Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kinase inhibitor screening i selv-monterte Human protein Microarrays

Published: October 23, 2019 doi: 10.3791/59886
Automatic Translation
1,2, 1
1Virginia G. Piper Center for Personalized Diagnostics, Biodesign Institute, Arizona State University, 2Department of Pediatrics, and Biochemistry/Molecular Biology, College of Medicine, Pennsylvania State University

Summary

En detaljert protokoll for generering av selv-monterte humant protein Microarrays for screening av kinase hemmere presenteres.

Abstract

Screening av kinase hemmere er avgjørende for bedre forståelse egenskaper av et medikament og for identifisering av potensielt nye mål med kliniske implikasjoner. Flere metoder har blitt rapportert å utføre en slik screening. Men hver har sine egne begrensninger (f. eks, screening av bare ATP analoger, begrensning til å bruke renset kinase domener, betydelige kostnader forbundet med testing mer enn noen få kinaser om gangen, og mangel på fleksibilitet i screening protein kinaser med romanen mutasjoner). Her, en ny protokoll som overvinner noen av disse begrensningene og kan brukes til objektiv screening av kinase hemmere presenteres. En styrke av denne metoden er dens evne til å sammenligne aktiviteten til kinase hemmere over flere proteiner, enten mellom ulike kinaser eller ulike varianter av samme kinase. Self-monterte protein Microarrays generert gjennom uttrykk for protein kinaser av en menneske-basert in vitro transkripsjon og Oversettelses system (IVTT) er ansatt. Proteinene som vises på Microarray er aktive, noe som åpner for måling av virkningene av kinase hemmere. Følgende fremgangsmåte beskriver protokoll trinnene i detalj, fra Microarray generering og screening til dataanalysen.

Introduction

Protein kinaser er ansvarlig for fosforylering av sine mål og kan modulere komplekse molekylære veier som styrer mange cellulære funksjoner (dvs. celle spredning, differensiering, celle død og overlevelse). Dereguleringen av kinase aktivitet er forbundet med mer enn 400 sykdommer, noe som gjør kinase hemmere en av de viktigste klassene av legemidler tilgjengelig for behandling av flere sykdommer, inkludert kreft, hjerte-og nevrologiske lidelser, samt inflammatoriske og autoimmune sykdommer1,2,3.

Med bruk av presisjon medisin, identifisering av nye terapier, spesielt kinase hemmere, har stor appell farmasøytisk og klinisk. Flere tilnærminger kan brukes for identifisering av mulige nye par kinase/kinase hemmere, inkludert de Novo design av kinase hemmere og identifisering av nye mål for eksisterende FDA-godkjente legemidler. Sistnevnte er spesielt attraktivt, siden den tid og penger som kreves for å gjennomføre disse stoffene i klinikker er drastisk redusert på grunn av tilgjengeligheten av tidligere klinisk utprøving data. Et Kanonisk eksempel på gjenbruk av en kinase inhibitor er Imatinib, opprinnelig designet for behandling av Kronisk myelogen leukemi (KML) gjennom hemming av BCR-ABL, som også kan med hell brukes til behandling av c-Kit over-uttrykker gastrointestinale stromal svulster (GIST)4,5,6,7.

Screening av kinase hemmere kan utføres i bindende analyser eller enzymatisk-baserte analyser. Den første klassen av analyser fokuserer på protein-interaksjoner og kan gi informasjon som ligation området og affinitet. Siden aktiviteten av kinase på tidspunktet for disse analysene er ukjent, kan en rekke interaksjoner bli savnet eller feilaktig identifisert på grunn av conformational endringer i proteinet. På den annen side, enzymatisk-baserte analyser krever proteinet kinaser å være aktiv og gi verdifull informasjon om hemmer effekt på enzym aktivitet, men denne typen screening er generelt mer tidkrevende og dyrt. For øyeblikket er begge typer analyser kommersielt tilgjengelig fra flere kilder. De representerer en pålitelig alternativ for screening av kinase hemmere med noen begrensninger, blant annet: I) de fleste av metodene innebærer testing av flere kinaser individuelt, noe som kan gjøre screening av et stort sett med proteiner kostbare; II) settet av kinaser som skal testes er begrenset til en liste over forhåndsvalgt, vill-type kinaser og flere velkjente mutert versjoner av noen kinaser, hindrer testing av mange nye muterte isoformene.

I denne sammenheng, protein Microarrays er en kraftfull plattform dugelig av overvinne noen av begrensningene forevist av kommersielt anvendelig teknikker. Det er egnet til å utføre enzymatisk analyser i høy gjennomstrømming screening ved hjelp av full lengde, aktive proteiner av noen sekvens av interesse. Microarrays kan genereres av en selv-montert tilnærming som NAPPA (nukleinsyre acid programmerbare protein array), der proteiner uttrykkes akkurat i tide for analysene, øke sannsynligheten for at de som vises på matrisen er faktisk aktiv. Proteinene som vises på NAPPA er produsert ved hjelp av menneskeskapte ribosomer og Anstandsdame proteiner for å forbedre sannsynligheten for naturlig folding og aktivitet.

Proteinene er i utgangspunktet programmert ved å skrive ut cDNAs koding for gener av interesse smeltet sammen med en fangst kode, med en fangst agent, på Microarray overflaten. Proteinene produseres deretter på Microarrays ved hjelp av en in vitro-transkripsjon og oversettelse (IVTT)-system, og de nylig uttrykte proteinene er immobilisert på den Microarray overflaten av fangst agenten. Uttrykt NAPPA arrays kan brukes til studiet av proteiner som vises på matrisen i en objektiv, høy gjennomstrømming måte8,9.

Tidligere ble det vist at proteiner som vises på NAPPA arrays er foldet riktig å samhandle med kjente partnere10; Videre ble deres enzymatisk aktivitet først utnyttet i 2018, da det ble vist at protein kinaser vises på Microarray autophosphorylate11. Hittil har NAPPA metodikk blitt brukt i mange forskjellige anvendelser, inkludert biomarkør Discovery12,13,14,15,16,17, Protein-protein interaksjoner10,18, substrat identifisering19, og narkotika screening11. Fleksibiliteten er en av de viktigste kjennetegnene i plattformen som gjør det mulig å tilpasse dem til hvert enkelt program.

Her presenteres en protokoll for screening av tyrosin kinase hemmere i selv-monterte NAPPA arrays. Plattformen er optimalisert for visning av aktive humane protein kinaser og for analyse av protein kinase aktivitet, med lav bakgrunn og høy dynamisk område. Blant de modifikasjoner iverksatt for å bruke NAPPA for screening av kinase hemmere inkluderer: I) endringer i utskrift kjemi, II) de-fosforylering av proteinet Microarray før kinase hemmer screening, og III) optimalisering av påvisning av fosforylert proteiner på matrisen. Denne protokollen er den første i sitt slag og gir unik informasjon om kinase studien i NAPPA Microarrays.

Protocol

1. vanlige buffere og løsninger som skal brukes

  1. Forbered TB medium: fantastisk buljong (24 g/L gjærekstrakt; 20 g/L tryptone; 4 mL/L glyserol; 0,017 M KH2PO4; og 0,072 M K2HPO4). 0,017 M KH2PO4 og 0,072 M k2HPO4 løsninger kan kjøpes som en 10x fosfat buffer (0,17 m KH2PO4 og 0,72 m k2HPO4).
  2. Forbered LB medium: Luria-Bertani (5 g/L gjærekstrakt; 10 g/L tryptone; og 10 g/L NaCl). Juster pH til 7,0 med 5 M NaOH.
  3. Forbered 1x TBS: Tris-bufret saltvann (TBS: 50 mM Tris-CL, pH = 7,5; 150 mM NaCl).
  4. Forbered 1x TBST: TBS supplert med 0,1% mellom 20.

2. DNA forberedelse

Merk: DNA benyttet for NAPPA arrays må være svært ren; kommersielle DNA-forbereder er derfor ikke anbefalt. Foreløpig er to protokoller for DNA forberedelse brukes: i huset høy gjennomstrømming mini-prep (beskrevet her) eller kommersielle MIDI-eller Maxi-prep. Den gjennomsnittlige gjennomstrømningen av in-House mini-prep protokollen er 1 500 prøver en dag per person.

  1. Bakteriell vekst for in-House høy gjennomstrømming mini-prep
    1. Forbered LB/agar Omni plate. Pour 30 – 40 mL LB agar (1,5% bakteriologiske agar i LB Media supplert med antibiotikaresistens for valg av positive kloner) i hver enkelt brønn plate.
    2. Spot glyserol aksjer på LB/agar plate. Fortynne glyserol i LB Media (1:300, vanligvis 2 μL i 600 μL av LB). Rist i 10 min. spot 3 μL av den fortynnede massen på LB/agar plate. Ruge ved 37 ° c, opp-ned, over natten.
    3. Vaksinere kulturer. Ved hjelp av 96-PIN-enheten som ble sterilisert i 80% etanol og flamme, vaksinere kulturen fra agar plate i en dyp-brønn blokk med 1,5 mL per brønn på TB medium supplert med antibiotika.
    4. Ruge kulturer. Dekk blokken med en gass gjennomtrengelig forsegling og ruge i 22 – 24 timer ved 37 ° c, 300 – 800 RPM avhengig av shaker.
      Merk: Shakers satt til 800 rpm er optimale for denne inkubasjons. Bruk av en langsommere hastighet shaker kan resultere i mindre tette kulturer og lavere DNA rensing gir.
    5. Pellet kulturer. Spin blokker ved 3 800 x g og 4 ° c i 30 min. kast supernatanten.
  2. Mini prep med høy gjennomstrømming i huset
    Merk: flerkanals repetisjonspipetter eller automat dispensere kan brukes til å utføre mini prep i huset med høy gjennomstrømming. Hvis du bruker en automatisk dispenser, må du sørge for å rengjøre systemet før bruk og i mellom løsninger.
    1. Forbered alle løsningene som brukes under mini-prep:
      1. Klargjør løsning 1: TE-blanding buffer (50 mM Tris, pH = 8,0; 10 mM EDTA, pH = 8,0; 0,1 mg/mL RNAse). Oppbevares ved 4 ° c.
      2. Klargjør løsning 2: NaOH/SDS lyseringsbuffer (0,2 M NaOH; 1% SDS). For bedre resultater, en frisk fremstilt løsning burde bli brukt.
      3. Klargjør løsning 3: KOAC nøytralisering buffer (2,8 M KOAc). Juster pH i oppløsningen til 5,1 med isbre eddiksyre. Oppbevares ved 4 ° c.
      4. Klargjør løsning N2: likevekts buffer (100 mM Tris; 900 mM KCl; 15% EtOH; 0,15% Triton X-100). Juster pH i oppløsningen til 6,3 med fosfors syre.
      5. Klargjør løsning N3: bash buffer (100 mM Tris; 1,15 M KCl; 15% EtOH). Juster pH i oppløsningen til 6,3 med fosfors syre.
      6. Klargjør løsning N5: eluering buffer (100 mM Tris; 1 M KCl; 15% EtOH). Juster pH i oppløsningen til 8,5 med fosfors syre.
        Merk: vellykket kontroll av DNA binding, vasking, og eluering under anion utveksling er svært avhengig av buffer KCl konsentrasjon og pH-verdier. Forsiktig buffer komponent målinger og pH-justering er avgjørende. Små avvik fra de beskrevne målingene kan føre til betydelig tap av avkastning.
    2. Re-suspendere pellet. Tilsett 200 μL av oppløsning 1 og rist på 2 000 RPM i 5 min ved RT. komplett re-suspensjon av pellet er nødvendig for vellykket lyse. Vortex blokken om nødvendig.
    3. Lyse bakterier. Tilsett 200 μL av løsning 2, forsegle platen med en aluminiumsforsegling og invertere 5x. Nøye tid dette trinnet fra begynnelsen av løsning 2 tillegg. Må ikke overstige 5 min.
    4. Nøytralisere løsningen. Tilsett 200 μL av oppløsning 3, forsegle platen med en aluminiumsforsegling og invertere 5x. Forseglingen kan være løs på grunn av lyse/nøytralisering buffere, så vær forsiktig når du invertere. En delvis inversjon, der løsningen aldri berører forseglingen, anbefales å hindre krysskontaminering blant prøvene.
    5. Tøm lysat. Sentrifuger platene ved 3 800 x g og 4 ° c i 30 min.
    6. Forbered anion utveksling harpiks slurry under lysat pelleting sentrifugering trinn. Bruk en 1 L flaske, fyll den med den anion bytte harpiks til den når 300 mL merket, og legg deretter til løsning N2 opp til 900 mL.
      FORSIKTIG: dette trinnet bør gjøres i panseret for å beskytte mot silika innånding.
    7. Forbered anion utveksling harpiks plater. Stable filter platene på toppen av en dyp brønn blokk for å fungere som avfalls innsamlings fartøy. Bland anion utveksling slurry til den er homogen, og hell i et glass trau. Ved hjelp av bred-kjeder P1000 tips, overføre 450 μL av slurry i hver brønn av filter platene.
    8. Sentrifuger stablet plater (harpiks plate/dyp brønn plate) ved langsom akselerasjon i 5 min ved 130 x g og RT. kast flyten gjennom.
    9. Overfør lysat supernatanten til harpiks platen/dype brønn blokk stabler. Snurr de stablede platene i 5 minutter ved 30 x g med langsom rampe hastighet.
    10. Vask søylen. Tilsett 400 μL oppløsning N3 (vaskebuffer) til hver brønn. Overfør harpiks platen til vakuum manifold for å fjerne vaske bufferen. Gjenta vaske trinnene 3x. På den siste vasken, sørg for at alle brønnene er riktig tømt. Snurr stabel platene på 150 x g i 5 min for å fjerne eventuell gjenværende buffer.
    11. Eluere DNA. Sett harpiks platen på en ren 800 μL oppsamlings plate. Tilsett 300 μL av oppløsning N5 til hver brønn. La den sitte ved RT i 10 min, og deretter spinne stablet platene i 5 min ved 20 x g med langsom rampe opp hastighet. Snurr de stablede platene i 1 min ved 233 x g.
    12. Kvantifisere DNA og lagre plater ved-20 ° c inntil videre bruk eller gå rett til DNA-utfelling.
      Merk: det er nødvendig med minst 30 mikrogram DNA per prøve. Hvis DNA yield er lav, anbefales det å gjenta DNA mini-prep, eller alternativt kombinere to plater i løpet av nedbøren trinn (§ 2,3).
  3. DNA-nedbør
    1. Tin ut plater, Vortex å homogenisere DNA-løsningen, og spinne på 230 x g for 30 s for å samle alle løsning i bunnen av brønnen.
    2. Tilsett 40 μL av 3 M NaOAc og 240 μL av isopropanol i hver brønn. Dekkplaten med en aluminiumsforsegling og bland med invertere 3x.
    3. Sentrifuger platene i 30 minutter ved 3 800 x g og 25 ° c. Kast forsiktig supernatanten.
      Merk: for å kombinere to plater, Overfør DNA fra den andre platen til pellet fra første plate og gjenta trinn 2.3.2 – 2.3.3.
    4. Vask og utløse DNA. Tilsett 400 μL av 80% etanol til hver brønn. Tetnings plater med aluminiumsforsegling og rist på 1 000 RPM i 30 min. sentrifuger ved 3 800 x g i 30 min ved 25 ° c. Kast supernatanten.
    5. Tørk DNA-pellets. Plasser platene opp-ned i en vinkel på papirhåndklær og la dem tørke i 1-2 timer, inntil ingen alkohol er til stede på bunnen av brønnen. Seal og sentrifuger på 230 x g for 2 min for å bringe noen pellets ned.
    6. Når platene er tørre, enten forsegle med aluminium segl og fryse ved-20 ° c for senere bruk eller fortsette å resuspend DNA (trinn 4,1).

3. aminosilanbehandlede Slide belegg

  1. Plasser glass lysbildene i metall stativet. Inspiser hvert lysbilde visuelt for å forsikre at det ikke finnes riper eller ufullkommenheter.
  2. Senk lysbildene i belegget løsning (2% aminosilanbehandlede reagens i aceton) i 15 minutter mens rocking. Den aminosilanbehandlede løsningen kan brukes til å belegge to stativer på 30 lysbilder hver før den må kastes.
  3. Skyll trinn. Senk raset stativet i aceton vask (99% aceton), rist frem og tilbake, deretter opp og ned raskt 5x. Vipp til et hjørne for å dryppe av, og senk i Ultrarent vann opp og ned raskt 5x. Vipp av, og legg deretter på servietter.
    Merk: aceton vask kan brukes to ganger, mens det ultrarent vannet må skiftes hver gang.
  4. Dry lysbilder med presset luft, blåser på dem fra alle vinkler i ca 3 min til alle vanndråper har blitt fjernet. Oppbevar de belagte lysbildene på RT i et metallstativ inne i en tett lukket boks.

4. matrise prøveforberedelse

  1. Resuspend DNA pellet fra in-House mini-prep (trinn 2.3.6) i 20 μL av ultrarent vann og rist på 1 000 RPM for 2 t. For MIDI/Max prep DNA, fortynne hver prøve til en endelig konsentrasjon av 1,5 μg/μL og overføre 20 μL til en 800 μL oppsamlings plate.
  2. Forbered utskrift mix. For 1 96 brønn plate, klargjør du 1 mL utskrifts blanding [237,5 μL av ultrarent vann; 500 μL av Poly-lysin (0,01%), 187,5 μL av BS3 (BIS-sulfosuccinimidyl, 50 mg/mL i DMSO), og 75 μL av polyklonale anti-flagg kanin antistoff)].
    Merk: kjemikaliene skal legges til i den spesifiserte rekkefølgen for å unngå utfelling.
  3. Tilsett 10 μL av trykk blanding til hver prøve, sel plater med aluminiumsfolie, og rist på RT for 90 min ved 1 000 rpm. Oppbevar platene over natten (~ 16 timer) ved 4 ° c.
  4. På utskrift dagen, en kort Vortex og spinne platene. Overfør 28 μL av hver prøve til en 384 array plate. Denne overføringen kan gjøres ved hjelp av automatisering eller en flerkanals pipette. Det er avgjørende å holde styr på plasseringen av prøvene i 384 array plate.
  5. Snurr platen ned kort for å fjerne eventuelle bobler. Forsegle platene med folie.

5. generering av NAPPA-arrayer: Microarray utskrift

Merk: alle utskriftsforholdene er optimalisert for instrumentet som er oppført i tabell over utstyr og materialer. Hvis du bruker en annen matrise, kan det være nødvendig med ytterligere optimalisering.

  1. Arrayer rydde opp. Før oppstart, Tøm alle avfalls tanker og fyll på reservoarene med ultrarent vann eller 80% etanol, om nødvendig. Rengjør pinnene en etter en med lofri våtservietter og ultrarent vann. Tørk pinnene med lo frie kluter og legg dem forsiktig tilbake i arrayer hode.
  2. Arrayer oppsett: utskriftsspesifikasjoner [maksimalt antall stempler per håndskrift: 1; antall stempler per punkt: 1; fler stempel timing:--; stempel tid (MS): 0 MS; håndskrift tid (MS): 0 MS; utskrifts dybde justering: 90 mikron; antall berørings-offs: 0]. deretter følger du sterilisering protokoll: ultrarent vann vask for 2 000 MS med 0 MS av tørking tid og 500 MS av ventetiden; Gjenta disse trinnene 6 ganger. etterfulgt av vask med 80% etanol for 2 000 MS med 1 200 MS av tørking tid og 500 MS av ventetiden; Gjenta disse trinnene 6 ganger.
  3. Slide design: sette opp arrayer med ønsket stiller opp mønster. Designen bør ta hensyn til flere faktorer [dvs. antall replikaer for hver prøve, plassering og antall av kontrollfunksjoner, array layout (en blokk, flere identiske blokker), antall matriser som skal skrives ut, lengden på kjøringen, etc.].
  4. Plasser de aminosilanbehandlede belagte lysbildene (trinn 3,4) på arrayer Decket. Kontroller for å se om vakuumet holder alle lysbildene trygt på plass. Start Fukteren (det bør settes til 60%).
  5. Plasser 384 brønn platen på arrayer Deck. Start programmet.
  6. Merk Microarrays. Når du er ferdig med å skrive ut, plasserer du lysbilde etiketter på nederste (ikke-trykte) side av hvert lysbilde. Behold utskriftsrekkefølgen for lysbildene på aggregatet i numerisk rekkefølge.
  7. Oppbevar trykte arrayer på RT i et metallstativ inne i en tett lukket boks med en silica-pakke. Lysbilder som oppbevares i et tørt miljø, har en holdbarhet på opptil ett år.
  8. (Valgfritt): en annen gruppe med 90 lysbilder kan skrives ut ved hjelp av de samme eksemplene. For å gjøre dette, Fjern 384 brønn platen fra arrayer Decket så snart utskriften av platen er ferdig. Forsegle og lagre platen ved 4 ° c. Etter den første batch av matriser er helt ferdig, fjerne dem fra dekk, plassere nye aminosilanbehandlede belagt lysbilder og starte en ny løpe. Pass på at hver 384 brønn plate er RT i 30 minutter før bruk. Hvis mer enn fire replikaer per prøve skrives ut i en gruppe med lysbilder, anbefales det å dele 384 brønn platene i to plater for å redusere prøve fordampning ved å redusere tiden som brukes på det arrayer dekket.
    Merk: Kontroller alle reservoarene før begynnelsen av den andre løpeturen.

6. påvisning av DNA på NAPPA lysbilder

  1. Blokker lysbildene. Plasser lysbildene i en pipette-boks og Legg til 30 mL blokkerings buffer. Ruge på RT for 1 time på en rocking shaker.
  2. Flekker på lysbildene. Kast blokkerings løsningen og tilsett 20 mL blokkerings buffer og 33 μL av fluorescerende DNA-interkalering fargestoff. Ruge i 15 minutter med agitasjon. Deretter kan du raskt skylle lysbildene med ultrarent vann og tørk med presset luft. Fortsett med skanningen (avsnitt 11).

7. uttrykk for NAPPA-lysbilder

  1. Blokker lysbildene med blokkerings buffer på en rocking shaker ved RT for 1 t. Bruk ca. 30 mL i en pipette boks for fire lysbilder.
  2. Skyll lysbildene med ultrarent vann og tørk med filtrert trykkluft. Påfør tetnings pakning på hvert lysbilde i henhold til produsentens anvisninger.
  3. Legg til IVTT mix. Hvert lysbilde vil kreve 150 μL av IVTT mix. Fortynne 82,5 μL av HeLa lysat i 33 μL av DEPC vann og supplere med 16,5 μL av tilbehør proteiner og 33 uL av reaksjons miks. Legg til IVTT-miks fra den ikke-etikett-eller ikke-prøve enden. Pipetter blandingen sakte (det er akseptabelt hvis det perler opp midlertidig ved innløpet). Masser tetnings pakningen forsiktig slik at IVTT-blandingen sprer seg og dekker hele området av matrisen. Påfør små runde port sel til begge portene.
  4. Plasser lysbildene på en støtte og overføre dem til programable Chilling inkubator. Ruge for 90 min ved 30 ° c for protein uttrykk, etterfulgt av 30 min ved 15 ° c for immobilisering av spørrings proteinet.
  5. Vask og blokker lysbildene. Fjern tetnings pakningen og dypp lysbildene i en pipette boks med ca 30 mL 1x TBST supplert med 5% melk for protein display (§ 8) eller 1x TBST supplert med 3% storfe serum albumin (BSA) for kinase analyser eller narkotika screening (§ 9). Ruge på RT med omrøring i 20 min og gjenta dette trinnet 2x.

8. påvisning av proteiner på NAPPA-arrayer

  1. Legg til primært antistoff. Fjern lysbildene fra blokkerings løsningen (trinn 7,5) og tørk forsiktig av baksiden (ikke-trykt side) ved hjelp av et papir håndkle. Plasser lysbildene på en støtte og påfør 600 μL av primære antistoff (mus anti-flagg) fortynnet 1:200 i 1x TBST + 5% melk. Ruge for 1 time ved RT.
  2. Vask lysbildene med 1x TBST + 5% melk på en rocking shaker (3x for 5 min hver).
  3. Legg til sekundært antistoff. Fjern lysbildene fra vaskeløsningen og tørk forsiktig av baksiden ved hjelp av papir håndkle. Legg lysbildene på en støtte og påfør 600 μL av sekundært antistoff (cy3-labbeled antistoff) fortynnet 1:200 i 1x TBST + 5% melk. Beskytt lysbildene fra lys og ruge for 1 time ved RT.
  4. Vask lysbildene med 1x TBST på en rocking shaker (3x for 5 min hver). Skyll raskt lysbildene med ultrarent vann og tørk med presset luft. Fortsett med skanningen (avsnitt 11).

9. tyrosin kinase inhibitor screening på NAPPA arrays

Merk: flere lysbilder kan behandles i samme eksperiment, men sørg for at ett lysbilde behandles om gangen i hvert trinn, og at de ikke tørker mellom trinnene. Legg til alle løsninger på en ikke-etikett-eller ikke-prøve-enden av lysbildet.

  1. Forbered alle løsningene som brukes under narkotika screening:
    1. Forbered fosfatase/DNase-løsningen ved å kombinere følgende: 1x protein metallo-phosphatases buffer (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,01% Brij 35 ved pH = 7,5); 1 mM MnCl2; 8 000 enheter av lambda protein fosfatase; og 2 enheter av DNase I. klargjør 400 μL av oppløsningen for hver Microarray. Legg fosfatase og DNase like før bruk.
    2. Gjør stoffet fortynning. Narkotika er rekonstituert i DMSO til en endelig konsentrasjon på 10 mM. For å sikre at alle medikament konsentrasjoner testet på array, sørge for at det samme volumet av DMSO (en 10, 000x lager i DMSO) er opprettet for hver konsentrasjon og holdt på-80 ° c. På tidspunktet for bruk, er narkotika fortynnet 1:100 i vann.
    3. Forbered narkotika/kinase løsning ved å kombinere følgende: 1x kinase buffer (25 mM Tris-HCl av pH = 7,5); 5 mM beta-glycerophosphate; 2 mM DTT; 0,1 mM na3VO4; 10 mM MgCl2; 500 μM ATP; og 2 μL av legemiddel (fortynnet 1:100 i vann). Klargjør 200 μL av oppløsningen for hver Microarray.
  2. Utfør fosfatase og DNase behandling. Fjern lysbilder fra blokkerings løsningen (trinn 7,5) og tørk forsiktig av baksiden ved hjelp av papir håndkle. Plasser lysbildene på støtte og påfør 200 μL av fosfatase/DNase-løsning. Plasser en Microarray dekkglass for å unngå fordamping. Ruge ved 30 ° c for 45 min i ovnen.
  3. Fosfatase og DNase behandling II: Fjern matriser fra ovnen, kast dekkglass, Fjern overflødig oppløsning og påfør 200 μL av fersk fosfatase og DNase-løsning. Dekk Microarrays med dekkglass og ruge for en annen 45 min ved 30 ° c i ovnen.
  4. Vask lysbildene med 1x TBST + 0,2 M NaCl på en rocking shaker (3x for 5 min hver).
  5. Utfør medikament behandling og kinase reaksjon. Fjern lysbildene fra vaskeløsningen og tørk forsiktig av baksiden med et papir håndkle. Plasser lysbildene på støtte og påfør 200 μL av stoff-kinase løsning. Plasser en dekkglass på toppen for å unngå fordamping. Ruge for 1 t ved 30 ° c i ovnen.
  6. Vask lysbildene med 1x TBST + 0,2 M NaCl på en rocking shaker (3x for 5 min hver).
  7. Gjenta trinn 8.1 – 8.4 ved å bruke som primært antistoff anti-phosho-Tyr-antistoff fortynnet 1:100. Erstatt 1x TBST + 5% melk i alle trinn med 1x TBST + 3% BSA.

10. automatisert hybridisering protokoll

Merk: Alternativt kan en hybridisering stasjon brukes til å automatisere alle hybridizations og vasker på NAPPA arrays (avsnitt 7 – 9) og protokollen er gitt som supplerende fil 1.

11. image oppkjøpet

Merk: Microarray bilder skal anskaffes med en oppløsning på 20 mikron eller høyere.

  1. Legg Microarrays i magasinet for lysbilde holderen med proteinene vendt opp. Legg magasinet i Microarray skanneren.
  2. Velg den grønne laseren med et utslipps filter på 575/30 NM for å skanne signalet fra CY-3-merket sekundært antistoff. Hvis det brukes en annen fluoroforen, velger du riktig laser/bølgelengde for å oppdage signalet fra det fluorescerende fargestoffet.
  3. Definer navnet på hvert bilde og hvor de skal lagres.
  4. (Valgfritt): for hver nye fluoroforen anbefales det å optimalisere skanne forholdene for å oppdage den lineære rekkevidden til signal intensiteten. For å gjøre dette, skann en Microarray ved hjelp av en rekke photomultiplier (PMT) og få til et klart bilde er oppnådd med ikke-mettet signal og lav bakgrunn.
  5. Skann alle Microarrays med de optimaliserte innstillingene, og husk å slå av autogain.
    Merk: for dataanalyse bør alle Microarrays skannes med de samme skanneinnstillingene. For kinase analyser som bruker cy3 som fluoroforen, skannes bildene med 20% avdrag, laser intensitet på 25% og 10 mikron oppløsning, ved bruk av skanneren oppført i tabell over utstyr og materialer.

12. data behandling og analyse

Merk: flere programvarepakker er tilgjengelige for kvantifisering av Microarray data med lignende funksjoner. Fremgangsmåten som beskrives her, er utformet for programvaren som er oppført i tabellen over utstyr og materialer.

  1. Load TIFF-filer som skal kvantifisert, designe rutenettet for å matche Microarray layout og justere størrelsen på flekkene å innlemme hele signalet med minst mulig område. Nærliggende flekker bør ikke overlappe. Inspiser visuelt hvor godt programvaren utfører og Juster rutenettet manuelt om nødvendig.
  2. Kvantifisere signal intensiteten til Microarray. Visuelt inspisere flekker for noe unormalt (ikke-spesifikk binding, støv, etc.) og fjerne dem fra dataanalyse.
  3. Korriger bakgrunnen lokalt ved hjelp av signalet fra nærliggende områder på matrisen der ingen steder er tilstede.
  4. Normalisere data. For å sammenligne signalet på tvers av forskjellige arrayer, må signal intensiteten til hver Microarray bli normalisert. For å utelukke eventuelle outliers, normalisere dataene ved hjelp av trimmet bety 30% av signalet fra den positive kontrollen (IgG flekker) av dephosphorylated Microarrays.
    Merk: signalet fra IgG stedet endres ikke under fosforylering og defosforylering av Microarrays og er egnet for normalisering.
  5. Identifiser aktive kinaser. For hver funksjon som vises på Microarray, beregne forholdet mellom normalisert signal intensitet i autophosphorylated og dephosphorylated matriser. Angi en terskel på 1,5-fold endring for identifisering av den aktive kinaser og merke alle de andre funksjonene som ikke kan gjennomgå reseptorautofosforylering (N/A).
  6. Beregn aktiviteten til hver kinase identifisert i trinn 12,5 som en prosent av justert signal (signal intensiteten av normalisert positiv kontroll array (DMSO) trekkes av signalet intensiteten av normalisert negativ kontroll array (dephosphorylated).

Representative Results

Selv monterte NAPPA-Microarrays gir en solid plattform som kan brukes til mange forskjellige bruksområder, inkludert biomarkør-oppdagelse, protein-protein-interaksjoner, substrat identifisering og legemiddel screening10,11 ,12,13,14,15,16,17,18,19,20.

Den generelle metodikken som ble vedtatt for studiet av kinase aktivitet og screening av tyrosin kinaser hemmere på NAPPA Microarrays er skjematisk representert i figur 1. Først, NAPPA Microarrays er generert av immobilisering av cDNA og fange agent på belagt Microarrays. Den cDNAs blir deretter brukt som en mal for transkripsjon og oversettelse av proteiner, ved hjelp av en menneskelig-baserte IVTT system, og de nye syntetisert proteiner er immobilisert av fangst agent9. Kvaliteten på den trykte Microarray kan overvåkes ved å måle nivåene av DNA (som bekrefter konsistent utskrift) eller protein som vises på matrisen (bekrefter protein uttrykk og fangst; Figur 1). For å redusere bakgrunns signalet og øke det dynamiske spekteret av eksperimentet, behandles Microarrays med 1) lambda fosfatase for å fjerne fosforylering fra ser/THR/Tyr rester, deretter med 2) DNase for å forenkle kjemien på stedet og redusere bakgrunn (figur 1).

Det neste trinnet er reseptorautofosforylering reaksjonen, der Microarrays er inkubert med kinase buffer i fravær av ATP (negativ kontroll array, referert til som dephosphorylated Microarrays), og kinase buffer er supplert med ATP (positiv kontroll, referert til som autophosphorylated arrays) eller ATP + DMSO (kjøretøy kontroll). Det bør understrekes at i løpet av dette trinnet, er ingen kinase lagt til; Derfor er den iboende aktiviteten til hver kinase som vises på Microarray kvantifisert gjennom måling av sine fosforylering nivåer ved hjelp av et Pan anti-fosfat-tyrosin antistoff etterfulgt av et cy3-labbeled sekundær antistoff (figur 1).

Kvalitetskontroll av NAPPA-kinase arrays viser et panel av menneskelig protein kinaser trykt i quadruplicate er vist i figur 2. Nivåene av immobilisert DNA ble målt ved DNA farging og det viste et enda signal over Microarray, noe som tyder på mengden av DNA trykt på array var uniform. Det er også mulig å observere flere funksjoner uten DNA farging. Disse funksjonene tilsvarer noen kontroller der DNA ble utelatt fra utskriften Mix [dvs. tomme flekker (ingenting ble trykt), vann flekker, renset IgG spot (Poly-lysin, tverrbinder og renset IgG), utskrift Mix bare (komplett utskrift Mix: Poly-lysin pluss tverrbinder og anti-flagg antistoff, uten DNA)]. Nivåene av protein som vises på NAPPA-kinase-Microarrays ble vurdert etter IVTT-reaksjonen ved hjelp av anti-tag-antistoff.

For kinase screening, ble Flag brukt som merke valg og nivået av protein som vises på Microarray ble målt ved hjelp av et anti-flagg antistoff. Som vist, flertallet av flekker som inneholder cDNA vellykket vises synlig nivåer av protein. Noen av kontroll flekker uten cDNA også avslørt signal med anti-flagg antistoff: IgG spot (brukes til å oppdage aktiviteten til sekundær antistoff) og tomme vektor flekker (cDNA koder for koden bare) (figur 2). NAPPA-kinase Microarrays viste god reproduserbarhet blant lysbilder, med korrelasjon av nivåene av protein display blant distinkte utskrifts partier høyere enn 0,88 (figur 2). Innenfor samme batch var sammenhengen enda høyere, nær 0,92 (data ikke vist).

Deretter ble den kinase reseptorautofosforylering aktiviteten som ble vist på matrisen målt ved hjelp av anti-fosfat-tyrosin antistoff (Figur 3). Protein som vises på matrisen viste høye nivåer av protein fosforylering etter uttrykket (Figur 3, venstre), som kan være forårsaket av indre kinase aktivitet av proteinet som vises på Array eller ved aktiv kinaser STEDE i IVTT mix. Denne fosforylering ble fullstendig fjernet med lambda fosfatase behandling og disse Microarrays ble brukt for kinase analysene. Etter defosforylering, reseptorautofosforylering reaksjoner utført uten ATP viste ingen signifikante nivåer av fosforylering, som forventet, mens Microarrays inkubert med kinase buffer i nærvær av ATP viste protein fosforylering så fort som 15 min ( Figur 3). For stoffet screening, kinase aktiviteten ble målt etter 60 min av reseptorautofosforylering reaksjon for å maksimere antall kinaser testet.

Sammenligningen mellom Microarrays der fosforylering nivåene ble målt rett etter protein uttrykk (Figur 3, venstre) og etter 60 min av reseptorautofosforylering reaksjon (Figur 3, høyre) viste: i) proteiner fosforylert bare etter uttrykk, antyder de kan bli exogenously fosforylert av proteiner tilstede på IVTT mix, men kan ikke autophosphorylated; II) protein fosforylert bare etter reseptorautofosforylering reaksjon, antyder disse proteinene ikke var aktive etter protein uttrykk og nødvendige co-faktorer til stede i kinase buffer for å være aktiv; eller III) protein fosforylert på begge arrayer, noe som tyder på at de var aktive i begge innstillingene (Figur 3).

Som et eksempel på resultatene oppnådd for screening av tyrosin kinase hemmere på NAPPA-kinase arrays tre kinaser hemmere med distinkte selektivitet på tvers av protein kinaser ble brukt: staurosporine, Imatinib og ibrutinib. For alle screenings ble dephosphorylated NAPPA Microarrays inkubert med økende konsentrasjoner av TKI (fra 100 nM til 10 uM) under reseptorautofosforylering reaksjonen. Den første TKI testet var staurosporine, en global protein kinase inhibitor, som viste potent kinase hemming på Microarray tvers av nesten alle kinaser testet11.

Neste, Imatinib ble testet, en ABL og c-Kit inhibitor brukes for behandling av Kronisk myelogen leukemi og Gastrointestinal stromal svulster4,5,6,7. På NAPPA-kinase-arrayer Imatinib viste en signifikant reduksjon i Abl1 og BCR-Abl1 aktivitet mens andre kinaser forble mest upåvirket (figur 4a). Data kvantifisering for kinase aktiviteten ble normalisert mot dephosphorylated array og representert som en prosentandel av den positive kontrollen Microarray (kjøretøy bare). Data for TNK2 (ikke-relevante kinase), Abl1 og BCR-Abl1 er vist i figur 4b. Som forventet viste Imatinib selektiv hemming mot Abl1 og BCR-ABl1. Dataene for c-Kit var mangelfulle på grunn av manglende aktivitet på de positive kontroll rekkene.

Til slutt, ibrutinib, en FDA-godkjent kovalente hemmer av Bruton ' s tyrosin kinase (BTK), ble testet. Ibrutinib er i dag brukt i behandlingen av flere blod-relaterte kreftformer med overaktiv BTK, inkludert kronisk lymfatisk leukemi (CLL), mantel celle lymfom, og Waldenström's globulinemi21,22. Figur 4c, er representativt for typiske resultater oppnådd for ibrutinib screening. Den kinase aktiviteten til ABL1 (ikke-relevant kinase) og BTK (Kanonisk mål) og ERBB4 (potensielle nye mål) er vist i figur 4d. Dataene tyder på ERBB4 kan bli hemmet av ibrutinib i en dose bestemt måte. Denne hemming ble bekreftet in vitro og i celle-baserte analyser11, demonstrere kraften i denne plattformen.

Samlet, dataene tyder på at NAPPA-kinase Microarray plattform kan brukes for objektiv screening av TK-hemmere. Videre er screening rask og kan enkelt tilpasses til å inkludere enhver variant av proteinet kinaser av interesse.

Figure 1
Figur 1: skjematisk fremstilling av kvalitetskontroll og screening av tyrosin kinase hemmere i NAPPA arrays. NAPPA arrays skrives ut med cDNA koding for protein av interesse smeltet sammen med en kode og fangst antistoff. Under in vitro transkripsjon og oversettelse reaksjon (IVTT) er syntetisert proteiner fanget på Microarray overflaten gjennom koden ved fangst antistoff. Kvalitetskontrollen (QC) av arrays utføres ved måling av nivåene av DNA trykt på lysbildet, ved hjelp av et fluorescerende DNA-interkalering fargestoff, og nivåene av protein som vises på matrisen ved hjelp av tag-spesifikke antistoffer. For kinase screening behandles Microarrays med DNase og fosfatase, etter IVTT-reaksjonen, for å fjerne det trykte DNA og alle fosforylering som kan ha oppstått under proteinsyntese. De dephosphorylated arrays er nå klar til å brukes for stoffet skjermen. For hver analyse brukes tre sett med kontroller rutinemessig: (I) dephosphorylated matriser, der reseptorautofosforylering reaksjonen utføres uten ATP; (II) autophosphorylated Microarrays, der reseptorautofosforylering reaksjonen utføres i nærvær av ATP; og (III) DMSO behandlet array (kjøretøy), der reseptorautofosforylering reaksjonen er utført med ATP og DMSO. Lysbildene behandlet med ulik konsentrasjon av kinase hemmere følge nøyaktig samme protokoll som brukes for DMSO behandlet arrays. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representative resultater av kvalitetskontroll for selv MONTERTE NAPPA-kinase-matriser. DNA-innhold målt ved et fluorescerende DNA-interkalering fargestoff (venstre) og nivåer av protein som vises på Microarray målt ved anti-flagg-antistoff (midten), vises. På høyre side er en korrelasjon plott av nivåene av protein som vises på to NAPPA-kinase arrays trykt i separate partier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representative resultater av kinase aktivitet i NAPPA-kinase arrays. Microarrays viser protein kinaser i quadruplicate ble brukt til å studere protein kinase aktivitet på matrisen gjennom måling av protein fosforylering ved hjelp av anti-pTyr antistoff, etterfulgt av cy3-merket anti-mus antistoff. Kontroll arrays uten fosfatase/DNase behandling og uten ATP under reseptorautofosforylering reaksjonen ble brukt til å måle bakgrunnen fosforylering etter protein uttrykk (post-uttrykk). De resterende Microarrays ble behandlet med fosfatase/DNA, og reseptorautofosforylering reaksjonen ble utført uten ATP (dephosphorylated Microarray, negativ kontroll) eller med ATP (autophosphorylated Microarrays). For autophosphorylated Microarrays ble reseptorautofosforylering reaksjonen utført i 15 min, 30 min, 45 min eller 60 min, som vist. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: representative data fra tyrosin kinase skjerm på NAPPA-kinase-matriser. (A) fosfatase/DNase-behandlede NAPPA-kinase-matriser ble inkubert i økende konsentrasjoner av Imatinib under den reseptorautofosforylering reaksjonen, og kinase aktiviteten ble målt med anti-fosfat-Tyr antistoff. (B) kvantifisering av kinase aktivitet OBSERVERT på NAPPA-kinase arrays eksponert for Imatinib. Data ble normalisert mot signalet av de negative kontroll arrays (dephosphorylated) og det er vist som en prosentandel av de positive kontroll arrays (autophosporylation reaksjon utført i nærvær av DMSO). Lignende data vises for screening av ibrutinib (C, D). Dette tallet har blitt modifisert fra Rauf et al.11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tilleggsfil 1. Alternativ protokoll for screening av tyrosin kinase hemmere i NAPPA arrays ved hjelp av en automatisert hybridisering stasjon. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Modifikasjoner og feilsøking
Under optimaliserings fasen av studiet av kinase aktivitet på NAPPA-arrayer, var en av de viktigste kildene til bakgrunn og lavt dynamisk område observert BSA som brukes på trykk blandingen. BSA sørget for den primære aminer som var nødvendig for Cross Linking med aminosilanbehandlede overflate, og var fangst av DNA og fangst antistoff på stedet. BSA er imidlertid svært fosforylert, noe som gjør det vanskelig å oppdage reseptorautofosforylering signalet på matrisen over bakgrunnsstøyen. For å løse dette problemet, ble flere alternativer for BSA i utskriften Mix testet, og Poly-lysin ble identifisert som god erstatning. Poly-lysin mangler noen fosforylering nettsted; Derfor er bakgrunnen fra ikke-uttrykte matriser svært minimal. Videre er Microarrays trykt med Poly-lysin reproduserbar og vise gode nivåer av proteiner (figur 2).

Den neste kritiske modifikasjon utført på standard NAPPA analysen var tillegg av en fosfatase/DNase behandling trinn. Behandlingen av Microarrays med fosfatase gjør det mulig å fjerne eventuelle fosforylering som oppsto i IVTT-miksen under proteinsyntese og fangst (Figur 3). Kilden til denne fosforylering kan være fra indre reseptorautofosforylering aktivitet eller fra aktiviteten av kinaser tilstede i IVTT mix. Fjerningen av alle fosforylering etter uttrykk tillot enkel identifisering av kinaser som er aktive og kan gjennomgå reseptorautofosforylering (Figur 3).

Kritiske trinn i protokollen
NAPPA er en robust teknologi, men som forventet, er det flere kritiske trinn. Den første er oppkjøpet av høykvalitets DNA i riktig konsentrasjon. Ved hjelp av DNA av dårlig kvalitet eller i lave konsentrasjoner vil generere dårlig kvalitet Microarrays med flere funksjoner som ikke uttrykkes og vises i de aktuelle nivåene, redusere antall proteiner analysert på array. Det andre kritiske trinnet er uttrykket av proteiner på Microarray. Bruken av en IVTT system som vil uttrykke høye nivåer av funksjonell protein er avgjørende for å studere kinase aktivitet på array.

Det neste kritiske trinnet på TKI-screening er hvordan Microarrays håndteres. Microarrays skal ikke tørke under et hvilket som helst trinn av protokollen, og skånsom håndtering anbefales for å unngå riper som kan øke bakgrunns signalet. Siden arrays fra hele eksperimentet vil bli sammenlignet mot hverandre, er det viktig å sikre at hvert inkubasjons trinn er selv på tvers av alle lysbildene. Tiden det tar å utføre ett trinn i en enkelt matrise, bør for eksempel tas i betraktning når en bunke med 20 matriser behandles for å forhindre forskjeller i lengden på inkubasjons på tvers av matriser.

Til slutt er utformingen av eksperimentet og inkluderingen av både positive og negative kontroller avgjørende for kvalitetskontroll og dataanalyse. Det første settet med kontroller er de som skrives ut i hver matrise og inneholder negative kontroller [dvs. tomme flekker (uten materiale trykt), vann eller tom vektor (bare uttrykke koden)], samt en positiv kontroll (dvs. renset IgG, som oppdages av antistoff og er inert til endring i fosforylering nivåer). Samlet måler de bakgrunns nivåene i Microarray, mulige carryover under utskrift og signal intensiteten til deteksjons metoden.

Det neste settet med kontroller er stoffet screening kontroller og inkluderer dephosphorylated og autophosphorylated Microarrays (i nærvær eller fravær av DMSO). Som nevnt tidligere, måler dephosphorylated Microarray nivået av fosforylering etter fosfatase behandling og derfor Baseline nivå for alle andre eksperimenter. Jo lavere grunnlinje nivået er, jo høyere er det dynamiske spekteret av analysene. Den autophosphorylated arrays presentere maksimal fosforylering nivåer av alle arrays og signalet skal være sterk og klar. Den brukes for dataanalyse, men også som en kontroll at alle reaksjonene ble utført med suksess på array.

Begrensninger av teknikken
Som nå, en av begrensningene i stoffet screening presenteres her er dens evne til skjermen bare protein kinaser som kan autophosphorylated. En mulig måte å overvinne dette på er å skrive ut en kinase og et kjent substrat på samme sted. Co-utskrift av DNA for to forskjellige proteiner ble vellykket gjennomført15, antyder muligheten for denne tilnærmingen. Dess, proteinet som vises på matrisen kan ikke brettes riktig resulterer i et inaktivt protein. Bruken av menneskelig-baserte uttrykket system gjorde en betydelig forbedring i kinase aktivitet målt på array; men noen proteiner fortsatt ikke kan analyseres på matrisen på grunn av inaktivitet sin.

En annen begrensning er måling av fosforylering ved hjelp av et Pan anti-fosfat-Tyr-antistoff. Til tross for sin ikke-spesifisitet om motivet av fosforylering området, alle målte phosphorylations skjedde på tyrosin rester, etterlot serines og threonines og deres respektive kinaser. Hittil har mer enn 10 Pan fosfat-ser/THR antistoffer blitt testet uten suksess, til tross for flere forsøk på å optimalisere inkubasjons og vasking forhold. Et nytt deteksjons system som er uavhengig av antistoffer, kan være det beste alternativet for å utvide antall protein kinaser som kan undersøkes for narkotika hemming. I denne sammenhengen er noen alternativer tilgjengelige, inkludert radioaktivitet eller kjemiske tilnærminger som Klikk Bøyning. En rekke optimaliseringer er nødvendig for å minimere bakgrunns signalet og gi et godt dynamisk område for analysene.

Den tredje begrensningen er oppkjøpet av cDNA kloner som skal skrives ut på matrisen. Den cDNA kloner kan genereres ved hjelp av noen kloning teknikk inkludert områdespesifikke rekombinasjon systemer, for eksempel Creator eller gateway23. Et annet alternativ er å kjøpe kloner fra DNAsu biblioteket, finnes på < https://dnasu.org/DNASU/Home.do >, der mer enn 17 000 cDNAs kloner, inkludert hele den menneskelige kinome, er lett tilgjengelig for å brukes til bygging av NAPPA arrays24 .

Den fjerde begrensningen er at ikke alle laboratorium er utstyrt med riktig utstyr for å dikte og skjermen sin egen NAPPA arrays. Denne protokollen gir alternative metoder for å generere DNA som skal skrives ut på Microarray, uten behov for høy gjennomstrømming utstyr, og protokoller for å manuelt utføre alle de hybridisering trinnene. Imidlertid, adgang å en arrayer og Microarray skanner er fremdeles på krevd. Ettall valgmuligheten å seire over denne utsendelse er å bruk det NAPPA kjernen service og Letter, grunnlegge for < http://nappaproteinarray.org/>, hvilke fordeler tilpasses NAPPA Microarrays for en ingen-profitt akademiker pris. Til slutt, som av noen screening metodikk, dataene innhentet på arrays er mottakelige for å være gjenstander (enten positive eller negative) og derfor bør valideres ved hjelp av ortogonale analyser.

Betydning med hensyn til eksisterende metoder
Flere plattformer er tilgjengelig kommersielt for screening av protein kinaser. En tilnærming som rutinemessig brukes er bindende analyser, som kan utføres med protein fragmenter, kinase domene, større protein fragmenter med kinase domene og noen regulatoriske regioner, og til og med full-lengde proteiner. Proteinene er vanligvis uttrykt i bakterielle systemer på grunn av kostnader og enkelhet i uttrykket og rensing protokoller. Samspillet mellom stoffet av interesse og proteinet blir deretter målt med noen type rapport analysen som fluorescens eller tilstedeværelse av koder, for eksempel. Den viktigste begrensningen av dette sett av tilnærminger er det faktum at proteinet ikke nødvendigvis er aktiv under interaksjon med stoffet, som kan resultere i identifisering av falske positive og falske negative interaksjoner. Protein fragmenter er spesielt sårbare for endringer i konformasjon og mangel på aktivitet og alle data innhentet bør valideres ved hjelp av aktive proteiner, fortrinnsvis i sin full lengde form. En annen begrensning av noen av plattformene er evnen til skjermen bare ATP analogs, begrenser dens total bruk.

De fleste av de kommersielt tilgjengelige tjenester for screening av TKIs bruker enzymatisk baserte tilnærminger utnytte bare vill type versjoner av kinase av interesse, og noen ganger bare noen utvalgte mutanter. Å vite at resistens er svært vanlig hos pasienter behandlet med TKI, er det viktig å være i stand til å måle narkotika respons i ulike mutanter, for valg av den mest hensiktsmessige inhibitor. På grunn av NAPPA ' s natur, screening av kinase mutanter er enkel og kan enkelt oppnås, og det eneste nødvendige verktøyet er inkorporering av kinase mutant inn i NAPPA cDNA samlingen, som kan gjøres av nettsted-spesifikke mutagenese, for eksempel.

Fremtidige applikasjoner
En av de vanligste formene for behandling gå i kreft terapi bruker kinase hemmere er oppkjøpet av mutasjoner i stoffet målet under en behandling kurs. Screening av disse mutanter om deres reaksjon på kinase hemmere er av avgjørende betydning for valg av andre/tredje generasjon av TKIs å oppnå en personlig behandling for hver pasient. Stoffet screening tilnærmingen presenteres her, gir en objektiv screening plattform der noen tyrosin kinase inhibitor kan testes mot et panel av tyrosin kinaser stede i den menneskelige Genova. Siden proteiner som vises på NAPPA arrays uttrykkes in vitro fra cDNA trykt på lysbildet, kan en mutant variant lett bli innlemmet i cDNA samlingen som skal vises på matrisen. Anlegget der kinase mutanter kan genereres og uttrykkes på array, kombinert med høy gjennomstrømming strøm av NAPPA teknikk, gir et unikt miljø for studiet av kinase mutanter og deres respons på narkotika, noe som gjør NAPPA egnet for personlig narkotika screening, et av målene for presisjon medisin.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke alle på LaBaer ' s Lab for deres hjelp og kritikk under utviklingen av prosjektet. Dette prosjektet ble støttet av NIH stipend U01CA117374, U01AI077883 og Virginia G. piper Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
364 well plates (for arraying) Genetix x7020
800 µL 96-well collection plate Abgene AB-0859
96-pin device Boekel 140500
Acetic Acid Millipore-Sigma 1.00066
Acetone 99.9% Millipore Sigma 650501
Aluminum seal for 96 well plates VWR 76004-236
Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane) Pierce 80370
ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse Millipore Sigma F3165
Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal) Millipore Sigma F7425
ATP 10 mM Cell Signaling 9804S
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Millipore-Sigma G9422
bacteriological agar VWR 97064-336
Blocking Buffer ThermoFisher/Pierce 37535
Brij 35 ThermoFisher/Pierce BP345-500
BS3 (bis-sulfosuccinimidyl) ThermoFisher/Pierce 21580
BSA (bovine serum albumin) Millipore Sigma A2153
Coverslip 24 x 60 mm VWR 48393-106
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-165-150
DeepWell Block, case of 50 ThermoFisher/AbGene AB-0661
DEPC water Ambion 9906
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Millipore-Sigma D8418
DNA-intercalating dye Invitrogen P11495
DNase I Millipore-Sigma AMPD1-1KT
DTT Millipore-Sigma 43816
EDTA Millipore-Sigma EDS
Ethanol 200 proof Millipore-Sigma E7023
Filter plates Millipore-Sigma WHA77002804
Gas Permeable Seals, box of 50 ThermoFisher/AbGene AB-0718
Glass box Wheaton 900201
Glass slides VWR 48300-047
Glycerol Millipore-Sigma G5516
HCl (Hydrochloric acid) Millipore-Sigma H1758
HEPES Buffer Solution Millipore-Sigma 83264
Human-based IVTT system Thermo Scientific 88882
ImmunoPure Mouse IgG whole molecule ThermoFisher/Pierce 31202
Isopropanol Millipore-Sigma I9516
KCl (Potassium chloride) Millipore-Sigma P9333
KH2PO4(Potassium phosphate monobasic) Millipore-Sigma P5655
Kinase buffer Cell Signaling 9802
KOAc (Potassium acetate) Millipore-Sigma P1190
Lambda Protein Phosphatase new england biolabs P0753
Lifterslips, 24 x 60 mm ThermoFisher Scientific 25X60I24789001LS
Metal 30-slide rack with no handles Wheaton 900234
MgCL2 (Magnesium chloride) Millipore-Sigma M8266
Na3VO4 (Sodium orthovanadate) Millipore-Sigma S6508
NaCl (Sodium Chloride) Millipore-Sigma S3014
NaOAc (Sodium acetate) Millipore-Sigma S2889
NaOH (Sodium hydroxide) Millipore-Sigma S8045
NucleoBond Xtra Midi / Maxi Macherey-Nagel 740410.10 / 740414.10
Nucleoprep Anion II Macherey Nagel 740503.1
Phosphoric Acid Millipore-Sigma 79617
Poly-L-Lysine Solution (0.01%) Millipore-Sigma A-005-C
Protein Phosphatase (Lambda) New England Biolabs P0753
RNAse Invitrogen 12091021
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Millipore-Sigma L6026
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Millipore-Sigma 05030
Sealing gasket Grace Bio-Labs, Inc 44904
Silica packets VWR 100489-246
Single well plate ThermoFisher/Nalge Nunc 242811
Sodium acetate (3M, pH 5.5) Millipore-Sigma 71196
TB media (Terrific Broth) Millipore-Sigma T0918
Tris IBI scientific IB70144
Triton X-100 Millipore-Sigma T8787
Tryptone Millipore-Sigma T7293
Tween 20 Millipore-Sigma P9416
Yeast Extract Millipore-Sigma Y1625
Name Company Catalog number Comments
Equipments Maker/model
Programmable chilling incubator Torrey Pines IN30 Incubator with Cooling
Shaker for bacterial growth ATR Multitron shaker
Vacuum manifold with liquid waste trap MultiScreenVacuum Manifold 96 well
96 well autopippetor/liquid handler Genmate or Biomek FX
Liquid dispenser Wellmate
DNA microarrayer Genetix QArray2
Automatic hybridization station Tecan HS4800 Pro Hybridization Station
Microarray scanner Tecan PowerScanner
Microarray data quantification Tecan Array-ProAnalyzer 6.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Melnikova, I., Golden, J. Targeting protein kinases. Nature Review Drug Discovery. 3 (12), 993-994 (2004).
  2. Patterson, H., Nibbs, R., McInnes, I., Siebert, S. Protein kinase inhibitors in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases. Clinical and Experimental Immunology. 176 (1), 1-10 (2014).
  3. Wu, P., Nielsen, T. E., Clausen, M. H. FDA-approved small-molecule kinase inhibitors. Trends Pharmacological Sciencies. 36 (7), 422-439 (2015).
  4. Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2 (5), 561-566 (1996).
  5. Heinrich, M. C., et al. Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI 571, a selective tyrosine kinase inhibitor. Blood. 96 (3), 925-932 (2000).
  6. Stagno, F., et al. Imatinib mesylate in chronic myeloid leukemia: frontline treatment and long-term outcomes. Expert Review Anticancer Therapy. 16 (3), 273-278 (2016).
  7. Ben Ami, E., Demetri, G. D. A safety evaluation of imatinib mesylate in the treatment of gastrointestinal stromal tumor. Expert Opinions in Drug Safety. 15 (4), 571-578 (2016).
  8. Ramachandran, N., et al. Self-assembling protein microarrays. Science. 305 (5680), 86-90 (2004).
  9. Festa, F., et al. Robust microarray production of freshly expressed proteins in a human milieu. Proteomics Clinical Applications. 7 (5-6), 372-377 (2013).
  10. Yazaki, J., et al. Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (29), E4238-E4247 (2016).
  11. Rauf, F., et al. Ibrutinib inhibition of ERBB4 reduces cell growth in a WNT5A-dependent manner. Oncogene. 37 (17), 2237-2250 (2018).
  12. Anderson, K. S., et al. Protein microarray signature of autoantibody biomarkers for the early detection of breast cancer. Journal of Proteome Research. 10 (1), 85-96 (2011).
  13. Wang, J., et al. Plasma Autoantibodies Associated with Basal-like Breast Cancers. Cancer Epidemiol Biomarkers Prevention. 24 (9), 1332-1340 (2015).
  14. Bian, X., et al. Tracking the Antibody Immunome in Type 1 Diabetes Using Protein Arrays. Journal of Proteome Research. 16 (1), 195-203 (2017).
  15. Song, L., et al. Identification of Antibody Targets for Tuberculosis Serology using High-Density Nucleic Acid Programmable Protein Arrays. Molecular and Cellular Proteomics. 16 (4 suppl 1), S277-S289 (2017).
  16. Wang, J., et al. Comparative Study of Autoantibody Responses between Lung Adenocarcinoma and Benign Pulmonary Nodules. Journal of Thoracic Oncology. 11 (3), 334-345 (2016).
  17. Montor, W. R., et al. Genome-wide study of Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein immunogenicity using self-assembling protein microarrays. Infection and Immunity. 77 (11), 4877-4886 (2009).
  18. Tang, Y., Qiu, J., Machner, M., LaBaer, J. Discovering Protein-Protein Interactions Using Nucleic Acid Programmable Protein Arrays. Current Protocols in Cell Biology. 74, 11-15 (2017).
  19. Yu, X., et al. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (click chemistry)-based detection of global pathogen-host AMPylation on self-assembled human protein microarrays. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (11), 3164-3176 (2014).
  20. Anderson, K. S., et al. Autoantibody signature for the serologic detection of ovarian cancer. Journal of Proteome Research. 14 (1), 578-586 (2015).
  21. Woyach, J. A., Johnson, A. J., Byrd, J. C. The B-cell receptor signaling pathway as a therapeutic target in CLL. Blood. 120 (6), 1175-1184 (2012).
  22. Smith, M. R. Ibrutinib in B lymphoid malignancies. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 16 (12), 1879-1887 (2015).
  23. Festa, F., Steel, J., Bian, X., Labaer, J. High-throughput cloning and expression library creation for functional proteomics. Proteomics. 13 (9), 1381-1399 (2013).
  24. Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Research. 42, D1253-D1260 (2014).

Tags

Biokjemi selv-monterte protein Microarrays narkotika screening protein kinase analysen tyrosin kinase hemmere høy gjennomstrømming screening skjermen av kinase hemmere NAPPA protein Microarray
Kinase inhibitor screening i selv-monterte Human protein Microarrays
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Festa, F., Labaer, J. Kinase… More

Festa, F., Labaer, J. Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays. J. Vis. Exp. (152), e59886, doi:10.3791/59886 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter