Deze studie beschrijft klassieke hydratatie met behulp van de dunne lipide-film methode voor de bereiding van nanoliposome gevolgd door nanodeeltjes karakterisatie. Een 47 kDa-hydrofiele en bolvormige proteïne, Tarin, is met succes ingekapseld als een strategie om de stabiliteit te verbeteren, snelle klaring te voorkomen en gecontroleerde afgifte te bevorderen. De methode kan worden aangepast aan hydrofobe moleculen inkaping.
Liposome Nanocapsules zijn toegepast voor vele doeleinden in de farmaceutische, cosmetische en voedingsmiddelenindustrie. Kenmerken van liposomen omvatten hun biocompatibiliteit, biologische afbreekbaarheid, niet-immunogeniciteit, niet-toxiciteit, en het vermogen om zowel hydrofiele als hydrofobe verbindingen te verankeren. De klassieke hydratatie van dunne lipide films in een organisch oplosmiddel wordt hierin toegepast als een techniek om Tarin in te kapen, een planten lectine, in nanoliposomes. Nanoliposome grootte, stabiliteit, Entrapment efficiency en morfologische karakterisering worden gedetailleerd beschreven. De nanoliposomes worden bereid met 1,2-dioleoyl-SN-glycerol-3-foshoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-SN-glycero-3-foshoethanolamine-N-[amino (polyethyleenglycol)-2000] (ammoniumzout; DSPE-MPEG 2000), en cholesterylhemisuccinaat (CHEMS) als de belangrijkste bestanddelen. Lipiden worden voor het eerst opgelost in chloroform om een dunne lipide-film te verkrijgen die vervolgens opnieuw wordt gehydrateerd in ammoniumsulfaat oplossing die het eiwit bevat dat moet worden ingesloten en ‘s nachts worden geïnprimeerd. Vervolgens worden sonicatie-en extrusietechnieken toegepast voor het genereren van nanoformaat unilamellaire blaasjes. De index van de grootte en polydispersiteit van de nano blaasjes wordt bepaald door Dynamische lichtverstrooiing, terwijl de morfologie van de nanovesicle wordt beoordeeld door het scannen van elektronenmicroscopie. De efficiëntie van het Entrapment wordt bepaald door de verhouding tussen de hoeveelheid niet-ingekapselde eiwitten en de oorspronkelijke hoeveelheid oorspronkelijk geladen eiwitten. Homogene liposomen worden verkregen met een gemiddelde grootte van 155 nm en een polydispersiteit indexwaarde van 0,168. Een hoge Entrapment-efficiëntie van 83% wordt bereikt.
Het aantal studies dat onderzoek doet naar efficiënte systemen voor de afgifte van geneesmiddelen is de afgelopen jaren gestegen. Echter, beperkingen zoals snelle klaring, slechte biodistributie, en oplosbaarheid op fysiologische pH en onvoldoende cellulaire opname moeten nog worden overtroffen. Het gebruik van nanosystemen is ontstaan als recente vooruitgang in kanker therapeuten, toegepast om de intracellulaire concentratie van geneesmiddelen binnen tumorcellen te verhogen terwijl de toxiciteit in gezonde cellen wordt geminimaliseerd. Bovendien worden nanodeeltjes die zijn verkregen uit een ander bereik van materialen (d.w.z. polymeren, dendrimers, liposomen, virussen, koolstofnanobuizen en metalen zoals ijzeroxide en goud) momenteel toegepast om de antikanker effecten te verbeteren en systemische toxiciteit1. Met name Liposome Nanocapsules zijn toegepast voor vele doeleinden in de farmaceutische, cosmetische en voedingsmiddelenindustrie. In de afgelopen jaren zijn verschillende nutraceutische producten zoals vitaminen, enzymen en kruidenextracten geformuleerd met behulp van liposoom technologie2.
Liposomen zijn sferische blaasjes bestaande uit een of meer concentrische lipide-bilayers spontaan gevormd door de dispersie van fosfolipiden in waterige media3,4. De pool hoofden van de fosfolipiden bevinden zich op de buitenste en binnenste oppervlakken van de membranen, in contact met de waterige omgeving. Vetzuurketens vormen daarentegen de hydrofobe kern van de membranen en worden beschermd tegen water5. Sommige kenmerken van liposomen die ze aantrekkelijk medicijn bezorgings systemen maken, zijn hun biocompatibiliteit, biologische afbreekbaarheid, niet-immunogeniciteit, niet-toxiciteit en het vermogen om zowel hydrofiele als hydrofobe verbindingen te verankeren6.
Liposomen kunnen worden bereid met behulp van verschillende processen stappen zoals agitatie, ultrasoonapparaat, extrusie, lyofilisatie, bevriezing, en ontdooien. Klassieke methoden omvatten achteruit fase verdamping, oplosmiddel injectie, en detergenten dialyse. De meest toegepaste methode is dunne lipide film hydratatie, ook bekend als bangham de methode, die wordt gebruikt voor het verkrijgen van vesicular-lipide vormen7,8,9,10,11. Lamelariteit (het aantal fosfolipide bilayers) en de deeltjesgrootte zijn klassieke parameters die worden gebruikt om liposomen te karakteriseren als 1) unilamellaire blaasjes (Ulv’s), gevormd door een unieke fosfolipide dubbeltje en variërend in grootte als volgt: i) kleine unilamellaire blaasjes (suv’s, ~ 0,02-0,20 μm), II) grote unilamellaire blaasjes (luv’s, ~ 0.2-1.0 μm), en III) gigantische unilamellaire blaasjes (guv’s, > 1 μm); of 2) multilamellaire blaasjes (mlv’s, > 0,1 μm)3,12. Vesicle grootte is een belangrijke parameter bij het overwegen van therapeutisch gebruik, zoals bij kankerbehandeling, waarbij de maten van < 200 nm ideaal zijn om nano blaasjes de endotheliale barrière te laten passeren en tumorele weefsels4te bereiken.
Hierin werd de inkapseling procedure na de klassieke hydratatie van een dunne lipide filmtechniek 7 beschreven met behulp van Tarin, een plant lectine gekenmerkt als een hydrofiele bolvormigeproteïne 13,14,15 . Nano-sized blaasjes worden geproduceerd door sonicatie-en extrusiestappen in de hoofd techniek, resulterend in stabiele Liposomale nano blaasjes met hoge Entrapment-efficiëntie16.
Het hier beschreven protocol werd getest door Correa et al.16 om Tarin in te kapen, een immunomodulerende en antitumorele lectine gezuiverd uit Colocasia esculenta22. De methodologie leverde succesvolle resultaten op, waardoor de productie van stabiele nanoliposomes van passende grootte voor therapeutische toepassingen mogelijk werd. De formulering presenteert gecontroleerde afgifte op verschillende pH-niveaus onder fysiologische omstandigheden. Het versterkt ook Tarin farmacologische eigenschappen, zoals remming van humaan multiform glioblastoom U-87 mg en borstkanker MDA-MB-231 cellijnen en stimulatie van muizen beenmergcellen. Het Liposomale preparaat vertoonde geen toxische effecten in gezonde muizen cellen16.
De klassieke methode, voor het eerst beschreven door bangham et al.7, maakt de productie mogelijk van grote multilamellaire liposoom blaasjes, heterogeen in grootte en vorm. Aanpassingen van deze methode, zoals gerapporteerd in de huidige studie, worden met succes toegepast door aanvullende stappen zoals sonicatie en extrusie toe te passen via een 0,2 μm polycarbonaat membraan. Dit maakt de productie van een meer homogene dispersie met betrekking tot de grootte in de nanometer bereik16,23,24. Daarom, om succesvolle resultaten te garanderen, de inkapseling protocol en Liposomale formulering hier beschreven moet strikt worden gevolgd.
De nanoliposome samenstelling werd zorgvuldig geselecteerd om te zorgen voor de vorming van een dubbelmembraan met DOPE, MPEG 2000-DSPE, en CHEMS als de belangrijkste bestanddelen. Dit zijn natuurlijke dier membraan dubbellaagse bestanddelen en de laatstgenoemde kan vloeibaarheid verlenen aan nano-architectuur, waardoor een brede toepassing voor bioactieve samengestelde levering bij mensen.
Nanoliposome pegylation is essentieel om de stabiliteit van de liposoom structuur te garanderen. De afwezigheid van PEG leidt tot de grootte van de uitbreiding, een hoge polydispersiteit index, en lage Entrapment efficiëntie. Optimale resultaten kunnen worden verkregen met DOPE als de belangrijkste liposoom component. Echter, dit is een hoge kosten fosfolipide. De financiële kosten van de productie van nanoliposome kunnen worden bereikt door het vervangen van DOPE met andere soortgelijke lipiden zoals DOPC (1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-fosfocholine). CHEMS is een cholesterol molecuul natuurlijk gevonden in dierlijke celmembranen, die niet mag worden uitgesloten van de formulering, omdat het belangrijk is om te zorgen voor lipide dubbeldetheid en smeedbaarheid16.
Andere aspecten van het inkapseling protocol kunnen ook worden aangepast. De chloroform die wordt gebruikt om de liposomale componenten op te lossen, kan gemakkelijk worden vervangen door methanol zonder effecten op de gemiddelde grootte, homogeniteit en inschakel efficiëntie. Echter, sommige eiwit lekkage kan optreden bij opslag onder 4 °C16. De nachtelijke incubatie stap met ammoniumsulfaat oplossing die Tarin bevat, is niet verplicht; echter, voor het gemak kan worden uitgevoerd zonder schade aan nanoliposomale biopfysische kenmerken, inkaping, of stabiliteit efficiëntie verliezen, zoals aangetoond door Correa et al.16. De extrusiestap wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur, die de stroomsnelheid tussen de spuiten kan verlagen als een poriegrootte membraan van 0,1 μm wordt gebruikt.
Om dit probleem te verhelpen, moet het gebruik van een poriegrootte membraan van 0,2 μm of verwarming van de extruderhouder boven de lipide-overgangstemperatuur worden overwogen. De analist moet oppassen niet te beschadigen de lipiden of eiwitten die kunnen worden geïnactiveerd en verliezen biologische activiteit. Als alternatief kan liposomaal preparaat worden gedialyseerd tegen HBS in plaats van ultracentrifugatie, met behulp van een cut-off membraan volgens eiwit moleculair gewicht. De keuze van de chemische aard van de buffer waarin nanoliposomes worden opgeschort na ultracentrifugatie is direct gerelateerd aan de daaropvolgende toepassing. Aangezien de perspectieven van deze studie in vivo en in vitro testen omvatten, was suspensie in HEPES gebufferde zoutoplossing voldoende om te zorgen voor geen cytotoxische effecten en een pH-bereik in de buurt van fysiologische omstandigheden.
Liposomen moeten fijn worden behandeld, vergelijkbaar met levende cellen, om een hogere kwaliteit SEM-beelden te verkrijgen. Fixatie-en droog procedures zijn belangrijk om te zorgen voor de visualisatie van kleinere intacte blaasjes die waarden hoger dan 20 kV ondersteunen onder vacuüm condities. Figuur 2 A, B geeft zilver blaasjes aan die compatibel zijn met de extrusieprocedure. Visualisatie van blaasjes variërend van 51-396 nm is mogelijk als een adequate monstervoorbereiding na deze procedure wordt uitgevoerd. De stappen omvatten fixatie, drogen door toenemende ethanol concentraties, en chemische uitdroging om de vorming van aggregaten en gescheurde blaasjes veroorzaakt door de vacuüm-en elektronenstraal te voorkomen. Aan de andere kant toont Figuur 2C, D liposomen blaasjes gedroogd onder kamertemperatuur en niet onderworpen aan de hier beschreven behandelingen, wat betekent dat ze onvoldoende voorbereid waren. Als gevolg van de ontoereikende procedure worden er reuzen blaasjes gevormd, zelfs na extrusie door een poriegrootte van 0,2 μm. In beide panelen worden ook gescheurde blaasjes waargenomen als gevolg van beschadiging van de vacuüm-en elektronenstraal.
Nanoliposome blaasjes zijn onderzocht als een inkapseling en levering systeem voor hydrofobe moleculen, met inbegrip van Resveratrol (3, 5, 4 ‘-trihydroxystilbene), een bioactieve verbinding tegen colorectale kankercellen. De inkapings procedure kan de slechte oplosbaarheid van lipofiele verbindingen overwinnen, naast het verstrekken van biocompatibiliteit, biologische afbreekbaarheid, niet-immunogeniciteit en niet-toxiciteits kenmerken die inherent zijn aan liposoom Nanocapsules25. Er moet rekening worden gehouden met protocol aanpassingen, afhankelijk van de toedieningsroute en het doel, zoals de ontwikkeling van nieuwe liposoom formuleringen voor orale toediening.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs zijn dankbaar voor de COPPE/UFRJ, elektronische microscopie laboratorium, en multi user materialen karakteriseren laboratoriumfaciliteiten; aan Dr. Adalberto Vieyra, Dr. Jennifer Lowe en Rafael Lindoso, professoren aan de Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brazilië, voor het gebruik van de ultracentrifuge; aan Dr. Alexandre Guedes Torres en Daniel Perrone, professoren aan de Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brazilië, voor het gebruik van de roterende verdamper; aan professor Roland Bodmeier en Dr. Andriy Dashevskiy van Freie Universität in Berlijn, die geholpen met middelen, voorzien van nieuwe methodologieën, en begeleid ACNTF tijdens een 6 maanden Erasmus + Fellowship in Duitsland; aan Dr. Rossana Thiré en Aline Fernandes, professor en technicus aan de Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brazilië, voor het gebruik van Zetasizer Malvern; aan Bluma Guenther en Taissa Rodrigues, professor en technicus aan de Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brazilië, voor het gebruik van de SEM; aan Dr. Rachel Ann Hauser Davis, onderzoeker bij Fundação Oswaldo Cruz, voor vertelling. Deze studie werd deels gefinancierd door de Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de nível Superior, Brasil (CAPES)-Finance code 001 (Grant No. 1627392; 1811605); door Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (Grant No. E-26/202.815/2018; E-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 en E-26/202.860/2016); door Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (Grant No. 406601/2018-6), en Financiadora de Estudos e projetos (FINEP).
Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich Co | A4418 | |
Analitycal Ballance Mettler H10Tw | Mettler Inc. | 417870 | |
Beckman DU-640 Spectrophotometer | Beckman Coulter | 8043-30-1090 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Co | 5470 | |
BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump | Thermo Fischer Scientific | 05-001-022PM | |
CHEMS (cholesterylhemisuccinate) | Sigma-Aldrich Co | C6512 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich Co | 48520-U | CAUTION |
Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) | Sigma-Aldrich Co | 209198 | |
Coverslips (13mm diameter) | Thermo Scientific Nunc | EW-01839-00 | |
DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) | Lipoid GMBH | 565600.1 | |
Ethanol Absolute | Sigma-Aldrich Co | 32205 | |
Folin -Ciocalteu phenol reagent | Sigma-Aldrich Co | F9252 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich Co | G5882 | |
HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3375 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich Co | 440191 | CAUTION |
JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope | JEOL LTD | ||
Mini Extruder 7 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Lipoid GMBH | 588200.1 | |
Optima L-90k Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
Phosphate Buffer | Sigma-Aldrich Co | P3619 | |
Poli-L-lysine | Sigma-Aldrich Co | P8920 | |
Potassium L-tartrate monobasic | Sigma-Aldrich Co | 243531 | |
Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich Co | S7795 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co | S7653 | |
Sodium Deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich Co | D6750 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich Co | L3771 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich Co | S8045 | |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich Co | RES20908-A7 | |
TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope | Tescan | #657874 | |
Trichloroacetic Acid (TCA) | Sigma-Aldrich Co | 91230 | |
Zetasizer Nano ZSP | Malvern Panalytical LTD | ||
Ultrasonic cleaning bath model 2510 | Branson |