Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kinasehæmmer screening i selv monterede humane protein mikrosystemer

Published: October 23, 2019 doi: 10.3791/59886
Automatic Translation
1,2, 1
1Virginia G. Piper Center for Personalized Diagnostics, Biodesign Institute, Arizona State University, 2Department of Pediatrics, and Biochemistry/Molecular Biology, College of Medicine, Pennsylvania State University

Summary

Der fremlægges en detaljeret protokol for generering af selv monterede humane protein-mikrosystemer til screening af kinasehæmmere.

Abstract

Screeningen af kinasehæmmere er afgørende for bedre at forstå egenskaberne af et lægemiddel og for identifikationen af potentielt nye mål med kliniske konsekvenser. Flere metoder er blevet rapporteret til at udføre en sådan screening. Men hver har sine egne begrænsninger (f. eks. screening af kun ATP-analoger, begrænsning til brug af renset kinase domæner, betydelige omkostninger i forbindelse med testning af mere end et par kinaser ad gangen, og manglende fleksibilitet i screening protein kinaser med nye mutationer). Her, en ny protokol, der overvinder nogle af disse begrænsninger og kan anvendes til objektiv screening af kinasehæmmere er præsenteret. En styrke af denne metode er dens evne til at sammenligne aktiviteten af kinasehæmmere på tværs af flere proteiner, enten mellem forskellige kinaser eller forskellige varianter af samme kinase. Selv monterede protein-mikrosystemer, der genereres ved ekspression af proteinkinaser ved hjælp af et human-baseret in vitro-transskriptions-og oversættelsessystem (IVTT), er ansat. De proteiner, der vises på mikrosystemet, er aktive, hvilket gør det muligt at måle virkningerne af kinasehæmmere. Følgende procedure beskriver de protokol trin i detaljer, fra mikroarray generation og screening til dataanalyse.

Introduction

Protein kinaser er ansvarlige for fosforylering af deres mål og kan moduere komplekse molekylære veje, der styrer mange cellulære funktioner (dvs. celle spredning, differentiering, celledød og overlevelse). Deregulering af kinase aktivitet er forbundet med mere end 400 sygdomme, hvilket gør kinasehæmmere en af de vigtigste klasser af lægemidler til rådighed til behandling af flere sygdomme, herunder kræft, kardiovaskulære og neurologiske lidelser samt inflammatoriske og autoimmune sygdomme1,2,3.

Med fremkomsten af præcision medicin, identifikation af nye terapier, især kinasehæmmere, har stor appel farmaceutisk og klinisk. Flere tilgange kan anvendes til identifikation af mulige nye par kinase/kinasehæmmere, herunder de Novo design af kinasehæmmere og identifikation af nye mål for eksisterende FDA-godkendte lægemidler. Sidstnævnte er særligt attraktivt, da den tid og penge, der kræves for at gennemføre disse lægemidler i klinikker er drastisk reduceret på grund af tilgængeligheden af tidligere kliniske forsøg data. Et kanonisk eksempel på repurat af en kinasehæmmer er Imatinib, der oprindeligt er designet til behandling af kronisk myeloid leukæmi (CML) gennem hæmning af BCR-ABL, som også kan anvendes med succes til behandling af c-kit over-udtrykker gastrointestinale stromale tumorer (gists)4,5,6,7.

Screeningen af kinasehæmmere kan udføres i bindende assays eller enzymatiske analyser. Den første klasse af assays fokuserer på protein-Drug interaktioner og kan give oplysninger såsom ligering sted og affinitet. Da aktiviteten af kinase på tidspunktet for disse assays er ukendt, en række interaktioner kan gå glip eller falsk identificeret på grund af konformationelle ændringer i proteinet. På den anden side kræver enzymatiske analyser, at proteinkinaser er aktive og giver værdifulde oplysninger om inhibitorer virkning på enzymaktivitet, men denne type screening er generelt mere tidskrævende og dyrt. I øjeblikket er begge typer af assays kommercielt tilgængelige fra flere kilder. De udgør en pålidelig mulighed for screening af kinasehæmmere med nogle få begrænsninger, herunder: I) de fleste af metoderne omfatter testning af flere kinaser individuelt, hvilket kan gøre screeningen af et stort sæt af proteiner dyrt; II) det sæt af kinaser, der skal testes, er begrænset til en liste over forudvalgte, vildtype kinaser og flere velkendte muterede versioner af nogle kinaser, der hindrer afprøvning af mange nye muterede isoformer.

I denne sammenhæng er protein mikrosystemer en kraftfuld platform, der er i stand til at overvinde nogle af de begrænsninger, der er præsenteret af kommercielt tilgængelige teknikker. Det er egnet til at udføre enzymatiske-baserede assays i High-gennemløb screening ved hjælp af fuld-længde, aktive proteiner af enhver sekvens af interesse. Mikromatricer kan genereres af en selvstændig samlet tilgang som NAPPA (nukleinsyre programmerbare protein array), hvor proteiner udtrykkes lige i tide til assays, øge sandsynligheden for, at dem, der vises på array er faktisk aktive. De proteiner, der vises på NAPPA produceres ved hjælp af menneske afledte ribosomer og chaperone proteiner for at forbedre sandsynligheden for naturlig foldning og aktivitet.

Proteinerne er oprindeligt programmeret ved at udskrive cDNAs kodning for gener af interesse smeltet med en Capture tag, sammen med en Capture agent, på mikromatrixens overflade. Proteinerne produceres derefter på mikromatricer ved hjælp af et in vitro transkriptionsog oversættelses (IVTT) system, og de frisk udtrykte proteiner er immobiliseret på mikromatrixens overflade af opsamlings agenten. Udtrykte Nappa arrays kan bruges til studiet af de proteiner, der vises på arrayet i en objektiv, høj gennemløb måde8,9.

Tidligere viste det sig, at proteiner, der vises på NAPPA-matricer, er foldet korrekt for at interagere med kendte partnere10; Desuden blev deres enzymatiske aktivitet først udnyttet i 2018, hvor det blev påvist, at protein kinaser vist på microarray autophosphorylat11. Nappa-metodologien er til dato blevet anvendt til mange forskellige anvendelser, herunder biomarkør opdagelse12,13,14,15,16,17, protein-protein interaktioner10,18, substrat identifikation19, og Drug screening11. Dens fleksibilitet er en af platformens vigtigste egenskaber, der giver mulighed for tilpasning til hver applikation.

Her præsenteres en protokol til screening af tyrosinkinasehæmmere i selv monterede NAPPA-arrays. Platformen er optimeret til visning af aktive humane proteinkinaser og til analyse af proteinkinaseaktivitet med lav baggrund og højt dynamikområde. Blandt de ændringer, der er implementeret for at bruge NAPPA til screening af kinasehæmmere, omfatter: I) ændringer i Tryk Kemi, II) de-fosforylering af protein mikrosystemet før kinasehæmmer screeningen, og III) optimering af påvisning af fosforylerede proteiner på arrayet. Denne protokol er den første af sin art og giver unikke oplysninger om kinase-studiet i NAPPA-mikroarrays.

Protocol

1. fælles buffere og løsninger, der skal anvendes

  1. Forbered TB medium: fantastisk bouillon (24 g/L gær ekstrakt; 20 g/L tryptone; 4 mL/L glycerol; 0,017 M KH2po4; og 0,072 M K2HPO4). 0,017 M KH2po4 og 0,072 m K2HPO4 -opløsninger kan købes som en 10x fosfatbuffer (0,17 m KH2po4 og 0,72 m k2HPO4).
  2. Forbered LB medium: Luria-Bertani (5 g/L gær ekstrakt; 10 g/L tryptone; og 10 g/L NaCl). Justér pH-værdien til 7,0 med 5 M NaOH.
  3. Forbered 1x TBS: Tris-bufferet saltvand (TBS: 50 mM Tris-CL, pH = 7,5; 150 mM NaCl).
  4. Forbered 1x TBST: TBS suppleret med 0,1% Tween 20.

2. DNA-præparat

Bemærk: det DNA, der anvendes til NAPPA-matricer, skal være meget rent; Derfor anbefales kommercielle DNA mini-Preps ikke. I øjeblikket anvendes to protokoller for DNA-forberedelse: i hus High-gennemløb mini-prep (beskrevet her) eller kommerciel MIDI-eller Maxi-prep. Den gennemsnitlige gennemløb af den in-House mini-prep protokol er 1.500 prøver om dagen pr. person.

  1. Bakterievækst for in-House High-gennemløb mini-prep
    1. Forbered LB/agar Omni plade. 30 – 40 mL LB-agar (1,5% bakteriologisk agar i LB-medier suppleret med antibiotika til udvælgelse af positive kloner) ind i hver enkelt brønd plade.
    2. Spot glycerol bestand på LB/agar plade. Glycerol bestanden fortyndes i LB-medier (1:300, sædvanligvis 2 μL i 600 μL LB). Ryst i 10 min. spot 3 μL af det fortyndede materiel på LB/agar pladen. Inkuber ved 37 °C, på hovedet, natten over.
    3. Inokulerede kulturer. Ved hjælp af 96-benet enhed, der blev steriliseret i 80% ethanol og flamme, inokulere kulturen fra agar pladen i en Deep-Well blok med 1,5 mL pr. brønd af TB medium suppleret med antibiotika.
    4. Incubate kulturer. Dæk blokken med en gasgennemtrængelig forsegling, og Inkuber i 22 – 24 timer ved 37 °C, 300 – 800 rpm afhængigt af shaker.
      Bemærk: Shakers indstillet til 800 rpm er optimale til denne inkubation. Brug af en langsommere hastighed shaker kan resultere i mindre tætte kulturer og lavere DNA rensning udbytter.
    5. Pellet kulturer. Spin blokke ved 3.800 x g og 4 °c i 30 min. kassér supernatanten.
  2. In-House High-gennemløb mini-prep
    Bemærk: multi kanals pipettorer eller automatiske dispensere kan bruges til at udføre den in-House High-gennemløb mini-prep. Hvis du bruger en automatisk dispenser, skal du sørge for at rengøre systemet før brug og i mellem løsninger.
    1. Forbered alle de løsninger, der anvendes under mini-prep:
      1. Forbered løsning 1: te opblanding buffer (50 mm Tris, pH = 8,0; 10 mm EDTA, pH = 8,0; 0,1 mg/ml RNase). Opbevares ved 4 °C.
      2. Forbered løsning 2: NaOH/SDS lysis buffer (0,2 M NaOH; 1% SDS). For bedre resultater, en frisklavet opløsning bør anvendes.
      3. Forbered løsning 3: KOAC neutraliserings buffer (2,8 M KOAc). Juster pH-værdien af opløsningen til 5,1 med glacial eddikesyre. Opbevares ved 4 °C.
      4. Forbered opløsning N2: ækvibrations buffer (100 mM Tris; 900 mM KCl; 15% EtOH; 0,15% Triton X-100). Juster pH-værdien af opløsningen til 6,3 med fosforsyre.
      5. Forbered opløsning N3: bash buffer (100 mM Tris; 1,15 M KCl; 15% EtOH). Juster pH-værdien af opløsningen til 6,3 med fosforsyre.
      6. Forbered opløsning N5: elueringsbuffer (100 mM Tris; 1 M KCl; 15% EtOH). Juster pH-værdien af opløsningen til 8,5 med fosforsyre.
        Bemærk: vellykket kontrol af DNA-binding, vask og eluering under anionbytningen afhænger i høj grad af buffer KCl-koncentration og pH-værdier. Omhyggelig buffer komponent målinger og pH justering er afgørende. Små afvigelser fra de beskrevne målinger kan resultere i betydelige tab af udbytter.
    2. Re-suspendere pellet. Der tilsættes 200 μL opløsning 1 og rystes ved 2.000 rpm i 5 minutter ved RT. komplet re-suspension af pellet er nødvendig for en vellykket lysis. Hvirvel blokken, hvis det er nødvendigt.
    3. Lyse bakterier. Tilsæt 200 μL opløsning 2, Forsegl pladen med en aluminiumsforsegling, og vend 5x. Omhyggeligt dette trin fra begyndelsen af løsning 2 tilføjelse. Må ikke overstige 5 min.
    4. Neutralisere opløsningen. Tilsæt 200 μL opløsning 3, Forsegl pladen med en aluminiumsforsegling, og vend 5x. Forseglingen kan være løs på grund af lysis/neutraliserings buffere, så vær forsigtig, når du invertere. En partiel inversion, hvor opløsningen aldrig rører forseglingen, anbefales for at forhindre krydskontaminering blandt prøverne.
    5. Ryd lysate. Pladerne centrifugeres ved 3.800 x g og 4 °c i 30 minutter.
    6. Forbered anionbytnings harpiks gylle under lysningen pelleterings trinnet. Brug en 1 L flaske til at fylde den med anionbytter harpiks, indtil den når 300 mL mærket, og tilsæt derefter opløsning N2 op til 900 mL.
      Forsigtig: dette trin skal gøres i hætten for at beskytte mod silica indånding.
    7. Forbered anionbytnings harpiks plader. Stak filter pladerne oven på en dyb brønd blok til at fungere som et affalds opsamlings fartøj. Anionudvekslings opslæmningen blandes, indtil den er homogen, hvorefter den hældes i et glas trug. Ved hjælp af Wide-Bored P1000 spidser, overføre 450 μL af gylle i hver brønd af filter pladerne.
    8. Centrifuge stablede plader (harpiks plade/dyb brønd plade) ved langsom acceleration i 5 min ved 130 x g og rt. kassér strømmen igennem.
    9. Overfør lysat supernatanten til harpiks pladen/dybe brønd blok stakke. Spin de stablede plader i 5 min ved 30 x g med langsom rampe-up hastighed.
    10. Vask kolonnen. Tilsæt 400 μL opløsning N3 (vaskebuffer) til hver brønd. Overfør harpiks pladen til vakuum manifold for at fjerne vaskebufferen. Gentag vaske trinene 3x. På den sidste vask skal du sørge for, at alle brønde er tømt korrekt. Drej stak pladerne ved 150 x g i 5 min for at fjerne eventuel rest buffer.
    11. Elute DNA. Læg harpiks pladen på en ren 800 μL opsamlings plade. Tilsæt 300 μL opløsning N5 til hver brønd. Lad det sidde ved RT i 10 minutter, og drej derefter de stablede plader i 5 minutter ved 20 x g med langsom rampe hastighed. Drej de stablede plader i 1 min. ved 233 x g.
    12. Kvantificer DNA og opbevar plader ved-20 °C indtil videre brug eller Fortsæt direkte til DNA-udfældning.
      Bemærk: mindst 30 μg DNA pr. prøve er nødvendig. Hvis DNA-udbyttet er lavt, anbefales det at gentage DNA-mini-prep, eller alternativt kombinere to plader under udfældnings trinnet (afsnit 2,3).
  3. DNA-nedbør
    1. Tø ud plader, vortex at homogenisere DNA-opløsning, og spin på 230 x g for 30 s at indsamle alle løsning i bunden af brønden.
    2. Tilsæt 40 μL af 3 M NaOAc og 240 μL isopropanol til hver brønd. Dæk pladen med en aluminiums tætning og bland med invertering 3x.
    3. Pladerne centrifugeres i 30 minutter ved 3.800 x g og 25 °c. Kassér forsigtigt supernatanten.
      Bemærk: for at kombinere to plader skal du overføre DNA fra den anden plade til pellet fra den første plade og gentage trin 2.3.2-2.3.3.
    4. Vask og udfældelse af DNA. Tilsæt 400 μL 80% ethanol til hver brønd. Forsegl plader med aluminiums tætning og ryst ved 1.000 rpm i 30 min. centrifuge ved 3.800 x g i 30 min ved 25 °c. Kassér supernatanten.
    5. Tør DNA-pillerne. Placer pladerne på hovedet i en vinkel på papirhåndklæder og lad dem tørre for 1 – 2 h, indtil der ikke er alkohol til stede i bunden af brønden. Forsegl og centrifugeres ved 230 x g i 2 minutter for at bringe eventuelle pellets ned.
    6. Når pladerne er tørre, skal du enten forsegle med aluminiums tætning og fryse ved-20 °C til senere brug eller fortsætte med at resuspendere DNA (trin 4,1).

3. aminosilane slide belægning

  1. Placer glas gliderne i metalstativ. Kontroller visuelt hvert dias for at sikre, at der ikke er ridser eller ufuldkommenheder.
  2. Nedsænk lysbilleder i overfladebehandlings opløsning (2% aminosilan reagens i acetone) i 15 minutter, mens du rokker. Aminosilan opløsningen kan bruges til at belægge to stativer med 30 dias hver, før den skal kasseres.
  3. Skylletrin. Nedsænk slide stativet i acetone vask (99% acetone), ryst frem og tilbage, og derefter op og ned hurtigt 5x. VIP til et hjørne for at dryppe af, og Nedsænk derefter i Ultrapure vand op og ned hurtigt 5x. Tilt for at dryppe af, derefter placere på servietter.
    Bemærk: acetone vask kan bruges to gange, mens det ultrarent vand skal skiftes hver gang.
  4. Tør slides ved hjælp af presset luft, blæser på dem fra alle vinkler i ca 3 min, indtil alle vanddråber er blevet fjernet. Opbevar de coatede slides på RT i et metalstativ inde i en tætlukket æske.

4. forberedelse af array prøve

  1. Resuspension af DNA-pellet fra in-House mini-prep (trin 2.3.6) i 20 μl ultrarent vand og ryste ved 1.000 rpm for 2 h. For MIDI/Max prep DNA fortyndes hver prøve til en endelig koncentration på 1,5 μg/μL og overføres 20 μL til en 800 μL opsamlings plade.
  2. Forbered udskrivning mix. For 1 96 brønd plade, Forbered 1 ml tryk blanding [237,5 μl ultrarent vand; 500 μl af poly-lysin (0,01%); 187,5 μl af BS3 (BIS-sulfosuccinimidyl, 50 mg/ml i DMSO) og 75 μl polyklonal anti-flag kanin antistof)].
    Bemærk: kemikalierne skal tilsættes i den angivne rækkefølge for at undgå udfældning.
  3. Tilsæt 10 μL tryk blanding til hver prøve, Forsegl pladerne med aluminiumsfolie, og ryst ved RT for 90 min ved 1.000 rpm. Pladerne opbevares natten over (~ 16 timer) ved 4 °C.
  4. På udskrivnings dagen, hvirvlen kort og drej pladerne. Der overføres 28 μL af hver prøve til en 384-array plade. Denne overførsel kan ske ved hjælp af automatisering eller en multi-kanal pipette. Det er afgørende at holde styr på placeringen af prøverne i 384 array pladen.
  5. Drej pladen kortvarigt for at fjerne eventuelle bobler. Forsegl pladerne med folie.

5. generering af NAPPA-systemer: mikroarray-udskrivning

Bemærk: alle udskrivningsbetingelser blev optimeret til instrumentet, der er anført i tabel over udstyr og materialer. Hvis du bruger et andet array, kan det være nødvendigt med yderligere optimering.

  1. Arrayer rydde op. Før start, Tøm alle affaldsbeholdere og Genfyld reservoirer med ultrarent vand eller 80% ethanol, hvis det er nødvendigt. Rengør stifter en efter en med fnugfri vådservietter og ultrabure vand. Tør benene med fnugfri klude og læg dem forsigtigt tilbage i Arrayer hovedet.
  2. Arrayer sat op: udskrivning specifikationer [maksimalt antal frimærker pr. trykfarve: 1; antal frimærker pr. spot: 1; multi-stempel timing:--; stempel tid (MS): 0 MS; håndskrift time (MS): 0 MS; justering af udskrivnings dybde: 90 mikron; antal berørings-offs: 0]. derefter skal du følge steriliserings protokol: ultrarent vand vask til 2.000 MS med 0 MS af Tørringstiden og 500 MS af ventetid; Gentag disse trin 6x; efterfulgt af vask med 80% ethanol for 2.000 MS med 1.200 MS af tørring tid og 500 MS af ventetid; Gentag disse trin 6x.
  3. Slide design: Indstil Arrayer med det ønskede opstiller mønster. Designet bør tage hensyn til flere faktorer [dvs. antallet af replikerer for hver prøve, placering og antal af kontrolfunktioner, array layout (en blok, flere identiske blokke), antallet af matricer, der skal udskrives, længden af kørslen, osv.].
  4. Placer de aminosilan belagte slides (trin 3,4) på Arrayer decket. Kontrollér, om støvsugeren holder alle slides sikkert på plads. Start luftbefugteren (den skal indstilles til 60%).
  5. Placer 384 brønd pladen på Arrayer Deck. Starte programmet.
  6. Mærk mikromatrixer. Når udskrivningen er færdig, skal du placere slide etiketter på den nederste (ikke-udskrevne) side af hvert dias. Vedligehold udskrivningsrækkefølgen for slides på decket i numerisk rækkefølge.
  7. Opbevar de trykte matricer på RT i et metalstativ inde i en tæt forseglet æske med en silica-pakning. Slides holdes i et tørt miljø har en holdbarhed til op til et år.
  8. (Valgfrit): der kan udskrives et ekstra parti på 90 dias med de samme prøver. For at gøre dette, skal du fjerne 384 brønd pladen fra Arrayer Deck, så snart udskrivningen af pladen er færdig. Forsegl og opbevar pladen ved 4 °C. Efter den første batch af arrays er helt færdig, fjerne dem fra decket, placere nye aminosilan belagte slides og starte en ny løbetur. Sørg for, at hver 384 brønd plade er på RT i 30 minutter før brug. Hvis mere end fire repliper pr. prøve er trykt i en batch af slides, anbefales det at opdele 384 brønd pladerne i to plader for at mindske prøve fordampning ved at reducere mængden af tid brugt på Arrayer dæk.
    Bemærk: Kontrollér alle reservoirer før begyndelsen af den anden løbetur.

6. påvisning af DNA på NAPPA-slides

  1. Bloker diasene. Placer diasene i en pipette boks, og tilsæt 30 mL blokerende buffer. Inkuber ved RT i 1 time på en gynge shaker.
  2. Plette diasene. Kassér blokerings opløsningen, og tilsæt 20 mL blokerende buffer og 33 μL fluorescerende DNA-interkalerende farvestof. Inkuber i 15 minutter med agitation. Skyl derefter hurtigt slides med ultrarent vand og tør med presset luft. Fortsæt med scanningen (afsnit 11).

7. udtryk for NAPPA-slides

  1. Bloker slides med blokerende buffer på en gynge shaker på RT for 1 h. brug ca. 30 mL i en pipette boks til fire dias.
  2. Skyl slides med ultrarent vand og tør med filtreret trykluft. Påfør tætnings pakningen på hvert dias i fabrikantens anvisninger.
  3. Tilsæt IVTT mix. Hver slide vil kræve 150 μL IVTT mix. 82,5 μL af HeLa-lysat fortyndes i 33 μL DEPC-vand og suppleres med 16,5 μL tilbehørs proteiner og 33 uL reaktionsblanding. Tilsæt IVTT mix fra ikke-etiket-eller ikke-objekt enden. Afpipettere blandingen langsomt (det er acceptabelt, hvis det perler op midlertidigt ved indløbs enden). Massér forsigtigt tætnings pakningen, så IVTT-blandingen spredes ud og dækker hele området af arrayet. Påfør de små runde portforseglinger til begge porte.
  4. Placer slides på en støtte og overføre dem til den programmerbare Chilling inkubator. Inkuber i 90 min ved 30 °C for protein ekspression, efterfulgt af 30 min ved 15 °C for immobilisering af forespørgsels proteinet.
  5. Vask og Bloker slides. Fjern tætnings pakningen, og sænk gliderne i en pipette æske med ca. 30 mL 1x TBST suppleret med 5% mælk til protein display (afsnit 8) eller 1x TBST suppleret med 3% bovin serumalbumin (BSA) for kinase assays eller Drug screening (afsnit 9). Incubate ved RT med agitation i 20 min og Gentag dette trin 2x.

8. påvisning af proteiner på NAPPA-systemer

  1. Tilføj primært antistof. Fjern diasene fra blokerings opløsningen (trin 7,5), og tør forsigtigt bagsiden (ikke-udskrevet side) med et papirhåndklæde. Placer slides på en støtte og anvende 600 μL primær antistof (mus anti-flag) fortyndet 1:200 i 1x TBST + 5% mælk. Inkuber i 1 time ved RT.
  2. Vask slides med 1x TBST + 5% mælk på en gynge shaker (3x for 5 min hver).
  3. Tilføj sekundært antistof. Fjern slidene fra Vaskeopløsningen, og tør forsigtigt bagsiden af med papirhåndklæde. Placer slides på en støtte og anvende 600 μL sekundært antistof (cy3-labbeled anti-museantistof) fortyndet 1:200 i 1x TBST + 5% mælk. Beskyt lysbillederne mod lys og Inkuber i 1 time ved RT.
  4. Vask slides med 1x TBST på en gynge shaker (3x for 5 min hver). Skyl hurtigt slides med ultrarent vand og tør ved hjælp af presset luft. Fortsæt med scanningen (afsnit 11).

9. screening af tyrosinkinasehæmmer på NAPPA-systemer

Bemærk: flere slides kan behandles i det samme eksperiment, men sørg for, at i hvert trin behandles ét dias ad gangen, og at de ikke tørrer mellem trinnene. Tilføj alle løsninger til den ikke-label eller ikke-objekt ende af diaset.

  1. Forbered alle de løsninger, der anvendes under lægemidlet screening:
    1. Klargøre fosfatase/Dnaseopløsning ved at kombinere følgende: 1x protein metallo-fosfataser buffer (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,01% Brij 35 ved pH = 7,5); 1 mM MnCl2; 8.000 enheder af lambda-proteinphosphatase; og 2 enheder af DNase I. Forbered 400 μL af opløsningen for hvert mikroarray. Tilsæt fosfatase og DNase lige før brug.
    2. Gøre stoffet fortynding. Lægemidler rekonstitueres i DMSO til en endelig koncentration på 10 mM. For at sikre, at alle lægemiddelkoncentrationer, der testes på systemet, sikrer, at den samme mængde DMSO (en 10.000 x bestand i DMSO) oprettes for hver koncentration og opbevares ved-80 °C. På tidspunktet for brug, stoffer er fortyndet 1:100 i vand.
    3. Forbered stof/kinase opløsning ved at kombinere følgende: 1x kinase buffer (25 mM Tris-HCl af pH = 7,5); 5 mM beta-glycerophosphat; 2 mM DTT; 0,1 mM na3VO4; 10 mM MgCl2; 500 μM ATP; og 2 μL lægemiddel (fortyndet 1:100 i vand). Forbered 200 μL af opløsningen for hvert mikroarray.
  2. Udføre fosfatase-og DNase-behandlingen. Fjern slides fra blokerings opløsningen (trin 7,5), og tør forsigtigt bagsiden af med papirhåndklæde. Placer lysbillederne på støtte og Anvend 200 μL fosfatase/Dnaseopløsning. Placer en mikroarray dækseddel for at undgå fordampning. Inkuber ved 30 °C i 45 min i ovnen.
  3. Fosfatase og DNase behandling II: Fjern arrays fra ovnen, kassér dæksedlen, Fjern overskydende opløsning, og Anvend 200 μL frisklavet fosfatase og Dnaseopløsning. Dæk mikroarrays med dækglas og Inkuber i en anden 45 min ved 30 °c i ovnen.
  4. Vask slides med 1x TBST + 0,2 M NaCl på en gynge shaker (3x for 5 min hver).
  5. Udføre narkotikabehandling og kinase reaktion. Fjern slides fra Vaskeopløsningen, og tør forsigtigt bagsiden af med et papirhåndklæde. Placer slides på støtte og anvende 200 μL stof/kinase opløsning. Anbring en dækseddel på toppen for at undgå fordampning. Inkuber i ovnen i 1 time ved 30 °C.
  6. Vask slides med 1x TBST + 0,2 M NaCl på en gynge shaker (3x for 5 min hver).
  7. Gentag trin 8.1 – 8.4 ved hjælp af som primært antistof anti-phosho-tyr antistof fortyndet 1:100. Udskift 1x TBST + 5% mælk i alle trin med 1x TBST + 3% BSA.

10. automatiseret hybridiserings protokol

Bemærk: Alternativt kan en hybridiseringstation bruges til at automatisere alle hybridiseringer og skyller på NAPPA-matricer (afsnit 7 – 9), og protokollen leveres som supplerende fil 1.

11. erhvervelse af billede

Bemærk: Mikroarray billeder skal erhverves med en opløsning på 20 mikron eller højere.

  1. Indlæs mikroarrays i slide holder magasinet med proteinerne opad. Læg magasinet i microarray scanneren.
  2. Vælg den grønne laser med et 575/30 nm-emissions filter for at scanne signalet fra CY-3-mærket sekundært antistof. Hvis der anvendes en anden fluoroforet, skal du vælge den korrekte laser/bølgelængde for at detektere signalet fra det fluorescerende farvestof.
  3. Definer navnet på hvert billede og den placering, de skal gemmes i.
  4. (Valgfrit): for hver ny fluorophore anbefales optimering af scannings forholdene for at detektere den lineære rækkevidde af signal intensiteten. For at gøre dette, scanne et mikroarray ved hjælp af en række Photomultiplier (PMT) og Gain, indtil et klart billede er opnået med ikke-mættet signal og lav baggrund.
  5. Scan alle mikroarrays med de optimerede indstillinger, og husk at slå autogain fra.
    Bemærk: ved dataanalyse skal alle mikroarrays scannes ved hjælp af de samme scanningsindstillinger. For kinase assays ved hjælp af cy3 som en fluorophore, scannes billederne med en 20% PMT, laser intensitet på 25% og 10 mikron opløsning ved hjælp af scanneren, der er anført i tabellen over udstyr og materialer.

12. data behandling og analyse

Bemærk: flere softwarepakker er tilgængelige til kvantificering af mikroarray data med lignende egenskaber. Den fremgangsmåde, der er beskrevet her, er designet til softwaren i tabellen over udstyr og materialer.

  1. Indlæse TIFF-filer, der skal kvantificeres, designe gitteret til at matche mikromatricen layout og justere størrelsen af pletter til at indarbejde hele signalet med det minimale område muligt. Tilstødende pletter bør ikke overlappe. Undersøg visuelt, hvor godt softwaren klarer sig, og Juster gitteret manuelt, hvis det er nødvendigt.
  2. Kvantificere signal intensiteten af mikrosystemet. Visuelt inspicere pletter for enhver abnormitet (ikke-specifik binding, støv, etc.) og fjerne dem fra dataanalyse.
  3. Korriger baggrunden lokalt ved hjælp af signalet fra tilstødende områder på den matrix, hvor der ikke er plads til stede.
  4. Normaliser data. For at sammenligne signalet på tværs af forskellige matricer skal signal intensiteten for hvert mikroarray normaliseres. Hvis du vil udelukke afvigende værdier, skal du normalisere dataene ved hjælp af den trimmede gennemsnitlige 30% af signalet fra det positive kontrolelement (IgG-pletter) på de defosforylerede mikroarrays.
    Bemærk: signalet fra IgG-stedet ændres ikke under fosforylering og dephosphorylering af mikromatricer og er velegnet til normalisering.
  5. Identificer aktive kinaser. For hver funktion, som vises på mikrosystemet, beregnes forholdet mellem den normaliserede signalintensitet i de autophosphorylerede og defosforylerede matricer. Sæt en tærskel på 1,5-fold ændring til identifikation af de aktive kinaser og markere alle de andre funktioner som ude af stand til at gennemgå autofosforylering (N/a).
  6. Beregn aktiviteten af hver kinase identificeret i trin 12,5 som en procentdel af justeret signal (signalintensitet af det normaliserede positive kontrolarray (DMSO), der er trukket fra signal intensiteten af det normaliserede negative kontrol array (defosforyleret).

Representative Results

Selv monterede NAPPA-mikroarrays giver en solid platform, der kan anvendes til mange forskellige anvendelser, herunder biomarkør opdagelse, protein-protein interaktioner, substrat identifikation og Drug screening10,11 ,12,13,14,15,16,17,18,19,20.

Den samlede metodologi, der er anvendt til studiet af kinaseaktivitet og screening af tyrosinkinaser-hæmmere på NAPPA-mikroarrays, er skematisk repræsenteret i figur 1. Først genereres NAPPA-mikroarrays ved immobilisering af cDNA og Capture agent på de coatede mikroarrays. CDNAs bruges derefter som skabelon til transskription og oversættelse af proteiner ved hjælp af et menneske baseret IVTT-system, og de nyligt syntetiserede proteiner er immobiliseret af Capture agent9. Kvaliteten af det trykte mikroarray kan overvåges ved at måle niveauer af DNA (der bekræfter ensartet udskrivning) eller protein, der vises på arrayet (bekræfter protein ekspression og Capture; Figur 1). For at mindske baggrunds signalet og øge eksperimentets dynamiske område behandles mikrosystemerne med 1) lambda fosfatase for at fjerne phosphorylering fra ser/thr/tyr rester, derefter med 2) DNase for at forenkle kemien på stedet og nedsætte baggrund (figur 1).

Det næste skridt er autofosforylering reaktion, hvor mikroarrays er inkuberet med kinase buffer i fravær af ATP (negativ kontrol array, benævnt defosforyleret microarrays), og kinase buffer suppleres med ATP (positiv kontrol, benævnt "autophosphorylated arrays") eller ATP + DMSO (køretøjets kontrol). Det skal understreges, at der i dette trin ikke tilsættes kinase; Derfor kvantificeres den iboende aktivitet af hver kinase, der vises på mikrosystemet, gennem måling af dens fosforylerings niveauer ved hjælp af et pan anti-phospho-tyrosinantistof efterfulgt af et cy3-labbeled sekundært antistof (figur 1).

Kvalitetskontrol af NAPPA-kinase-systemer, der viser et panel af humane proteinkinaser trykt i firkanter, er vist i figur 2. Niveauerne af immobiliseret DNA blev målt ved DNA-farvning, og det viste et jævnt signal på tværs af mikrosystemet, hvilket tyder på, at mængden af DNA trykt på arrayet var ensartet. Det er også muligt at observere flere funktioner uden DNA-farvning. Disse funktioner svarer til nogle Kontroller, hvor DNA blev udeladt fra udskrifts blandingen [dvs. tomme pletter (intet blev trykt), vand pletter, renset IgG spot (Poly-lysin, Cross linker og renset IgG), udskrivning mix kun (komplet udskrivning mix: poly-lysin Plus Cross linker og anti-flag antistof, uden nogen DNA)]. Niveauerne af protein, der vises på NAPPA-kinase-mikromatricer, blev vurderet efter IVTT-reaktionen med anti-tag-antistoffer.

Til kinase-screeningen blev flaget anvendt som det valgte mærke, og det Proteinniveau, der blev vist på mikrosystemet, blev målt ved hjælp af et anti-flag antistof. Som vist, de fleste pletter indeholdende cDNA med succes viste detekterbare niveauer af protein. Nogle af kontrolstederne uden cDNA afslørede også signal med anti-flag antistof: IgG spot (bruges til at detektere aktiviteten af det sekundære antistof) og tomme vektor pletter (cDNA koder for tag kun) (figur 2). NAPPA-kinase-mikromatricer viste god reproducerbarhed blandt lysbilleder, med korrelationen mellem niveauerne af protein display blandt særskilte tryk partier højere end 0,88 (figur 2). Inden for samme batch var korrelationen endnu højere, tæt på 0,92 (data ikke vist).

Dernæst blev kinase autophosphorylations aktiviteten af de proteiner, som blev vist på arrayet, målt ved hjælp af anti-phospho-tyrosin-antistof (figur 3). Protein vist på array viste høje niveauer af protein fosforylering efter udtryk (figur 3, venstre), som kan være forårsaget af iboende kinase aktivitet af det protein, der vises på arrayet eller ved aktive kinaser til stede i ivtt mix. Denne fosforylering blev fuldstændig fjernet med lambda fosfatasebehandling, og disse mikroarrays blev anvendt til kinase assays. Efter defosforylering viste autophosphorylations reaktioner uden ATP ingen signifikante niveauer af fosforylering, som forventet, mens mikroarrays inkuberet med kinasebuffer i tilstedeværelse af ATP viste protein fosforylering så hurtigt som 15 min ( Figur 3). Ved lægemiddel screening blev kinaseaktiviteten målt efter 60 min. af autophosphorylations reaktionen for at maksimere antallet af testede kinaser.

Sammenligningen mellem mikroarrays, hvor fosforylations niveauerne blev målt lige efter protein ekspression (figur 3, venstre) og efter 60 min af autophosphorylations reaktionen (figur 3, højre) viste: i) proteiner, der kun er phosphoryleret efter udtryk, tyder på, at de kan være eksogent fosforyleret af proteiner til stede på IVTT mix, men kan ikke være autophosphorylated; II) protein fosforyleret først efter autophosphorylations reaktionen, hvilket tyder på, at disse proteiner ikke var aktive efter protein ekspression, og at de krævede Co-faktorer i kinasebufferen var aktive. eller III) protein fosforyleret på begge matricer, hvilket tyder på, at de var aktive i begge miljøer (figur 3).

Som et eksempel på de opnåede resultater for screening af tyrosinkinasehæmmere på NAPPA-kinase-systemer blev der anvendt tre kinaser-hæmmere med tydelig selektivitet på tværs af proteinkinaser: staurosporin, Imatinib og ibrutinib. For alle screeninger blev defosforylerede NAPPA-mikroarrays inkuberet med stigende koncentrationer af TKI (fra 100 nM til 10 uM) under autophosphorylations reaktionen. Den første TKI-testede var staurosporine, en global proteinkinasehæmmer, der viste potent kinase hæmning på mikrosystemet på tværs af næsten alle kinaser testet11.

Dernæst blev Imatinib testet, en ABL-og c-kit-hæmmer, der anvendes til behandling af kronisk myeloid leukæmi og gastrointestinale stromale tumorer4,5,6,7. På NAPPA-kinase-systemer udviste Imatinib en signifikant reduktion i Abl1-og BCR-Abl1-aktiviteten, hvorimod andre kinaser forblev mest upåvirket (figur 4a). Data kvantificeringen for kinaseaktiviteten blev normaliseret mod det defosforylerede array og repræsenterede som en procentdel af det positive kontrol mikroarray (kun køretøj). Data for TNK2 (ikke-relevant kinase), Abl1 og BCR-Abl1 er vist i figur 4b. Som forventet udviste Imatinib selektiv hæmning mod Abl1 og BCR-ABl1. Data for c-kit var inkonklusive på grund af manglende aktivitet på de positive kontrol arrays.

Endelig blev ibrutinib, en FDA-godkendt kovalent hæmmer af Brutons tyrosinkinase (BTK), afprøvet. Ibrutinib anvendes i øjeblikket til behandling af flere blod relaterede kræftformer med overaktiv BTK, herunder kronisk lymfocytisk leukæmi (CLL), Mantle-celle-lymfom og waldenströms macroglobulinæmi21,22. Figur 4c, er repræsentativ for typiske resultater, der er opnået for ibrutinib-screeningen. Kinaseaktiviteten af ABL1 (ikke-relevant kinase) og BTK (Canonical Target) og ERBB4 (potentielt nyt mål) er vist i figur 4d. Dataene antyder, at ERBB4 kan hæmmes af ibrutinib på en dosis specifik måde. Denne hæmning blev bekræftet in vitro og i celle-baserede assays11, viser styrken af denne platform.

Tilsammen tyder dataene på, at NAPPA-kinase-mikroarray platformen kan anvendes til objektiv screening af TK-hæmmere. Desuden er screeningen hurtig og kan let tilpasses til at omfatte enhver variation af protein kinaser af interesse.

Figure 1
Figur 1: skematisk gengivelse af kvalitetskontrol og screening af tyrosinkinasehæmmere i NAPPA-systemer. NAPPA-systemer er trykt med cDNA-kodning for det protein af interesse, der er smeltet sammen med et tag og et Capture-antistof. Under in vitro transkription og oversættelses reaktion (IVTT) de syntetiserede proteiner er fanget på mikromatrixens overflade gennem tag ved Capture antistof. Kvalitetskontrollen (QC) af matricer udføres ved måling af niveauerne af DNA trykt på diaset, ved hjælp af et fluorescerende DNA-interkalerende farvestof, og de niveauer af protein, der vises på arrayet ved hjælp af tag-specifikke antistoffer. For kinase-screeningen behandles mikrosystemerne med DNase og fosfatase efter IVTT-reaktionen for at fjerne det trykte DNA og al fosforylering, der kan være forekommet under proteinsyntesen. De defosforylerede arrays er nu klar til at blive brugt til lægemiddel skærmen. For hver analyse anvendes der rutinemæssigt tre sæt kontrolelementer: (I) defosforylerede systemer, hvor autophosphorylations reaktionen udføres uden ATP; II) autophosphorylerede mikrosystemer, hvor autophosphorylations reaktionen udføres under tilstedeværelse af ATP og (III) DMSO-behandlet array (køretøj), hvor autophosphorylations reaktionen udføres med ATP og DMSO. De slides, der behandles med forskellige koncentrationer af kinasehæmmere, følger nøjagtig den samme protokol, som anvendes til de DMSO-behandlede matricer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentative resultater af kvalitetskontrol for selv monterede NAPPA-kinase-systemer. DNA-indhold målt ved et fluorescerende DNA-interkalerende farvestof (venstre) og protein niveauer, der vises på mikrosystemet målt ved anti-flag-antistof (Middle), vises. På højre side er en korrelations plot af de niveauer af protein, der vises på to NAPPA-kinase arrays trykt i separate partier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentative resultater af kinaseaktiviteten i NAPPA-kinase-matricer. Mikroarrays, der viste proteinkinaser i firplicat, blev brugt til at studere proteinkinaseaktivitet på arrayet gennem måling af proteinfosforylering ved hjælp af anti-pTyr antistof, efterfulgt af cy3-mærket anti-museantistof. Kontrol arrays uden fosfatase/DNase behandling og uden ATP under autofosforylering reaktionen blev anvendt til at måle baggrunden fosforylering efter protein ekspression (post-udtryk). De resterende mikroarrays blev behandlet med fosfatase/DNA, og autophosphorylations reaktionen blev udført uden ATP (defosforyleret mikroarray, negativ kontrol) eller med ATP (autophosphorylerede mikroarrays). For de autophosphorylerede mikroarrays blev autophosphorylations reaktionen udført i 15 min, 30 min, 45 min eller 60 min. som vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: repræsentative data fra tyrosinkinase skærm på NAPPA-kinase arrays. A) fosfatase/DNase-behandlede Nappa-kinase-arrays blev inkuberet i stigende koncentrationer af Imatinib under autophosphorylations reaktionen, og kinaseaktiviteten var måling med anti-phospho-tyr-antistof. B) kvantificering af kinaseaktiviteten observeret på Nappa-kinase-systemer, som er eksponeret for Imatinib. Data blev normaliseret mod signalet fra de negative kontrol arrays (defosforyleret), og det vises som en procentdel af de positive kontrol matricer (autophosporylations reaktion udført i nærværelse af DMSO). Lignende data er vist for screening af ibrutinib (C, D). Dette tal er blevet modificeret fra Rauf et al.11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil 1. Alternativ protokol til screening af tyrosinkinasehæmmere i NAPPA-systemer ved hjælp af en automatiseret hybridiseringstation. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Ændringer og fejlfinding
I optimeringsfasen af studiet af kinaseaktivitet på NAPPA-matricer var en af de vigtigste kilder til baggrund og lavt dynamisk område observeret den BSA, der blev anvendt på udskrifts blandingen. BSA var at levere de primære aminer nødvendige for binding med aminosilan overflade og var fældefangst DNA og Capture antistof på stedet. BSA er imidlertid meget fosforyleret, hvilket gør det vanskeligt for påvisning af autophosphorylations signalet på matrixen over baggrundsstøjen. For at løse dette problem, flere alternativer til BSA i trykning mix blev testet, og poly-lysin blev identificeret som god erstatning. Poly-lysin mangler nogen fosforylering site; Derfor er baggrunden fra ikke-udtrykte arrays meget minimal. Desuden er mikroarrays trykt med poly-lysin reproducerbare og vise gode niveauer af proteiner (figur 2).

Den næste kritiske modifikation, der blev udført på standard NAPPA-analysen, var tilføjelsen af et phosphatase/DNase-behandlingstrin. Behandlingen af mikroarrays med fosfatase gør det muligt at fjerne enhver fosforylering, der forekom i IVTT-blandingen under proteinsyntese og-opsamling (figur 3). Kilden til denne fosforylering kan være fra iboende autophosphorylering aktivitet eller fra aktiviteten af kinaser til stede i IVTT mix. Fjernelsen af al fosforylering efter ekspression gjorde det let at identificere de kinaser, der er aktive og kan gennemgå autophosphorylering (figur 3).

Kritiske trin i protokollen
NAPPA er en robust teknologi, men som forventet er der flere kritiske trin. Den første er erhvervelsen af høj kvalitet DNA i den relevante koncentration. Ved hjælp af DNA af dårlig kvalitet eller i lave koncentrationer vil generere dårlig kvalitet mikroarrays med flere funktioner, der ikke udtrykkes og vises i de relevante niveauer, faldende antallet af proteiner analyseret på array. Det andet kritiske trin er ekspression af proteiner på mikrosystemet. Brugen af et IVTT-system, der vil udtrykke høje niveauer af funktionelt protein er afgørende for at studere kinase aktivitet på array.

Det næste kritiske trin på TKI-screeningen er, hvordan mikrosystemerne håndteres. Mikromatricer bør ikke tørre under et hvilket som helst trin i protokollen, og skånsom håndtering anbefales for at forhindre ridser, der kan øge baggrunds signalet. Da arrays fra hele eksperimentet vil blive sammenlignet med hinanden, er det vigtigt at sikre, at alle inkubations trin er endda på tværs af alle slides. For eksempel skal den tid, der kræves for at udføre et trin i en enkelt matrix, tages i betragtning, når et parti på 20 matricer behandles for at forhindre forskelle i inkubations længden på tværs af matricer.

Endelig er udformningen af eksperimentet og inddragelsen af både positive og negative kontroller afgørende for kvalitetskontrol og dataanalyse. Det første sæt kontrolelementer er dem, der er trykt i hver matrix, og omfatter negative kontrolelementer [dvs. tomme pletter (uden materiale trykt), vand eller tom vektor (kun udtrykke tagget)] samt en positiv kontrol (dvs. renset IgG, som detekteres af sekundært antistof og er inert over for ændringer i fosforylerings niveauerne). Tilsammen måler de baggrundsniveauerne for mikrosystemet, mulig overførsel under udskrivningen og signal intensiteten af detekterings metoden.

Det næste sæt af kontroller er Drug screening kontrol og omfatter defosforylerede og autophosphorylated mikroarrays (i nærværelse af eller fravær af DMSO). Som tidligere nævnt måler det defosforylerede mikroarray niveauet af fosforylering efter fosfatasebehandling og dermed basisniveauet for alle andre eksperimenter. Jo lavere baselineniveau er, jo højere er det dynamiske område af assays. De autophosphorylated arrays præsentere den maksimale fosforylering niveauer af alle arrays og signalet skal være stærk og klar. Det bruges til dataanalyse, men også som et kontrolelement, at alle reaktioner blev udført med succes på arrayet.

Begrænsninger af teknikken
Som i nu, en af begrænsningerne af Drug screening præsenteret her er dens evne til at screene kun protein kinaser, der kan være autophosphorylated. En mulig måde at overvinde dette på er ved at udskrive en kinase og et kendt substrat på samme sted. Co-trykning af DNA for to forskellige proteiner blev gennemført15, hvilket tyder på gennemførligheden af denne fremgangsmåde. Desuden kan det protein, der vises på arrayet, ikke foldes korrekt, hvilket resulterer i et inaktivt protein. Brugen af human-baserede udtryks system gjort en betydelig forbedring i kinase aktivitet målt på array; dog kan nogle proteiner stadig ikke analyseres på arrayet på grund af dets inaktivitet.

En anden begrænsning er målingen af fosforylering ved hjælp af et pan anti-phospho-tyr antistof. På trods af sin ikke-specificitet vedrørende motivet på fosforylerings stedet forekom alle målte fosforyleringer på tyrosinrester og efterlod seriner og threoniner og deres respektive kinaser. Til dato, mere end 10 pan phospho-ser/thr antistoffer er blevet testet uden succes, på trods af flere forsøg på at optimere inkubation og vaske betingelser. Et nyt detekteringssystem, der er uafhængigt af antistoffer, kan være den bedste mulighed for at udvide antallet af proteinkinaser, der kan screenes for narkotika hæmning. I denne sammenhæng er der et par muligheder, herunder radioaktivitet eller kemiske tilgange som Click konjugering. En række optimeringer er nødvendige for at minimere baggrunds signalet og give et godt dynamisk område for assays.

Den tredje begrænsning er erhvervelsen af cDNA-kloner, der skal trykkes på arrayet. CDNA-klonerne kan genereres ved hjælp af enhver klonings teknik, herunder stedspecifikke rekombinationsystemer, såsom Creator eller gateway23. En anden mulighed er at købe klonerne fra DNAsu Library, der findes på < https:/Dnasu.org/dnasu/Home.do >, hvor mere end 17.000 cDNAs kloner, herunder hele menneskelige kinome, er let tilgængelige til at blive brugt til opførelse af NAPPA arrays24 .

Den fjerde begrænsning er, at ikke alle laboratorier er udstyret med passende udstyr til at fabrikere og screene deres egne NAPPA arrays. Denne protokol giver alternative metoder til at generere den DNA, der skal udskrives på mikrosystemet, uden behov for højt gennemløb udstyr, og protokoller til manuelt at udføre alle de hybridisering trin. Men, adgang til en Arrayer og microarray scanner er stadig nødvendigt. En mulighed for at løse dette problem er at bruge NAPPA Core-tjenesten og-faciliteten, der findes på < http:/nappaproteinarray.org/>, som distribuerer tilpassede NAPPA-mikroarrays til en nonprofit akademisk pris. Endelig er de data, der indhentes på matrixer, som ved enhver screeningmetode modtagelige for artefakter (enten positive eller negative) og bør derfor valideres ved hjælp af ortogonale analyser.

Betydning med hensyn til eksisterende metoder
Flere platforme er tilgængelige kommercielt til screening af protein kinaser. En metode rutinemæssigt anvendes, er bindende assays, som kan udføres med proteinfragmenter, kinase domæne, større proteinfragmenter med kinase domæne og nogle regulerende regioner, og selv fuld-længde proteiner. Proteinerne udtrykkes sædvanligvis i bakterie systemer på grund af omkostningerne og enkelheden i udtryks-og rensnings protokollerne. Samspillet mellem det stof af interesse og proteinet måles derefter med nogle type rapport assay som fluorescens eller tilstedeværelsen af Tags, for eksempel. Den vigtigste begrænsning af dette sæt af tilgange er det faktum, at proteinet ikke nødvendigvis er aktiv under interaktionen med lægemidlet, hvilket kan resultere i identifikationen af falsk positive og falsk negative interaktioner. Protein fragmenter er særligt sårbare over for ændringer i kropsbygning og manglende aktivitet, og alle de opnåede data bør valideres ved hjælp af aktive proteiner, fortrinsvis i deres fuld længde form. En anden begrænsning af nogle af platformene er evnen til at screene kun ATP analogerne, begrænse dens samlede brug.

De fleste af de kommercielt tilgængelige tjenester til screening af TKIs ved hjælp af enzymatiske baserede tilgange udnytter kun vilde type versioner af kinase af interesse, og nogle gange kun en udvalgt par mutanter. Vel vidende, at resistens over for lægemidler er meget almindelig hos patienter behandlet med TKI, det er vigtigt at være i stand til at måle narkotika respons i forskellige mutanter, for udvælgelsen af den mest hensigtsmæssige inhibitor. På grund af nappas natur er screeningen af kinasemutanter enkel og let at gennemføres, og det eneste nødvendige værktøj er inkorporering af kinase-mutanten i NAPPA cDNA-samlingen, som f. eks.

Fremtidige ansøgninger
En af de mest almindeligt forekommende former for behandling forløber i kræftbehandling ved hjælp af kinasehæmmere er erhvervelse af mutationer i drug target under et behandlingsforløb. Screeningen af disse mutanter med hensyn til deres respons på kinasehæmmere er af vital betydning for udvælgelsen af anden/tredje generation af TKIs for at opnå en personlig behandling for hver patient. Den Drug screening tilgang præsenteret her, giver en objektiv screening platform, hvor enhver tyrosinkinasehæmmer kan testes mod et panel af tyrosinkinaser til stede i det menneskelige genom. Da de proteiner, der vises på NAPPA-matricer, udtrykkes in vitro fra det cDNA, der er trykt på diaset, kan enhver mutant variant nemt inkorporeres i cDNA-samlingen, der skal vises på arrayet. Det anlæg, hvor kinasemutanterne kan genereres og udtrykkes på arrayet, kombineret med NAPPA-Teknikens høje gennemløbs effekt, giver et unikt miljø til studiet af kinasemutanter og deres respons på stoffer, hvilket gør NAPPA egnet til personlig Drug screening, et af målene for Precision Medicine.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke alle på LaBaer Lab for deres hjælp og kritik under udviklingen af projektet. Dette projekt blev støttet af NIH Grant U01CA117374, U01AI077883 og Virginia G. Piper Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
364 well plates (for arraying) Genetix x7020
800 µL 96-well collection plate Abgene AB-0859
96-pin device Boekel 140500
Acetic Acid Millipore-Sigma 1.00066
Acetone 99.9% Millipore Sigma 650501
Aluminum seal for 96 well plates VWR 76004-236
Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane) Pierce 80370
ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse Millipore Sigma F3165
Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal) Millipore Sigma F7425
ATP 10 mM Cell Signaling 9804S
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Millipore-Sigma G9422
bacteriological agar VWR 97064-336
Blocking Buffer ThermoFisher/Pierce 37535
Brij 35 ThermoFisher/Pierce BP345-500
BS3 (bis-sulfosuccinimidyl) ThermoFisher/Pierce 21580
BSA (bovine serum albumin) Millipore Sigma A2153
Coverslip 24 x 60 mm VWR 48393-106
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-165-150
DeepWell Block, case of 50 ThermoFisher/AbGene AB-0661
DEPC water Ambion 9906
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Millipore-Sigma D8418
DNA-intercalating dye Invitrogen P11495
DNase I Millipore-Sigma AMPD1-1KT
DTT Millipore-Sigma 43816
EDTA Millipore-Sigma EDS
Ethanol 200 proof Millipore-Sigma E7023
Filter plates Millipore-Sigma WHA77002804
Gas Permeable Seals, box of 50 ThermoFisher/AbGene AB-0718
Glass box Wheaton 900201
Glass slides VWR 48300-047
Glycerol Millipore-Sigma G5516
HCl (Hydrochloric acid) Millipore-Sigma H1758
HEPES Buffer Solution Millipore-Sigma 83264
Human-based IVTT system Thermo Scientific 88882
ImmunoPure Mouse IgG whole molecule ThermoFisher/Pierce 31202
Isopropanol Millipore-Sigma I9516
KCl (Potassium chloride) Millipore-Sigma P9333
KH2PO4(Potassium phosphate monobasic) Millipore-Sigma P5655
Kinase buffer Cell Signaling 9802
KOAc (Potassium acetate) Millipore-Sigma P1190
Lambda Protein Phosphatase new england biolabs P0753
Lifterslips, 24 x 60 mm ThermoFisher Scientific 25X60I24789001LS
Metal 30-slide rack with no handles Wheaton 900234
MgCL2 (Magnesium chloride) Millipore-Sigma M8266
Na3VO4 (Sodium orthovanadate) Millipore-Sigma S6508
NaCl (Sodium Chloride) Millipore-Sigma S3014
NaOAc (Sodium acetate) Millipore-Sigma S2889
NaOH (Sodium hydroxide) Millipore-Sigma S8045
NucleoBond Xtra Midi / Maxi Macherey-Nagel 740410.10 / 740414.10
Nucleoprep Anion II Macherey Nagel 740503.1
Phosphoric Acid Millipore-Sigma 79617
Poly-L-Lysine Solution (0.01%) Millipore-Sigma A-005-C
Protein Phosphatase (Lambda) New England Biolabs P0753
RNAse Invitrogen 12091021
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Millipore-Sigma L6026
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Millipore-Sigma 05030
Sealing gasket Grace Bio-Labs, Inc 44904
Silica packets VWR 100489-246
Single well plate ThermoFisher/Nalge Nunc 242811
Sodium acetate (3M, pH 5.5) Millipore-Sigma 71196
TB media (Terrific Broth) Millipore-Sigma T0918
Tris IBI scientific IB70144
Triton X-100 Millipore-Sigma T8787
Tryptone Millipore-Sigma T7293
Tween 20 Millipore-Sigma P9416
Yeast Extract Millipore-Sigma Y1625
Name Company Catalog number Comments
Equipments Maker/model
Programmable chilling incubator Torrey Pines IN30 Incubator with Cooling
Shaker for bacterial growth ATR Multitron shaker
Vacuum manifold with liquid waste trap MultiScreenVacuum Manifold 96 well
96 well autopippetor/liquid handler Genmate or Biomek FX
Liquid dispenser Wellmate
DNA microarrayer Genetix QArray2
Automatic hybridization station Tecan HS4800 Pro Hybridization Station
Microarray scanner Tecan PowerScanner
Microarray data quantification Tecan Array-ProAnalyzer 6.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Melnikova, I., Golden, J. Targeting protein kinases. Nature Review Drug Discovery. 3 (12), 993-994 (2004).
  2. Patterson, H., Nibbs, R., McInnes, I., Siebert, S. Protein kinase inhibitors in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases. Clinical and Experimental Immunology. 176 (1), 1-10 (2014).
  3. Wu, P., Nielsen, T. E., Clausen, M. H. FDA-approved small-molecule kinase inhibitors. Trends Pharmacological Sciencies. 36 (7), 422-439 (2015).
  4. Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2 (5), 561-566 (1996).
  5. Heinrich, M. C., et al. Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI 571, a selective tyrosine kinase inhibitor. Blood. 96 (3), 925-932 (2000).
  6. Stagno, F., et al. Imatinib mesylate in chronic myeloid leukemia: frontline treatment and long-term outcomes. Expert Review Anticancer Therapy. 16 (3), 273-278 (2016).
  7. Ben Ami, E., Demetri, G. D. A safety evaluation of imatinib mesylate in the treatment of gastrointestinal stromal tumor. Expert Opinions in Drug Safety. 15 (4), 571-578 (2016).
  8. Ramachandran, N., et al. Self-assembling protein microarrays. Science. 305 (5680), 86-90 (2004).
  9. Festa, F., et al. Robust microarray production of freshly expressed proteins in a human milieu. Proteomics Clinical Applications. 7 (5-6), 372-377 (2013).
  10. Yazaki, J., et al. Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (29), E4238-E4247 (2016).
  11. Rauf, F., et al. Ibrutinib inhibition of ERBB4 reduces cell growth in a WNT5A-dependent manner. Oncogene. 37 (17), 2237-2250 (2018).
  12. Anderson, K. S., et al. Protein microarray signature of autoantibody biomarkers for the early detection of breast cancer. Journal of Proteome Research. 10 (1), 85-96 (2011).
  13. Wang, J., et al. Plasma Autoantibodies Associated with Basal-like Breast Cancers. Cancer Epidemiol Biomarkers Prevention. 24 (9), 1332-1340 (2015).
  14. Bian, X., et al. Tracking the Antibody Immunome in Type 1 Diabetes Using Protein Arrays. Journal of Proteome Research. 16 (1), 195-203 (2017).
  15. Song, L., et al. Identification of Antibody Targets for Tuberculosis Serology using High-Density Nucleic Acid Programmable Protein Arrays. Molecular and Cellular Proteomics. 16 (4 suppl 1), S277-S289 (2017).
  16. Wang, J., et al. Comparative Study of Autoantibody Responses between Lung Adenocarcinoma and Benign Pulmonary Nodules. Journal of Thoracic Oncology. 11 (3), 334-345 (2016).
  17. Montor, W. R., et al. Genome-wide study of Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein immunogenicity using self-assembling protein microarrays. Infection and Immunity. 77 (11), 4877-4886 (2009).
  18. Tang, Y., Qiu, J., Machner, M., LaBaer, J. Discovering Protein-Protein Interactions Using Nucleic Acid Programmable Protein Arrays. Current Protocols in Cell Biology. 74, 11-15 (2017).
  19. Yu, X., et al. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (click chemistry)-based detection of global pathogen-host AMPylation on self-assembled human protein microarrays. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (11), 3164-3176 (2014).
  20. Anderson, K. S., et al. Autoantibody signature for the serologic detection of ovarian cancer. Journal of Proteome Research. 14 (1), 578-586 (2015).
  21. Woyach, J. A., Johnson, A. J., Byrd, J. C. The B-cell receptor signaling pathway as a therapeutic target in CLL. Blood. 120 (6), 1175-1184 (2012).
  22. Smith, M. R. Ibrutinib in B lymphoid malignancies. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 16 (12), 1879-1887 (2015).
  23. Festa, F., Steel, J., Bian, X., Labaer, J. High-throughput cloning and expression library creation for functional proteomics. Proteomics. 13 (9), 1381-1399 (2013).
  24. Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Research. 42, D1253-D1260 (2014).

Tags

Biokemi selv monterede protein mikroarrays Drug screening protein kinase assay tyrosinkinasehæmmere High-gennemløb screening skærm af kinasehæmmere NAPPA protein mikroarray
Kinasehæmmer screening i selv monterede humane protein mikrosystemer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Festa, F., Labaer, J. Kinase… More

Festa, F., Labaer, J. Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays. J. Vis. Exp. (152), e59886, doi:10.3791/59886 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter