Vi beskriver en metode til fremstilling af enkelt friskisolerede detrusor glatte muskelceller fra humane urinblære prøver anvender en to-trins enzymatisk procedure. De opnåede levedygtige DSM-celler kan studeres ved forskellige enkeltcelleteknikker, herunder den beskrevne amphotericin-B patch-clamp elektrofysiologi for at afsløre fysiologiske og farmakologiske egenskaber.
Detrusor glat muskel (DSM) celler til stede i urinblære væggen i sidste ende lette urin opbevaring og annullering. Forberedelse af levedygtige, friske og isolerede DSM-celler udgør en vigtig teknisk udfordring, hvis præstation giver optimale celler til efterfølgende funktionelle og molekylære undersøgelser. Metoden udviklet og udarbejdet heri, med succes brugt af vores gruppe i over et årti, beskriver dissektion af humane urinblære prøver fremstillet af åbne blæreoperationer efterfulgt af en enzymatic to-trins behandling af DSM stykker og mekanisk trituration for at opnå frisk isolerede DSM celler. Det første skridt indebærer dissektion at adskille DSM lag (også kendt som muscularis propria) fra slimhinde (urothelium, lamina propria, og muscularis mucosa) og den tilstødende bindevæv, vaskulære, og fedtvæv til stede. DSM skæres derefter i stykker (2-3 mm x 4-6 mm) i nominel Ca2+-indeholdende dissektions-/fordøjelsesopløsning (DS). DSM stykker er næste overføres til og sekventialt behandlet separat med DS indeholder papain og kollagen nase på ~ 37 °C for 30-45 min pr trin. Efter vasker med DS indeholdende enzym-fri kvæg serum og trituration med en brand-poleret pipette, stykkerne frigive enkelt DSM celler. Friskisolerede DSM-celler er velegnede til patch-clamp elektrofysiologiske og farmakologiske karakteriseringer af ionkanaler. Konkret viser vi, at TRPM4 kanal blocker 9-phenanthrol reducerer spænding-trin fremkaldte kation strømme registreres med amphotericin-B perforeret patch-clamp tilgang. DSM celler kan også studeres ved andre teknikker såsom enkelt celle RT-PCR, microarray analyse, immuncytokemi, in situ nærhed ligation assay, og Ca2 + billeddannelse. Den største fordel ved at udnytte enkelte DSM-celler er, at de fremstillede observationer direkte vedrører enkeltcelleegenskaber, der afsløres. Undersøgelser af friskisolerede humane DSM-celler har givet vigtig indsigt, der karakteriserer egenskaberne ved forskellige ionkanaler, herunder kation-permeable i urinblæren og vil fortsætte som en guldstandard i at belyse DSM cellulære egenskaber og regulerende mekanismer.
Detrusor glatte muskel (DSM) celler udgør den mest rigelige celletype i urinblæren og i sidste ende kontrollere urin opbevaring og rlaging gennem afslapning og sammentrækning, henholdsvis. DSM celler danner glatte muskel bundter, der fletter med tilstødende bindevæv, nerveprocesser, interstitielle celler, og andre celletyper1. Den nuværende forståelse af DSM-cellernes rolle i urinblærefunktionen er opnået gennem en integreret tilgang på flere niveauer. Hver eksperimentel metode – enten baseret på isolerede enkeltceller in vitro, væv strimler indeholder glatte muskel bundter in vitro / ex vivo, eller in vivo bestemmelser (såsom cytometri og voiding funktion vurderinger) – giver vigtig og specifik indsigt i fysiologiske og farmakologiske egenskaber af DSM (se anmeldelser1,2,3,4,5,6 for detaljer). Fortolkningaf resultater fra isolerede enkelte celler gør det imidlertid muligt specifikt at henføre konklusioner til selve enkeltcelletypen. Denne erkendelse har været den drivende kraft til at etablere en pålidelig og reproducerbar metode til at opnå friskisolerede DSM-celler fra hele tykkelsen urinblære prøver. I modsætning til mange andre celletyper, kan glatte muskelceller ikke pålideligt dyrkes på grund af tabet af deres indfødte fænotype herunder specifikke ændringer i deres elektrofysiologiske og kontraktile egenskaber7,8. Dette faktum styrker yderligere betydningen af undersøgelser, der udføres på fysiologisk aktive friskisolerede DSM-celler.
I slutningen af 1980’erne og begyndelsen af 1990’erne offentliggjorde Isenbergs gruppe (Tyskland) en række elektrofysiologiske undersøgelser af friskisolerede DSM-celler fremstillet af marsvinurinblærer9,10,11,12,13 ( tabel1). Metoden fremhævede to vigtige observationer, der hjalp med at opnå vitale celler og tjente som en indledende retningslinje for andre at følge. De var 1) forbehandling isolerede DSM stykker med Ca2 +-fri opløsning / medium før enzymatisk behandling og 2) væv fordøjelse med en opløsning, der indeholder kollagen. Disse to kritiske trin er blevet indarbejdet i alle de efterfølgende varianter af DSM-celledissociationsprocedurer (tabel 1). I øjeblikket, vores gruppe beskæftiger en to-trins sekventiel papain-collagenase dissociation tilgang. DSM stykker behandles først med en enzymopløsning, der indeholder papain og derefter med kollagennase type II opløses i samme opløsning (DS, dissektion / fordøjelsesopløsning). Denne fremgangsmåde giver enkelt DSM-celler fra forskellige arter, herunder marsvin, svin, rotte, mus og vigtigst menneske (tabel 1).
Enkelt DSM celler giver en kilde til flere molekylærbiologi og fysiologiske eksperimenter. Indtil videre har protein- og mRNA-udtryk undersøgt med immuncytokemi, eller RT-PCR/qRT-PCR-bestemmelser afslørede høje detektionsniveauer for forskellige ionkanaler, herunder den store ledningsspændingsspænding- og Ca2+aktiveret (BK), lille ledningsføring Ca2+-aktiveret K+ type 3 (SK3) spændingsgated K+ (Kv),L-type spænding-gated Ca2 + (Cav),og forbigående receptor potentielle melastatin type 4 (TRPM4) kanaler, samt en Na / Ca2 + veksler 14,15,16,17,18,19,20,21,22. De er alle menes at kontrollere DSM ophidselse, intracellulære Ca2 + niveauer og kontraktilitet. Patch-clamp elektrofysiologiske tilgange, udført direkte på marsvin, mus, rotte, eller menneskelige DSM celler, forudsat direkte demonstration af biofysiske og farmakologiske egenskaber af L-type Cav, Kv (Kv2.x. Kv7), SK, BK, og TRPM4 kanaler17,19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31. Tilgangene omfattede en konventionel helecellespændingsklemme, perforeret spændingsklemme og enkeltkanalsoptagelser (cellevedlagte, inde- og udegående konfigurationer). Derudover, membran potentielle registrering af DSM ved hjælp af en strøm-klemme forudsat dokumentation for, at mål-engagerende farmakologiske midler ændre celle ophidselse. For eksempel induceret TRPM4-hæmmer 9-phenanthrol hyperpolarisering i DSM-celler fremstillet af mennesker, marsvin og rottevandblærer19,20,22,31. Blandt de forskellige elektrofysiologiske metoder giver amphotericin-B (og nystatin, gramicidin og β-escin) perforerede patch-clamp-optagelser en vigtig fordel ved at bevare iboende intracellulære signaleringmolekyler og veje. Kun lav molekylvægt kationer og i mindre grad, Cl– – men ikke proteiner eller signalering molekyler, herunder Ca2 + – er gennemtrængelige gennem plasmamembranen porer dannet af amphotericin-B eller nystatin32. Det vellykkede resultat af perforerede patch-clamp eksperimenter afhænger af flere generelle variabler unikke for denne teknik. Her beskriver vi detaljerne i den procedure, der udnytter amphotericin-B, som vores gruppe har brugt med succes gennem årene15,22,33,34,35,36,37,38,39.
Velsagtens, ikke-selektive kation kanaler forbliver en af de mindst forstået kanal typer i DSM celler. Den første rapport fra en ikke-selektiv kation-lignende kanal går tilbage til 1993. Papiret af Wellner og Isenberg11 beskrevet en 33 pS stretch-aktiveret enkelt kanal viser følgende rang rækkefølge af ion permeabilitet: K+> Na+>Cs+>>>Ba2+>Ca2+, og hæmning af kanalaktivitet af Gd3 +, en generel hæmmer af ikke-selektive kation kanaler. Næsten et årti senere, Thorneloe og Nelson40 beskrevet Na+ gennemtrængelige kation strømme i mus DSM celler, hæmmet af Gd3 +, ved hjælp af hele celle optagelser. Da molekylære identiteter af ikke-selektive kationkanaler og deres biofysiske karakteriseringer endnu ikke er fastlagt, er fremtidige undersøgelser på dette forskningsområde berettigede. Protokollen beskrevet heri for registrering af ikke-selektive kation kanal strømme – ved hjælp af ekstracellulære og pipette intracellulære opløsninger, der indeholder Cs+, TEA+, og nifedipin (Tabel 2), at fysiologisk og farmakologisk afbøde Kv og Cav strømme – har været og vil fortsat være nyttige i elektrofysiologiske undersøgelser af ikke-selektive kation kanaler. Vi har udnyttet denne specifikke protokol til at bestemme omfanget af hæmning af hele celle kation strømme af TRPM4 kanal blokker 9-phenanthrol i marsvin, rotte og menneskelige DSM celler19,20,22.
Samlet set den metode, der er beskrevet her for at opnå friskisolerede enkelt DSM celler fra human urinblære giver levedygtige celler særdeles velegnet til elektrofysiologiske undersøgelser ved hjælp af forskellige konfigurationer af patch-clamp teknik, Ca2 +-imaging, immuncytokemi, in situ proksimale retssager assay, og enkelt celle RT-PCR/qRT-PCR samt avancerede molekylærbiologi teknikker, herunder microarray analyse, RNA-seq, og CHIP-seq. Brugen af amphotericin-B perforeret patch-clamp metode bevarer den indfødte celle miljø i modsætning til andre konfigurationer. Når de udføres ved hjælp af de specifikke betingelser, der er skitseret her, designet til at ophæve bidrag af K+ og Ca2 + strømme i DSM celler, spænding-trin induceret strømme vise egenskaberne af ikke-selektive kation strømme egnet til biofysiske og farmakologiske karakteriseringer.
De procedurer, der er beskrevet her, forklarer de trin, der er involveret i forberedelsen af levedygtige, friskisolerede DSM-celler fra hele tykkelsen af humane urinblæreprøver ved hjælp af enzymatisk fordøjelse og i optagelsen af hele cellekationstrømme, der er følsomme over for TRPM4-kanalhæmmeren 9-phenanthrol, der anvender amphotericin-B perforeret patch-clamp-tilgang. Den enzymatiske procedure bygger på en to-trins sekventiel eksponering benævnt heri som sekventiel papain-kollagen fordøjelse metode. DSM væv behandles først med papain og dithiothreitol (et enzym stabiliserende middel) under en nominel Ca2 +-fri tilstand, efterfulgt i andet trin af kollagen type II i overværelse af lav Ca2 +. Begrundelsen for at udføre papain fordøjelse n under lave Ca2 + betingelser i glatte muskelceller daterer sig tilbage til slutningen af 1980’erne. Frisk isolerede halspulsåren glatte muskelceller udarbejdet med papain viste en aflang form, viste levedygtighed (modstand mod Trypan Blue optagelse) og reagerede på kontraktile stimuli (højere Ca2 + og histamin)65. År senere blev denne metode anvendt ved udarbejdelsen af DSM-celler (se tabel 1). Valget af kollagen type II snarere end andre typer vedrører sin relativt høje proteolytiske aktivitet ideel til glat muskelvæv, herunder DSM. Faktisk, kollagenbehandling alene kunne give enkelte DSM celler, omend kræver omfattende enzym eksponering (≥60 min)53,54. Da kollagenaktivitet afhænger af Ca2+, og enzymet er inaktivt under Ca2+-frie forhold, kræver optimal enzymatisk fordøjelse af DSM-stykker tilstedeværelsen af Ca2+ 66. I vores tilfælde indeholder DS-C 100-200 μM [Ca2+] (tabel 2). Efter enzymatisk behandling vaskes fordøjede DSM-stykker forsigtigt flere gange med kold DS uden enzymer eller Ca2+ for at fjerne ethvert enzym, der er bundet til væv. Den iskolde DS hjælper med at bevare DSM celle integritet og til at begrænse enzymatisk aktivitet af eventuelle resterende papain eller kollagen. I det sidste trin frigiver trituration af enzymbehandlede DSM-stykker med en brandpoleret Pasteur pipette enkelt DSM-celle. DSM-celler placeres enten straks på et optagekammer til patch-clamp undersøgelser eller andre typer af eksperimenter eller opbevares på is i DS til brug senere samme dag (typisk inden for 8 timers forberedelse, men cellerne forbliver levedygtige i op til 24 timer).
Vi identificerede flere vigtige overvejelser for at opnå enkelte DSM-celler. Den første vedrører den menneskelige DSM prøve kildekvalitet. For optimalt at bevare vævsintegritet, DSM prøver fremstillet af åbne blæreoperationer er placeret i iskold DS så hurtigt som muligt og vedligeholdes i et koldt miljø. Konkret, ved kirurgisk ekstraktion fra patienten, blæreprøven er straks placeret på et fuldt forberedt sidebord på operationsstuen. Grov undersøgelse af hele prøven (normalt opnået under radikal eller simpel cystektomi) og dens åbning følge. Efter visuel inspektion fjernes et stykke heltykkelsesurinstigeprøve fra et fjerntliggende område af prøven, der er groft uinvolveret med tumor, og straks anbringes i en kop (enten 50 eller 100 ml), der indeholder kold (~4 °C) Dissektionsopløsning (DS) (tabel 2) og derefter tæt lukket med låg. På grund af den planlagte karakter af høsten af vævet, operationsstuen personale og hjælpepersonale gør høsten er advaret i begyndelsen af det kirurgiske tilfælde for at få de materialer til rådighed i operationsstuen på tidspunktet for vævudvinding. Disse forholdsregler sammen med den rutinemæssige, gentagne karakter af forarbejdningstrinnene holder den varme iskæmi tid for vævet – fra ekstraktion til placering i den kølede beholder med DS-opløsning – til mindre end 5 min. Beholderen placeres derefter i køleskab eller på is i en køler for at opretholde det kolde miljø og transporteres (iskold) til laboratoriet. Når prøven ankommer til laboratoriet, begynder dissociationstrinnene. Det er meget vanskeligt at forudsige, om en given DSM-prøve vil give DSM-celler af høj kvalitet efter enzymatisk dissociation, så vi fortsætter med de enzymatiske dissociationstrin. I mange tilfælde, parallelt med elektrofysiologiske eksperimenter, vores gruppe udfører isometriske spænding optagelser på DSM strimler udarbejdet af de samme DSM prøver. Vi har konstateret, at vi normalt kan få høj kvalitet DSM celler fra præparater, der også med succes give levedygtige strimler til isometriske sammentrækning undersøgelser (vores ikke-offentliggjorte observation).
Den anden faktor vedrører forskellige enzympartivariabiliteter. Vi bemærkede, at for både papain og kollagen type II, hver gang en ny masse enzym ankommer fra en leverandør, enzymaktivitet i DS for væv fordøjelse kan variere. Vi optimerer derfor rutinemæssigt enzymkoncentrations- og inkubationsintervallerne for hvert nyt parti. For at minimere partiets variabilitetbidrag bestiller vi større mængder af samme parti og laver et stort parti af lageropløsninger i 2 ml-aliquots af enzymer og opbevarer dem ved ~-20 °C indtil brug. Over tid, dog frosne lagre (gemt op til 2 uger) kan miste deres enzymatiske aktivitet. Den tredje variabel vedrører temperaturen af enzymfordøjelsesbehandlinger. Enzymatiske aktiviteter af både papain og kollagen display temperatur-afhængighed. Papain og kollagen type II udviser aktivitet i temperaturområderne omfatter normal krop fysiologi67,68. Derfor sigter vi mod at opretholde enzymbehandlingerne stabile ved ~ 37 °C og undgå højere temperaturer for at bevare DSM-celleintegriteten. Den fjerde overvejelse vedrører variabiliteten af kvaliteten af DSM-celler, der findes inden for hvert præparat, lige fra meget levedygtige (udviser fremragende klassiske glatte muskelegenskaber) til ikke-sunde, overfordøjede celler. Et forlænget enzyminkubationsinterval er en af hovedårsagerne til at opnå et stort antal beskadigede celler. Overdreven enzymbehandlinger forringer også proteinstrukturerne i ionkanaler, receptorer og transportører, hvilket påvirker deres funktionalitet negativt. Fortolkning af resultater fra enzymatisk opnåede, friskisolerede celler bør tage dette hensyn. Optimering af enzymfordøjelsesforhold har til formål at øge procentdelen af meget levedygtige celler. Eksperimentelle tilgange, der bygger på et større antal levedygtige celler såsom mikroarrayanalyser, kræver mere robuste optimeringer end dem, der med succes udføres på færre celler såsom encellede patch-clamp elektrofysiologi eller Ca2+ billeddannelse. Overvejelser om ovennævnte faktorer har styret vores forskningsindsats i løbet af de sidste ti år med at opnå en enkelt DSM-celler af høj kvalitet.
Den perforerede patch-clamp teknik har været en grundpille elektrofysiologisk tilgang i over et kvart århundrede. Flere publikationer indeholder nærmere oplysninger om de tekniske overvejelser69,70,71,72,73. Celleperforering kan opnås med amphotericin-B, nystatin, gramicidin eller β-escin (se reference32for overblik over hver). Den største fordel ved perforerede patch-clamp optagelser over andre elektrofysiologiske tilgange er, at den indfødte intracellulære miljø – herunder intracellulære Ca2+og signalering molekyler (f.eks cAMP, PKA, fosfater, og fosfordiesterases) – er bevaret. Denne teknik er derfor velegnet til at undersøge hele celle ion kanal strømme og deres lovgivningsmæssige mekanismer under næsten fysiologiske forhold. En vigtig advarsel er, at intracellulære celle sammensætning ikke kan præcist kontrolleres i modsætning til andre elektrofysiologiske metoder såsom konventionelle hele celle og enkelt-kanal punktafgifter-patch (inde- og outside-out) optagelser. Det er vores erfaring, at tre faktorer rutinemæssigt bidrager til vellykkede eksperimentelle resultater af amphotericin-B-perforerede patch-clamp eksperimenter. Den første er kvaliteten af den DSM-celle, der er valgt til at forsøge en optagelse. Når DSM celler er meget levedygtige viser en semi-kontraktile (serpentin-lignende), høj kontrast skinnende udseende med en veldefineret glorie omkring celleoverfladen og fastgør tæt på glasbunden af optagekammeret derefter giga-forsegling dannelse og celle perforering forekommer relativt let. De anden og tredje faktorer for succes vedrører henholdsvis kildekvaliteten og opløseligheden af amphotericin-B (i dimethylsulfoxid/DMSO og intracellulær pipetteopløsning). Vi observerede uoverensstemmelser mellem forskellige leverandører med hensyn til kilde- og partiudsving. Hver dag udarbejder vi en frisk opløsning af amphotericin-B lageropløsning fra pulver efterfulgt af fortynding i intracellulær pipetteopløsning. Disse trin kræver omfattende sonikering og vortexing. Med frisklavet amphotericin-B-holdig pipetteopløsning, vellykket celleperforering (+Ca2+og ikke-selektive kationstrømme fra humane, marsvin, mus og/eller rotte-DSM-celler17,21,22,23,29,30,31,35,60. Her beskriver vi betingelserne for registrering af ikke-selektive kationstrømme i humane DSM-celler. 9-Phenanthrol, en blokker af TRPM4 kanaler, dæmpet spænding-trin induceret strømme støtte den rolle, som disse kanaler i kontrollen med DSM ophidselse. Som en note, det normalt kræver mindst 45 min efter at have opnået en giga-forsegling og indledning af perforering at registrere optimal stabil spænding-trin induceret ikke-selektivkation strømme. Spændingsramper kan også bruges som et alternativ til spændingstrinsprotokoller30,64. Her, en spænding-trin protokol fra en hyperpolariseret bedrift membran potentiale blev foretrukket snarere end en rampe protokol, da den tidligere tilgang minimerer effekten af spænding-afhængige inaktivering og giver mulighed for et gennemsnit af fremkaldte strøm over en varighed spændingstrin, hvor rampen giver et enkelt datapunkt pr. spænding. Sidstnævnte punkt gælder især for humane DSM-celler, da strømmene viser variabel aktivitet under spændingstrin (Figur 5OgFigur 6). Den amphotericin-B perforeret patch-clamp teknik har været afgørende for at identificere egenskaberne af DSM celler og andre celletyper og vil fortsætte med at aide i at give nye opdagelser i fremtiden. Desuden kan friskisolerede enkelt DSM-celler med succes anvendes til måling af hele celle K+Cl–, og Ca2+strømme med den konventionelle tilstand af patch-clamp teknik, membran potentieloptagelse med den nuværende klemme, og enkelt kanal optagelser som eksemplificeret ved vores tidligere rapporter23,29,35,64.
Ud over enkeltcellepatch-clamp metoder, friskisolerede DSM celler kan undersøges med andre tekniske tilgange, herunder Ca2 + billeddannelse, RT-PCR/q-RT-PCR, immuncytokemi, in situ nærhed ligation assay, og genomiske tilgange (f.eks microarray, RNA-seq, CHIP-seq)15,18,30,33,34. Som enkelt celle transskription ser bestemmelse metoder fortsætte med at udvikle sig og blive meget følsomme, vi forestiller os i en fremtidig evne til rutinemæssigt og specifikt at forbinde elektriske eller farmakologiske egenskaber af de enkelte DSM celler med deres transskription / proteome profiler. Dette opnås ved først optagelse fra en DSM-celle og derefter udvinde mRNA eller protein efterfulgt af transskripomiske/proteomiske analyser. Selv om sådanne metoder allerede er blevet testet i ikke-DSM-celler, er de i øjeblikket teknisk udfordrende, manglende følsomhed, der skal betragtes som rutine, og begrænset til vellykket påvisning af nogle få udvalgte genprodukter74. Funktionsmolekylær profiludtryk, der forbinder undersøgelser, når de udføres på DSM-celler fra urinblærer, der stammer fra kontrol- og syge patientdonorer, vil give indsigt i fysiologiske processer, der er afgørende for at køre normale DSM-funktioner, patogenese og identificere effektive nye terapeutiske tilgange.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH-R01DK106964 og P20DK123971 tilskud til Georgi V. Petkov. Forfatterne takker Dr. Viktor Yarotskyy og Ms Sarah Maxwell for kritisk evaluering af manuskriptet. Vi er også taknemmelige for urologi personale kirurger på MUSC og UTHSC: Drs. Thomas Keane, Harry Clarke, Stephen Savage, Ross Rames, Sandip Prasad, Jonathan Picard, Christopher Ledbetter, og Anthony Patterson samt MUSC og UTHSC Urology beboere: Drs. Taylor Vaughan, Samuel Walker Nickles, Matthew Young, Erin Burns, Justin Ellett, Ryan Levey, Austin Younger, Mark Currin, Nima Baradaran, Olugbemisola McCoy, Tracy Tipton, Bryce Wyatt, Alyssa Greiman, Sarah Starosta, Aaron Bloch, Christine Callaway, Lucille Cox, Christian Dewan, Erin Heitman, Bradley Houston, Stephen Legg, Robert S. Libby, Cole Locklear, Kristen Marley, Monica O’Hanlon, Patrick Probst, Cynthia Sharadin, Elizabeth Tourville, Daniel Zapata for deres hjælp med indsamling af humant væv.
5 ml polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps |
9-Phenanthrol | Sigma-Aldrich | 211281 | TRPM4 channel inhibitor |
Amphotericin-B | Fisher | BP928-250 | Used for patch/cell perforation |
Amphotericin-B | European Pharmacopoeia Reference Standards | 5 | Used for patch/cell perforation |
Amphotericin-B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | Used for patch/cell perforation |
Analog vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9006 | Intracellular pipette solution |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | DS |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | Extracellular solution and DS |
Capillary Glass | Sutter | BF150-110-7.5 | Capillary for preparation of pulled patch electrodes |
Cesium hydroxide hydrate | Sigma-Aldrich | C8518 | Intracellular pipette solution |
Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs | Axon Instruments/ Molecular Devices | pCLAMP-10 | Commerical software and part of patch-clamp rig setup |
Collagenase type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | DS-C |
CsCl | Sigma-Aldrich | 203025 | Extracellular and intracellular solutions |
Dental wax | Miltex Dental Wax Technologies, Inc. | 18058351 | |
Digital Thermometer with Probe | Fisher Scientific | 15-077-32 | Placed in tissue bath to monitor temperature |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Solvent |
DL-Dithiothreitol (DDT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Reducing agents used together with Papain |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | P-97 | Required to pull electrodes with very fine tips |
Floating foam tube rack/holder | VWR Scientific | 82017-634 | Used for holding tubes with enzymes for temperature control |
Glucose | Sigma | G8270 | |
Glutamic acid (Na salt) | Sigma-Aldrich | G1626 | DS |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | pH Buffer |
KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | Extracellular solution |
Low Noise Data Acquisition System | Axon Instruments/ Molecular Devices | Digidata 1440A | Part of patch-clamp rig setup |
Magnetic stirrer | VWR | 01-442-684 | |
MgCl2 (hexahydrate) | Sigma-Aldrich | M2670 | Extracellular and intracellular solutions |
MicroForge | Narishige | MF-830 | Used for fire-polishing electrodes |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Extracellular and intracellular solutions |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Nifedipine | Sigma-Aldrich | N7634 | L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker |
Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives | Nikon | Discontinued | Part of Patch-clamp rig setup |
Non-metalic syringe needle, MicroFil | WPI | MF-34G-5 | Filling of intracellular pipette solution |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | DS-P |
Pasteur pipette | FisherBrand | 13-678-20A | Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces |
Patch-clamp amplifier | Axon Instruments/ Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | Part of patch-clamp rig setup |
PC computer | DELL | Custom configuration | Part of patch-clamp rig setup |
pH Meter | Aspera Instruments | PH700 | |
Polyethylene tubing | Intramedic | 427-436 | Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber |
Tetraethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | T2265 | Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution |
Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870) | Thermo Scientific | Discontinued | Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup |
Tissue bath, 100 mL | Radnoti | 1583-101 | Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps |
Vinyl tubing | ColePalmer | 06405-3 | Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath |
Water circulator bath, Haake D1 L | Haake | Discontinued | Connected to tissue bath |
Weighting scale | Mettler Toledo | XS64 | |
ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives | Carl-Zeiss | Discontinued | Part of patch-clamp rig setup |