilstedeværelsen av Ca2 + 66. I vårt tilfelle inneholder DS-C 100-200 μM [Ca2 +] (Tabell 2). Etter enzymatisk behandling vaskes fordøyd DSM-stykker forsiktig en rekke ganger med kald DS uten enzymer eller Ca2+ for å fjerne ethvert enzym som er bundet til vev. Den iskalde DS bidrar til å bevare DSM celle integritet og å begrense enzymatisk aktivitet av eventuelle gjenværende papain eller kollagen. I siste trinn frigjør tredning av enzymbehandlede DSM-stykker med en brannpolert Pasteur pipette enkelt DSM-celle. DSM-celler plasseres enten umiddelbart på et opptakskammer for patch-clamp studier eller andre typer eksperimentering eller lagret på is i DS for bruk senere på samme dag (vanligvis innen 8 timer etter forberedelse, men cellene forblir levedyktige i opptil 24 timer).
Vi identifiserte flere viktige hensyn for vellykket å skaffe enkelt DSM-celler. Den første gjelder den menneskelige DSM prøvekildekvalitet. For å optimalt bevare vevsintegritet, er DSM-prøver hentet fra åpne blæreoperasjoner plassert i iskalde DS så snart som mulig og opprettholdes i et kaldt miljø. Spesielt ved kirurgisk ekstraksjon fra pasienten, plasseres blæreprøven umiddelbart på et fullt forberedt sidebord i operasjonssalen. Grov undersøkelse av hele prøven (vanligvis oppnådd under radikal eller enkel cystektomi) og åpningen følger. Etter visuell inspeksjon fjernes et stykke hele tykkelse urinstigeprøve fra et avsidesliggende område av prøven grovt uinvolvert med svulst og umiddelbart plassert i en kopp (enten 50 eller 100 ml) som inneholder kald (~ 4 °C) disseksjonsløsning (DS) (tabell 2) og deretter tett lukket med lokk. På grunn av den planlagte karakteren av høsting av vevet, blir operasjonspersonalet og hjelpepersonalet som gjør høstingen varslet ved starten av det kirurgiske tilfellet for å ha materialene tilgjengelig i operasjonssalen på tidspunktet for vevsekstraksjon. Disse forholdsreglene sammen med den rutinemessige, repeterende karakteren av behandlingstrinnene holder den varme iskemitiden for vevet – fra ekstraksjon til plassering i den kjølte beholderen med DS-oppløsning – til mindre enn 5 min. Beholderen plasseres deretter i kjøleskap eller på is i en kjøler for å opprettholde det kalde miljøet og transporteres (iskald) til laboratoriet. Når prøven kommer til laboratoriet, starter disseksjon stoiogeringstrinn. Det er svært vanskelig å forutsi om en gitt DSM-prøve vil gi DSM-celler av høy kvalitet etter enzymatisk dissosiasjon, så vi fortsetter med de enzymatiske dissosiasjonstrinnene. I mange tilfeller, parallelt med elektrofysiologiske eksperimenter, utfører gruppen vår isometriske spenningsopptak på DSM-strimler utarbeidet fra de samme DSM-prøvene. Vi har funnet ut at vi vanligvis kan få dsmceller av høy kvalitet fra preparater som også med hell gir levedyktige strimler for isometriske sammentrekningsstudier (vår upubliserte observasjon).
Den andre faktoren er knyttet til ulike enzympartivariabilities. Vi observerte at for både papain og kollagen type II, hver gang en ny mengde enzym kommer fra en leverandør, kan enzymaktiviteten i DS for vevsfordøyelse variere. Vi optimaliserer derfor rutinemessig enzymkonsentrasjonen og inkubasjonsintervallene for hver nye tomt. For å minimere mye variasjon bidrag, bestiller vi større mengder av samme mye og lage en stor batch av lagerløsninger i 2 ml aliquots av enzymer og lagre dem på ~ -20 ° C til bruk. Over tid kan imidlertid frosne aksjer (lagret opptil 2 uker) miste sin enzymatiske aktivitet. Den tredje variabelen er knyttet til temperaturen på enzym fordøyelsebehandlinger. Enzymatiske aktiviteter av både papain og kollagenviser viser temperaturavhengighet. Papain og kollagenase type II viser aktivitet i temperaturområdene som omfatter normal kroppsfysiologi67,68. Derfor tar vi sikte på å opprettholde enzymbehandlingene stabile ved ~ 37 °C for å unngå høyere temperaturer for å bevare DSM celleintegritet. Den fjerde vurderingen gjelder variasjonen av kvaliteten på DSM-celler tilstede i hvert preparat som spenner fra svært levedyktige (viser gode klassiske glatte muskelegenskaper) til ikke-sunne, overfordøyde celler. Et langvarig enzyminkubasjonsintervall er en av hovedårsakene til å få et høyt antall skadede celler. Overdreven enzymbehandlinger svekker også proteinstrukturer av ionkanaler, reseptorer og transportører, som påvirker funksjonaliteten negativt. Tolkning av resultater hentet fra enzymatically innhentet, nyisolerte celler bør huske på denne vurderingen. Optimalisering av enzymfordøyelsesforhold tar sikte på å øke prosentandelen av svært levedyktige celler. Eksperimentelle tilnærminger som er avhengige av et høyere antall levedyktige celler som mikroarrayanalyser krever mer robuste optimaliseringer enn de som utføres på færre celler som encellede elektrofysiologi eller Ca2+ bildebehandling. Vurdering av de nevnte faktorene har veiledet vår forskningsinnsats det siste tiåret i å oppnå høy kvalitet enkelt DSM celler.
Den perforerte patch-clamp teknikken har vært en bærebjelke elektrofysiologisk tilnærming i over et kvart århundre. Flere publikasjoner gir detaljer om de tekniske hensyn69,70,71,72,73. Celleperforering kan oppnås med amfotericin-B, nystatin, gramicidin eller β-escin (se referanse32for oversikt over hver). Den største fordelen med perforerte patch-clamp opptak over andre elektrofysiologiske tilnærminger er at det opprinnelige intracellulære miljøet – inkludert intracellulær Ca2+ 2+og signalmolekyler (f.eks. cAMP, PKA, fosfater og fosfodiesteraser) – bevares. Denne teknikken er derfor ideelt egnet for å undersøke hele celle ion kanal strømmer og deres regulatoriske mekanismer under nær fysiologiske forhold. En viktig påminnelse er at intracellulær cellesammensetning ikke kan kontrolleres nøyaktig i motsetning til andre elektrofysiologiske metoder som konvensjonelle helecelle- og enkanals utskårne patcher (innvendig- og utadvendt) opptak. Etter vår erfaring bidrar tre faktorer rutinemessig til vellykkede eksperimentelle resultater av amfotericin-B-perforerte patch-clamp eksperimenter. Den første er kvaliteten på DSM-cellen som er valgt til å prøve et opptak. Når DSM-celler er svært levedyktige som viser en semi-kontraktile (serpentin-lignende), høy kontrast skinnende utseende med en veldefinert glorie rundt celleoverflaten og feste tett til glassbunnen av opptakskammeret deretter giga-tetning dannelse og celle perforering forekommer relativt enkelt. De andre og tredje faktorene for suksess, henholdsvis, er knyttet til kvalitet på kilde og løsering av amfotericin-B (i dimetylsulfoksid / DMSO og intracellulær pipetteløsning). Vi observerte avvik blant ulike leverandører når det gjelder kilde- og partivariasjoner. Hver dag forbereder vi en frisk løsning av amfotericin-B lagerløsning fra pulver etterfulgt av fortynningen i intracellulær pipetteløsning. Disse trinnene krever omfattende sonikering og virvlende. Med nylaget amfotericin-B-holdig pipetteløsning, vellykket celleperforering (+, Ca2+ 2+, og ikke-selektive kationstrømmer fra humane, marsvin, mus og/eller rotte-DSM-celler17,21,22,23,29,30,31,35,60. Her beskriver vi forhold for registrering av ikke-selektive kationstrømmer i humane DSM-celler. 9-Phenanthrol, en blokkering av TRPM4-kanaler, attenuated spenningstrinn indusertstrømmer som støtter rollen til disse kanalene i kontroll av DSM excitability. Som et notat krever det vanligvis minst 45 minutter etter å ha fått en giga-tetning og initiering av perforering for å registrere optimale stabile spenningstrinn indusert ikke-selektive kationstrømmer. Spenningsramper kan også brukes som et alternativ til spenningstrinnprotokoller30,64. Her ble en spenningstrinnprotokoll fra et hyperpolarisert holdingmembranpotensial foretrukket i stedet for en rampeprotokoll siden den tidligere tilnærmingen minimerer effekten av spenningsavhengig inaktivering og gir mulighet for å utnytte fremkalt strøm over en varighet av et spenningstrinn der rampen gir et enkelt datapunkt per spenning. Det siste punktet gjelder spesielt for humane DSM-celler, da strømmene viser variabel aktivitet under spenningstrinn (Figur 5OgFigur 6). Den amhotericin-B perforert patch-clamp teknikken har vært avgjørende for å identifisere egenskapene til DSM celler og andre celletyper, og vil fortsette å hjelpe i å gi nye funn i fremtiden. Videre kan nyisolerte enkelt DSM-celler brukes til å måle hele celle K+Cl–og Ca2+ 2+strømmer med den konvensjonelle modusen for patch-clamp-teknikken, membranpotensiell opptak med gjeldende klemme og enkeltkanalopptak som eksemplifisert av våre tidligere rapporter23,29,35,64.
I tillegg til enkeltcellepatch-clamp metoder, kan nyisolerte DSM-celler studeres med andre tekniske tilnærminger, inkludert Ca2 + bildebehandling, RT-PCR / q-RT-PCR, immuncytokjemi, i situ nærhet ligation analyse, og genomiske tilnærminger (f.eks mikroarray, RNA-seq, CHIP-seq)15,18,30,33,34. Etter hvert som enkeltcelletranskripsjonsmetoder fortsetter å utvikle seg og blir svært følsomme, ser vi for oss i en fremtidig evne til rutinemessig og spesifikt å knytte elektriske eller farmakologiske egenskaper til individuelle DSM-celler med sine transkripsjons-/proteomeprofiler. Dette vil oppnås ved første opptak fra en DSM-celle og deretter trekke ut mRNA eller protein etterfulgt av transkripsjonomiske / proteomiske analyser. Selv om slike metoder allerede er testet i ikke-DSM-celler, er de i dag teknisk utfordrende, mangler følsomhet for å bli vurdert rutine, og begrenset til vellykket påvisning av noen utvalgte genprodukter74. Funksjon-molekylær profil uttrykk linking studier når gjort på DSM celler hentet fra urinblærer avledet fra kontroll og syke pasient-donorer vil gi innsikt i fysiologiske prosesser avgjørende for å kjøre normale DSM funksjoner, patogenesen, og i å identifisere effektive nye terapeutiske tilnærminger.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH-R01DK106964 og P20DK123971 tilskudd til Georgi V. Petkov. Forfatterne takker Dr. Viktor Yarotskyy og Ms. Sarah Maxwell for kritisk evaluering av manuskriptet. Vi er også takknemlige til urologi ansatte kirurger ved MUSC og UTHSC: Drs. Thomas Keane, Harry Clarke, Stephen Savage, Ross Rames, Sandip Prasad, Jonathan Picard, Christopher Ledbetter, og Anthony Patterson samt MUSC og UTHSC Urology beboere: Drs. Taylor Vaughan, Samuel Walker Nickles, Matthew Young, Erin Burns, Justin Ellett, Ryan Levey, Austin Younger, Currin, Nima Baradaran, Olugbemisola McCoy, Tracy Tipton, Bryce Wyatt, Alyssa Greiman, Sarah Starosta, Aaron Bloch, Christine Callaway, Lucille Cox, Christian Dewan, Erin Heitman, Bradley Houston, Stephen Legg, Robert S. Libby, Cole Locklear, Kristen Marley, Monica O’Hanlon, Patrick Probst, Cynthia Sharadin, Elizabeth Tourville, Daniel Zapata for deres hjelp med menneskelig vevsamling.
5 ml polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps |
9-Phenanthrol | Sigma-Aldrich | 211281 | TRPM4 channel inhibitor |
Amphotericin-B | Fisher | BP928-250 | Used for patch/cell perforation |
Amphotericin-B | European Pharmacopoeia Reference Standards | 5 | Used for patch/cell perforation |
Amphotericin-B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | Used for patch/cell perforation |
Analog vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9006 | Intracellular pipette solution |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | DS |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | Extracellular solution and DS |
Capillary Glass | Sutter | BF150-110-7.5 | Capillary for preparation of pulled patch electrodes |
Cesium hydroxide hydrate | Sigma-Aldrich | C8518 | Intracellular pipette solution |
Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs | Axon Instruments/ Molecular Devices | pCLAMP-10 | Commerical software and part of patch-clamp rig setup |
Collagenase type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | DS-C |
CsCl | Sigma-Aldrich | 203025 | Extracellular and intracellular solutions |
Dental wax | Miltex Dental Wax Technologies, Inc. | 18058351 | |
Digital Thermometer with Probe | Fisher Scientific | 15-077-32 | Placed in tissue bath to monitor temperature |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Solvent |
DL-Dithiothreitol (DDT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Reducing agents used together with Papain |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | P-97 | Required to pull electrodes with very fine tips |
Floating foam tube rack/holder | VWR Scientific | 82017-634 | Used for holding tubes with enzymes for temperature control |
Glucose | Sigma | G8270 | |
Glutamic acid (Na salt) | Sigma-Aldrich | G1626 | DS |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | pH Buffer |
KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | Extracellular solution |
Low Noise Data Acquisition System | Axon Instruments/ Molecular Devices | Digidata 1440A | Part of patch-clamp rig setup |
Magnetic stirrer | VWR | 01-442-684 | |
MgCl2 (hexahydrate) | Sigma-Aldrich | M2670 | Extracellular and intracellular solutions |
MicroForge | Narishige | MF-830 | Used for fire-polishing electrodes |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Extracellular and intracellular solutions |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Nifedipine | Sigma-Aldrich | N7634 | L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker |
Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives | Nikon | Discontinued | Part of Patch-clamp rig setup |
Non-metalic syringe needle, MicroFil | WPI | MF-34G-5 | Filling of intracellular pipette solution |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | DS-P |
Pasteur pipette | FisherBrand | 13-678-20A | Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces |
Patch-clamp amplifier | Axon Instruments/ Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | Part of patch-clamp rig setup |
PC computer | DELL | Custom configuration | Part of patch-clamp rig setup |
pH Meter | Aspera Instruments | PH700 | |
Polyethylene tubing | Intramedic | 427-436 | Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber |
Tetraethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | T2265 | Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution |
Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870) | Thermo Scientific | Discontinued | Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup |
Tissue bath, 100 mL | Radnoti | 1583-101 | Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps |
Vinyl tubing | ColePalmer | 06405-3 | Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath |
Water circulator bath, Haake D1 L | Haake | Discontinued | Connected to tissue bath |
Weighting scale | Mettler Toledo | XS64 | |
ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives | Carl-Zeiss | Discontinued | Part of patch-clamp rig setup |