Summary
본 연구는 나노리포솜 제제에 대한 얇은 지질 막 방법을 이용한 고전적인 수분 공급에 대해 설명하고 나노입자 특성화에 이어. 47 kDa-친수성 및 구형 단백질인 타린(tarin)은 안정성을 개선하고, 빠른 클리어런스를 피하며, 통제된 방출을 촉진하는 전략으로 성공적으로 캡슐화되었습니다. 이 방법은 소수성 분자 캡슐화에 적응될 수 있다.
Abstract
리포솜 나노캡슐은 제약, 화장품 및 식품 산업에서 많은 목적으로 적용되어 왔다. 리포좀의 특성은 생체 적합성, 생분해성, 비 면역 원성, 비 독성 및 친수성 및 소수성 화합물을 모두 포획하는 능력을 포함합니다. 유기 용매에서 박막 립 필름의 고전적인 수화는 나노 리포솜에서 식물 렉틴 인 타린을 캡슐화하는 기술로 본원에 적용된다. 나노리포좀 크기, 안정성, 함정 효율 및 형태학적 특성화가 자세히 설명되어 있습니다. 나노리포솜은 1,2-디올레오일-sn-글리세롤-3-포스포에탄올라민(DOPE), 1,2-디스테로일-스n-글리세로-3-포스포에탄올라민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000](암모늄 염)을 사용하여 제조된다; DSPE-MPEG 2000, 및 콜레스테실헤미시네이트(CHEMS)를 주요 성분으로 한다. 지질은 먼저 클로로포름에 용해되어 밤새 포획되고 배양되는 단백질을 함유하는 황산암모늄 용액에서 이어서 재수화되는 얇은 지질 막을 얻었다. 그런 다음, 초음파 처리 및 압출 기술이 나노 크기의 unilamellar 소포를 생성하기 위해 적용됩니다. 나노베시클의 크기 및 다분산성 지수는 동적 광 산란에 의해 결정되며, 나노베시클 형태는 주사 전자 현미경으로 평가됩니다. 포획 효율은 처음에 로드된 단백질의 원래 양에 대한 캡슐화되지 않은 단백질의 양비율에 의해 결정된다. 동질 리포솜은 평균 크기 155 nm 및 다분산 지수 값 0.168로 수득된다. 83%의 높은 함정 효율을 달성합니다.
Introduction
효율적인 약물 전달 시스템을 조사하는 연구의 수는 최근 몇 년 동안 증가했다. 그러나, 급속한 정리와 같은 제한, 가난한 biodistribution, 생리적인 pH에 용해도 및 부족한 세포 통풍관은 아직도 능가될 필요가 있습니다. 나노시스템의 사용은 최근 암 치료제의 진보로 대두되고 있으며, 건강한 세포의 독성을 최소화하면서 암세포 내 약물의 세포내 농도를 증가시키기 위해 적용되고 있다. 또한, 다양한 범위의 물질(즉, 폴리머, 덴드리머, 리포좀, 바이러스, 탄소 나노튜브 및 산화철 및 금과 같은 금속)에서 얻은 나노입자는 현재 항암 효과를 향상시키고 전신을 감소시키기 위해 적용되고 있습니다. 독성1. 특히 리포솜 나노캡슐은 제약, 화장품 및 식품 산업에서 많은 목적으로 적용되고 있다. 최근에는 리포솜 기술 2를 사용하여 비타민, 효소 및 허브 추출물과 같은 다양한 건강기능 식품이 제조되었습니다.
리포좀은 수성 매체3,4에서인지질의 분산에 의해 자발적으로 형성된 하나 이상의 동심 지질 이중층으로 구성된 구형 소포이다. 인지질의 극지 헤드는 수성 환경과 접촉하여 멤브레인의 외부 및 내부 표면에 있습니다. 대조적으로, 지방산 사슬은 막의 소수성 코어를 형성하고물 5에서 보호됩니다. 그들에게 매력적인 약물 전달 시스템을 만드는 리포좀의 일부 속성은 그들의 생체 적합성, 생분해성, 비 면역 원성, 비 독성, 및 친수성및 소수성 화합물을 모두 포획하는 능력을 포함한다 6.
리포좀은 교반, 초음파 처리, 압출, 동결, 동결 및 해동과 같은 다양한 공정 단계를 사용하여 제조할 수 있습니다. 고전적인 방법은 역상 증발, 용매 주입 및 세제 투석을 포함한다. 가장 많이 적용되는 방법은 방함의 방법으로 알려진 얇은 지질 막 수화이며, 이는 7, 8,9,10,11을얻기 위해 사용된다. Lamellarity (인지질 이중층의 수) 및 입자 크기는 리포좀을 1로 특성화하는 데 사용되는 고전적인 매개 변수입니다(ULV), 독특한 인지질 이중층에 의해 형성되고 크기가 다음과 같이 다양합니다: i) 작은 unilamellar 소포 (SUV, ~0.02-0.20 μm), ii) 큰 unilamellar 소포 (LUV, ~0.2-1.0 μm), 및 iii) 거대한 unilamellar 소포 (ROV, >1 μm); 또는 2) 다층 소포 (MlV, >0.1 μm)3,12. 소포 크기는 암 치료에서와 같은 치료적 사용을 고려할 때 중요한 파라미터이며, 이는 <200 nm의 크기가 나노베시클이 내피 장벽을 교차시키고 종양 조직에 도달할 수 있도록 하는 데 이상적이다4.
본 명세서에서, 얇은 지질막 기술 7의 고전적인 수화를 따르는 캡슐화 절차는 타린을 사용하여 기재하였으며, 식물 렉틴은 친수성 구형 단백질13,14,15를 특징으로 한다. . 나노 크기의 소포는 주요 기술에 초음파 처리 및 압출 단계를 포함하여 생산되며, 높은 함정 효율(16)을가진 안정적인 리포좀 나노 베시클을 초래한다.
Protocol
1. 타린 리포좀 나노 캡슐 의 제조16
참고 : 모든 준비는 더 큰 부피 (7 mL)를 얻고 샘플을 초원심분리기에서 원심 분리 할 수 있도록삼중으로 준비해야합니다 (아래 세부 사항 참조).
- 표1과 같이 분석 균형을 사용하여 리포솜 성분을 계량합니다.
- 재료의 손실을 방지하기 위해 회전 증발기에 맞는 250 mL 체적 플라스크를 사용하여 클로로포름의 지질 성분을 용해.
- 혼합물을 150 rpm에서 15 분 동안 저어줍니다.
- 다음 조건하에서 회전 증발기로 클로로폼을 제거합니다.
- 최적의 효율을 위해 체적 플라스크 입을 표준 위치(25°)로 조정하고 가열 욕조에서 물과 접촉합니다.
참고: 장비 암은 증발 효율에 영향을 미치거나 시료를 손상시키지 않는 동안 체적 플라스크와 수조 사이의 접촉을 유지하기 위해 25°로 기울여야 합니다. 표준 위치는 장비 브랜드에 따라 다를 수 있습니다. - 응축기 온도를 최소 3°C로 설정합니다.
- 가열 조 온도를 40 ± 1 °C로 설정합니다.
- 회전을 120rpm으로 설정합니다.
- 진공을 207 mbar로 조정하고 비등점을 20°C로 조정합니다.
- ~ 25 분 후, 플라스크를 제거하고 적절하게 응축기에 남아있는 증발 용매를 폐기한다.
참고 : 리포솜 성분으로 구성된 얇고 불투명한 필름이이 단계에서 형성되어 쉽게 시각화 할 수 있습니다. 응축기에 남아있는 증발 된 용매는 적절한 폐기를 위해 전문 회사가 처리하기 위해 처리 된 처리 자 (염소 처리)에 저장해야합니다.
- 최적의 효율을 위해 체적 플라스크 입을 표준 위치(25°)로 조정하고 가열 욕조에서 물과 접촉합니다.
- 1 mg/mL에서 타린을 함유하는 황산암페이트 용액(pH=7.4)에서 0.01 M 지질 농도에 도달하여 10 mL의 최종 부피에 도달하는 지질 필름을 수화한다.
- 혼합물을 40분 간 저어주고 4°C에서 밤새 배양합니다.
참고: 이 단계는 중지 지점으로 간주될 수 있습니다. 하룻밤 배양의무는 아닙니다.
- 혼합물을 40분 간 저어주고 4°C에서 밤새 배양합니다.
- 배양 후, 25°C에서 1분 동안 현탁액을 초음파 처리한다(실온; RT)를 사용하여 소포 크기를 줄이고 집계를 방지합니다.
참고 : 크기 감소는 다음과 같은 조건하에서 초음파 초음파 에서 수행되었습니다 : 130 W 및 40 kHz의. - 0.2 μm 폴리카보네이트 기공 막을 통해 12 사이클 압출을 수행합니다.
참고: 압출 공정 전에 물을 사용하여 미니 압출기 어셈블리를 테스트하여 샘플 누출을 방지합니다. 0.1 μm 기공 멤브레인도 적합합니다. 이 경우, 지질 전이 온도 이상으로 미니 압출기 홀더를 예열하여 압출을 용이하게 하고, 지질 및 단백질 모두의 물리화학적 특성을 유지한다.- 제조업체 설명서에 설명된 대로 미니 압출기의 부품에 맞춥습니다.
- 폴리카보네이트 멤브레인을 두 개의 사전 습식 필터 지지대 사이에 놓고 홀더에 넣습니다.
- 장치에 1 mL 빈 주사기를 삽입하고 다른 주사기를 리포좀 현탁액으로 총 부피로 채우고 반대쪽에 삽입하십시오.
- 0.2 μm 폴리카보네이트 기공 막을 통해 12 사이클 압출을 수행합니다. 샘플을 한 주사기에서 다른 주사기로 천천히 밀어 넣습니다. 압출 된 현탁액을 미리 냉각 된 튜브에서 수집합니다.
참고 : 폴리 카보네이트 멤브레인은 한 주사기에서 다른 주사기로의 샘플 이송이 어려워지는 경우에만 교체해야합니다. 리포좀 서스펜션은 SUV 의 형성으로 인한 크기 감소의 결과로 압출 공정 중에 명확해져야 합니다. 이 단계에서 약 0.2 mL의 시료가 손실될 수 있습니다.
- 초원심분리에 의해 리포솜을 분리합니다.
참고: 초원심분리기를 사용할 준비가 될 때까지 얼음 욕조에서 샘플을 유지합니다. 스윙 버킷 로터가 있는 초원심분리기를 사용하여 나머지 부품과 황산암모늄을 분리합니다(아래 세부 사항 참조).- 로터에 맞는 티타늄 튜브의 샘플을 계량하고 튜브의 균형을 맞습니다. 튜브 손상을 방지하기 위해 사용되는 로터에 따라 필요한 최소 부피를 확인하고 필요한 경우 황산 암모늄으로 리포좀 현탁액 볼륨을 조정합니다.
참고: 스윙 버킷은 원심분리기 외부에서 회전 속도를 결정하기 위해 원심분리기에서 사용되는 "얼룩말 줄무늬"(즉, 하단의 흑백 줄무늬)를 긁지 않도록 항상 스탠드에서 지지되어야 합니다. - 원심분리기를 사용하기 전에 진공을 켜서 냉장 보관하십시오.
- 티타늄 튜브를 스윙 버킷에 맞춥습니다.
참고: 튜브가 완벽하게 장착되도록 작동 시 튜브를 가정한 위치로 들어 올립니다. - 진공을 해제하고 원심 분리기 도어를 열고 로터를 내부에 놓습니다.
참고: 동일한 원마크의 반대 방향에 꼭 맞아야 하는 로터 하단의 원마크에 주의하십시오. - 원심분리기 도어를 닫고 진공을 누르고 진공이 200~20미크론또는 26Pa에서 3Pa까지 도달할 때까지 기다립니다.
- 4°C에서 90분 동안 초원심분리기 디스플레이의 파라미터를 150,000 x g(전술한 스윙 버킷의 경우 29,600rpm에 해당)로 조정합니다(가속: 최대, 감속: 최대).
참고: 특정 원심분리기가 rpm으로 설정된 경우 항상 속도를 xg로 변환합니다. 원심분리기 웹 사이트를 사용하여 사용된 로터에 따라 장치를 변환하십시오. - 회수를 누르고 조건을 확인한 다음 실행 시작을 누릅니다.
참고: 원심분리기가 원하는 속도에 도달할 때까지 기다립니다. - 90분 후, 진공 버튼을 눌러 진공을 해제하고 진공이 200-700 미크론에 도달하면 원심 분리기 도어를 엽니다 (26-93 Pa에 해당).
- 원심분리기를 끄고 내부에서 로터를 제거하고 양동이를 사용하여 벤치에 두고 말리십시오.
- 얼음에 초원심 분리 된 샘플을 유지합니다.
- 로터에 맞는 티타늄 튜브의 샘플을 계량하고 튜브의 균형을 맞습니다. 튜브 손상을 방지하기 위해 사용되는 로터에 따라 필요한 최소 부피를 확인하고 필요한 경우 황산 암모늄으로 리포좀 현탁액 볼륨을 조정합니다.
- 조심스럽게, 관을 거꾸로 뒤집어서 펠릿과 분리하여 상구체와 펠릿을 분리하는 일회용 15 mL 원심분리튜브로 분리한다.
참고: 캡슐화되지 않은 단백질을 함유한 상급물질을 4°C에서 보관합니다. 캡슐화 효율을 결정하는데 사용될 것이다. 펠릿은 반투명 젤리로 나타납니다. - HEPES 완충 식염수에 캡슐화된 단백질을 함유하는 펠릿을 일시 중단(3 mL 의 1x HBS).
참고 : HBS 2x (재고 용액)는 증류수에서 다음과 같은 양의 시약을 희석하여 제조됩니다 : 140mM NaCl, 1.5 mM Na2 HPO4,50 mM HEPES, 다음 pH를 7.4로 조정하고 최종 부피를 100 mL로 조정합니다. Na2HPO4는 NaHCO3로대체되거나 리포솜 농도가 결정될 경우 간섭을 피하기 위해 생략될 수 있다. HBS 2x 스톡 용액은 사용하기 전에 HBS 1x를 얻기 위해 증류수로 희석되어야 합니다.
2. 캡슐화 효율
참고: 단백질 정량화에서 지질 간섭을 피하기 위해 Peterson의 프로토콜17을사용하여 캡슐화 효율을 결정합니다. 모든 샘플 (BSA 표준 및 리포솜 상류)는 삼중 지방으로 분석되어야한다. 또한 빈 튜브를 준비합니다.
- 재고 시약 및 작업 솔루션 의 준비17
- 재고 시약의 경우, 탄산나트륨 20% 10 mL, 황산염 0.1% 200 μL, 0.2% 칼륨 타르트레이트 200 μL, 증류수 9.6 mL를 혼합하여 구리-타르트-탄산염(CTC)을 준비합니다. 10% 황산 나트륨 (SDS) 및 0.8 N 수산화 나트륨 (NaOH)의 100 mL을 준비하십시오.
- 작업 용액의 경우 0.15 % 나트륨 데옥시 콜레이트 (DOC) 및 72 % 트리 클로로 아세트산 (TCA)의 10 mL을 준비하십시오. 10 mL의 증류수에 소 혈청 알부민 (BSA) 10 mg을 용해하여 1 mg / mL 표준 용액을 얻습니다. CTC, NaOH, SDS 및H2O. 증류수에서 폴린-시오칼트페놀 시약 1:5를 희석시킴으로써 시약 B를 준비하여 시약 A를 준비한다.
참고: 시약 A는 각 반응 튜브에 대해 1mL이 필요하고 시약 B는 0.5 mL가 필요합니다. 시약 A와 B의 최종 부피를 결정하기 위해, 먼저 BSA, 블랭크 및 삼중질시료의 세 가지 뚜렷한 농도를 고려하여 사용할 반응 튜브의 수를 정의한다. 시약 A는 사용하기 전에 균질화되어야 하며 25°C(RT)에서 2주 동안 보관할 수 있다. 시약 B는 또한 호박병에 보관하는 경우 25°C(RT)에서 안정된다.
- 강수량
참고 :이 단계는 미세 원심 분리튜브에서 수행됩니다.- 5-100 μg의 단백질을 함유한 1 mL의 최종 부피에 물로 리포좀 상류물을 희석시.
참고 : 빈 튜브는 증류수 1 mL로 채워져야합니다. - 0.1 mL의 0.1 mL을 0.15 % DOC를 추가하고, 소용돌이에 의해 균질화하고, RT에서 10 분 동안 배양하십시오.
- 72% TCA의 0.1 mL를 추가하고 잘 섞고 원심분리기를 3,000 x g와 RT에서 15분 동안 넣습니다.
참고: DOC-TCA는 단백질 침전을 촉진하여 두 가지 뚜렷한 단계를 형성합니다. 표적 단백질은 지질 간섭을 피하면서 원심분리에 의해 회복될 수 있다. - 조심스럽게 튜브를 아래쪽으로 향하게하고 흡수성 종이에 놓아 상급을 버립니다. 후속 단계에 대한 펠릿을 저장합니다.
참고 : 펠릿은 보기가 매우 어려울 수 있지만 보이지 않더라도 튜브를 거꾸로 뒤집어야합니다.
- 5-100 μg의 단백질을 함유한 1 mL의 최종 부피에 물로 리포좀 상류물을 희석시.
- 분광광도학
- 증류수 1 mL에서 2.2.4 단계에서 얻은 펠릿을 일시 중단합니다. 펠릿이 용해되었는지 확인하고 샘플을 새 시험관으로 옮길 수 있도록 철저히 섞습니다.
- 1 mL의 최종 볼륨에 알부민 (BSA) 표준의 희석을 준비합니다.
참고: 단백질 표준은 5-100 μg/mL 사이에 준비되어야 합니다. - 2.3.1 단계와 2.3.2 단계에서 튜브에 시약 A 1 mL을 예외없이 추가하고 잘 혼합하고 RT에서 10 분 동안 배양하십시오.
참고: SDS는 단백질 용해화를 지원하면서 가능한 지질 간섭을 완화할 수 있습니다. - 2.3.1 단계와 2.3.2 단계에서 튜브에 0.5 mL의 시약 B를 추가하고 잘 혼합하고 RT에서 30 분 동안 배양하면서 빛으로부터 보호합니다.
참고: Follin-Ciocalteu 페놀 시약은 단백질과 같은 일부 질소 함유 화합물의 배색 분석에 사용되는 인산화물염 및 포스포퉁상태의 혼합물이다. 구리 착색은 이 시약을 향한 페놀의 반응성을 증가시킵니다, 단백질 농도에 따라 청색/보라색 복합체를 생성합니다. - 분광광도계를 사용하여 750 nm에서 흡광도를 결정합니다.
- 표준 곡선에 기초하여 상급체에서 단백질 농도를 계산한다.
- 플롯 흡광도 값(Abs) 대 BSA 농도(mg/mL)는 선형 경향 선을 고려하여 각도 계수(k)를 얻습니다.
- 상층 단백질 농도(C)를 흡광도 값과 각 계수(k) 사이의 비율로 결정한 다음 총 부피를 다음과 같이 곱합니다.
- 다음 수식에 따라 캡슐화 효율을 결정합니다.
- 로드된 단백질 = 10 mg, 캡슐화되지 않은 단백질 = 단계 2.3.6.2에서 얻은 C값.
참고 : 이 경우, 황산 암모늄 용액 (1 mg / mL)에 용해 된 총 10 mg의 타린이 캡슐화 절차를 수행하는 데 사용되며,이 농도는 시험관 내 만족스러운 효과를 얻기에 충분하기 때문에13,16 ,16, 18.
3. 크기 및 안정성 결정
참고: 리포좀 제제의 크기 분포 및 폴리디저시티 지수(PdI)는 동적 광 산란(DLS)에 의해 평가된다. 0.1에 가까운 PdI는 균일한 제제를 나타낸다. 안정성 측정을 위해 리포솜을 4°C에 보관하고 크기 분포와 크기 평균을 정기적으로 확인합니다.
- 레이저 램프를 데우기 위해 사용하기 30분 전에 DLS 장비를 켭니다.
- 1.10단계에서 얻어진 리포좀 제제를 일회용 사이징 큐벳으로 옮김을 옮김.
- 장비 파라미터를 다음과 같이 설정한다: 분산제 타입 = 물(RI = 1.33); 재료 = 지질 (RI = 1.45); 및 RT.
- 시작을 누르고 장비가 판독을 완료하는 동안 기다립니다.
- 큐벳을 제거하고 장비를 끕니다.
참고: 후속 분석을 위해 큐벳에서 일회용 15mL 원심분리기 튜브로 샘플을 다시 옮기거나 새 판독에 충분한 양이 있는 경우 폐기하십시오.
4. 형태학적 특성화
참고 : 리포솜 특성은 무르테이와 라마사미19에따라 수행됩니다. 1.10단계에서 수득된 나노리포솜을 함유하는 샘플은 삼중지방으로 제조된다.
- 양면 테이프로 페트리 접시 바닥에 유리 커버슬립(직경 13mm)을 고정합니다. 테이프를 작은 조각(커버슬립을 고정하기 위한 적절한 크기)으로 자르고, 보호 용지를 제거하고, 페트리 접시 바닥에 고정합니다. 핀셋의 도움으로 테이프 위에 있는 보호 용지를 제거하고 덮개를 고정합니다.
참고: 다음 단계에서는 덮개가 놓이지 않도록 주의하고 강력한 테이프를 사용하십시오. - 커버슬립을 폴리-L-리신으로 코팅합니다. 습기를 유지하고 RT (25 °C)에서 1 시간 동안 배양하기 위해 페트리 접시 내부에 젖은 필터 종이를 놓습니다.
- 코팅 후, 커버립을 증류수로 헹구어 주세요.
- 1.10 단계에서 샘플 한 방울로 커버 립을 채우고 RT에서 1 시간 동안 건조시도록하십시오.
- 샘플을 고치려면 0.1 M 인산완충, pH = 7.2로 제조된 4% 글루타랄데히드로 덮습니다. 페트리 접시 안에 젖은 필터 용지를 놓고 수분 수준을 유지하기 위해 접시를 밀봉하십시오. 48 시간 동안 4 °C에서 배양하십시오.
- 동일한 인산염 완충액으로 커버립을 5분 동안 3x 헹구어 내보소서.
- 다음과 같이 시료를 탈수시: 15분 동안 35% 에탄올 1x, 15분 동안 50% 에탄올 1x, 15분 동안 75% 에탄올 1x, 15분 동안 95% 에탄올 2x, 20분 동안 절대 에탄올 3x.
- 1-2 mL의 헥사메틸디실라잔(HMDS)에 2x 침지하여 샘플을 10분 동안 화학적으로 건조시다.
참고: HMDS는 연기 후드 내부에서 신중하게 조작해야 합니다. 시료는 건조기 내부 또는 RT의 연기 후드 내부에서 하룻밤 동안 건조할 수 있어야 합니다. - 탄산 전도성 접착제 테이프로 스텁에 건조된 샘플을 장착합니다.
- 금 팔라듐의 전기 전도성 층 (20 nm 두께)와 진공에서 커버 슬립의 표면을 스퍼터.
- 저진공 모드와 저전압(20kV)에서 주사 전자 현미경(SEM)으로 이미지를 기록합니다.
Representative Results
도 1은 나노리포솜 제제16,20,21을기술한다. 인지질, 1,2-디올레오일-sn-글리세롤-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올라민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000](암모늄 염) DSPE-MPEG 2000, 및 콜레스테실헤미시네이트(CHEMS)는 주요 리포좀 성분으로, 먼저 클로로포름에 용해되어 지질 막을 얻었다. 지질막을 수화한 후 친수성 단백질(tarin)을 함유하는 황산암모늄 용액을 포획하고, 밤새 배양을 수행하였다. 그런 다음 초음파 처리 및 압출 기술을 적용하여 작은 단일 소포를 생성했습니다. 초원심분리 단계는 리포좀 제제를 자유 지질 및 캡슐화되지 않은 단백질로부터 분리하고, 상월제는 포획 효율의 측정을 위해 사용되었다.
전술한 방법론을 이용하여 제조된 나노리포솜은 51-396 nm 및 평균 크기 155 nm(표 2)에 이르는 크기 분포를 나타내었다. 다분산지수가 0.168이었기 때문에 준비는 균일했다. 리포솜이 0.2 μm 의 공극 크기 막(표 2)을 통해 압출되는 경우 83%의 높은 포트랩 효율에 도달할 수 있다.
형태학적 나노리포솜 특성은 SEM. 그림 2A, B가 121 nm 의 범위에서 둥근 모양의 리포솜 소포를 표시하고 20 kV에서 분석한 반면, 그림 2C,D 디스플레이는 부적절하게 준비되었습니다. 샘플. 나노리포솜은 단순히 이 연구에서 기술된 이전의 고정 또는 다른 치료 없이 공기 건조되었다. 그 결과, 332 μm 의 범위에서 더 크고 손상된 소포를 5 kV에서 분석하고 관찰되었다.
그림 1: 나노리포솜 제제의 개략적 표현. 주요 리포좀 성분인 도피, PEG 및 CHEMS는 먼저 클로로포름에 용해되어 지질 막을 얻었다(1,2,3). 지질막을 포획하는 친수성 단백질(tarin)을 함유하는 식염수 완충액으로 재수화한 후, 밤새 배양을 수행하였다(4). 이어서, 초음파 처리 및 압출 기술을 적용하여SUV(5, 6)를 생성하였다. 초원심분리 단계는 리포좀 제제를 유리 지질 및 캡슐화되지 않은 단백질로부터 분리하고, 상수액은 포획 효율의측정을 위해 사용하였다(7). 이 그림은 코레아 외16에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: SEM에 의한 나노리포좀 광현미경 검사법. (A,B) 121 nm의 범위에서 둥근 모양의 리포좀 소포의 이미지를 20 kV에서 분석했다. (C,D) 부적절하게 준비된 샘플의 이미지. 5 kV에서 진공 및 / 또는 전압 조건에 저항 할 수없는 더 큰 및 / 또는 손상된 소포를 관찰 할 수있는 잘못 처리 된 샘플. 이 그림은 코레아 외16에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 리포솜 성분 | 무게 (g) | 농도 (mM) | 최종 볼륨 |
| 마약 | 0.0420 | 5.7 | 10 mL |
| MPEG 2000-DSPE | 0.1059 | 3.8 | |
| 화학 (것)들 | 0.0024 | 0.5 |
DOPE - 1,2-디올레오일-센-글리세롤-3-포스포에탄올라민); MPEG 2000-DSPE- 1,2-디스테로일-스네 글리세로-3-포스포에탄올아민-N- [아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (암모늄 염); CHEMS – 콜레스테릴헤미신.
표 1: 타린 리포좀 나노캡슐의 제조.
| 멤브레인 모공 크기 (μm) | 크기 분포(nm) | 평균 크기(nm) | 다분산 지수(PdI) | 피크 (nm) | 함정 효율성 |
| 0.2 | 51 - 396 | 155 | 0. 168 | 94 ± 39 | 0.83 |
크기 및 다분산도 지수는 동적 광 산란에 의해 평가되었고, 캡슐화 효율은 피터슨17에따라 결정되었다.
표 2: 나노리포좀 제제의 크기, 폴리디저시티 지수 및 함정 효율.
Discussion
본원에 기재된 프로토콜은 콜로시아 에스컬렌타22로부터정제된 면역조절 및 항종양 렉틴인 타린을 캡슐화하기 위해 코레아 외16에 의해 시험되었다. 이 방법론은 성공적인 결과를 낳았으며, 치료 응용 분야에 적합한 크기의 안정적인 나노 리포좀을 생산할 수 있게 되었습니다. 제형은 생리적 조건 하에서 상이한 pH 수준에서 조절방출을 제시한다. 또한 인간 교모세포종 U-87 MG 및 유방암 MDA-MB-231 세포주 및 마우스 골수 세포의 자극의 억제와 같은 타린 약리학적 특성을 강력하게 한다. 리포좀 제제는 건강한 마우스세포(16)에서독성 효과를 나타내지 않았다.
Bangham 등 7에 의해 처음기술된 고전적인 방법은 큰 다층 질 리포솜 소포의 생산을 허용하며, 크기와 모양면에서 이질적입니다. 본 연구에서 보고된 바와 같이 이 방법의 적응은 0.2 μm 폴리카보네이트 멤브레인을 통한 초음파 처리 및 압출과 같은 추가 단계를 포함함으로써 성공적으로 적용된다. 이것은 나노 미터 범위16,23,24의크기에 관한 보다 균일 한 분산의 생산을 허용한다. 따라서 성공적인 결과를 보장하기 위해 여기에 설명된 캡슐화 프로토콜 및 리포좀 제형은 엄격하게 따라야 합니다.
나노리포좀 조성물은 DOPE, MPEG 2000-DSPE 및 CHEMS를 주요 성분으로 하는 이중층 막의 형성을 보장하기 위해 신중하게 선택되었다. 이들은 자연 동물 막 이중 층 구성 요소 이며 후자는 나노 리 포 좀 아키텍처에 유동성을 부여할 수 있습니다., 인간에서 생리 활성 화합물 전달에 대 한 광범위 한 응용 프로그램을 보장.
나노 리포솜 페질화는 리포좀 구조 안정성을 보장하는 데 필수적입니다. PEG의 부재는 크기 확대, 높은 다분산성 지수 및 낮은 함정 효율로 이어집니다. 최적의 결과는 주요 리포솜 성분으로서 DOPE로 얻을 수 있다. 그러나, 이것은 고비용 인지질이다. 나노 리 포 솜 생산의 금융 비용 DOPC (1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-phocholine)와 같은 다른 유사한 지질으로 DOPE를 대체 하 여 달성 될 수 있다. CHEMS는 동물 세포막에서 자연적으로 발견되는 콜레스테롤 분자이며, 이는 지질 이중층 유동성 및 가변성을 보장하는 것이 중요하기 때문에 제형에서 배제되어서는 안된다.16.
캡슐화 프로토콜의 다른 양상들도 적응될 수 있다. 리포좀 성분을 용해하는 데 사용되는 클로로폼은 크기 평균, 균질성 및 함정 효율에 영향을 받지 않고 메탄올로 쉽게 대체 될 수 있습니다. 그러나 일부 단백질 누출은 4 °C16미만의 저장에서 발생할 수 있습니다. 타린을 함유한 황산암모늄용액을 함유한 하룻밤 배양 단계는 필수가 아니다; 그러나, 편의를 위해 코레아외 16에의해 입증된 바와 같이, 나노리포좀 생체물리학적 특성, 캡슐화, 또는 안정성 효율 손실에 대한 손상 없이 수행될 수 있다. 압출 단계는 실온에서 수행되며, 이는 0.1 μm 기공 크기 멤브레인이 사용되는 경우 주사기 사이의 유량을 감소시킬 수 있다.
이 문제를 극복하기 위해 0.2 μm 기공 크기의 멤브레인 을 사용하거나 지질 전이 온도 위의 압출기 홀더를 가열하는 것을 고려해야합니다. 분석가는 불활성화될 수 있는 지질 또는 단백질을 손상시키고 생물학적 활성을 잃지 않도록 주의해야 합니다. 대안적으로, 리포좀 제제는 단백질 분자량에 따라 컷오프 막을 사용하여 초원심분리 대신 HBS에 대해 투석될 수 있다. 초원심분리 후 나노리포좀이 부유되는 완충제의 화학적 특성의 선택은 후속 적용과 직접적으로 관련이 있습니다. 본 연구의 관점은 생체 내 및 시험관 내 검사를 포함하기 때문에, HEPES 완충식염수의 현탁액은 생리학적 조건에 가까운 세포독성 효과 및 pH 범위를 보장하기에 적절했다.
리포솜은 살아있는 세포와 유사하게 미세하게 처리되어야 하며, 더 높은 품질의 SEM 이미지를 얻을 수 있습니다. 고정 및 건조 절차는 진공 조건에서 20 kV 보다 높은 값을 지원하는 더 작은 손상되지 않은 소포의 시각화를 보장하는 데 중요합니다. 그림 2 A, B는 압출 절차와 호환 나노 크기의 소포를 표시합니다. 이 절차에 따라 적절한 샘플 준비를 수행하면 51-396 nm에 이르는 소포의 시각화가 가능합니다. 단계는 진공 및 전자 빔에 기인한 응집체 및 파열한 소포의 대형을 피하기 위하여 에탄올 농도를 증가시켜 고착, 건조, 및 화학적 탈수를 포함합니다. 한편, 도 2C,D는 실온 하에서 건조된 리포솜 소포를 나타내고 여기에 기재된 어떠한 처리도 실시하지 않았으며, 이는 그들이 부적절하게 제조되었다는 것을 의미한다. 부적당한 절차의 결과로, 거대한 소포는 0.2 μm 기공 크기 막을 통해 압출 후에도 형성됩니다. 파열 된 소포는 진공 및 전자 빔 손상의 결과로 두 패널에서 관찰됩니다.
나노리포솜 소포는 대장암 세포에 대한 생리활성 화합물인 레스베라트롤(3,5,4'-트리하이드록시스틸벤)을 포함한 소수성 분자에 대한 캡슐화 및 전달 시스템으로 탐구되었습니다. 캡슐화 절차는 리포좀 나노캡슐(25)에 내재된 생체적합성, 생분해성, 비면역원성 및 비독성 특성을 제공할 뿐만 아니라 친유성화합물의 열악한 용해도를 극복할 수 있다. 프로토콜 적응은 경구 투여를 위한 새로운 리포좀 제형의 개발과 같은 투여 경로 및 목적에 따라 고려되어야 한다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 COPPE / UFRJ, 전자 현미경 검사법 실험실 및 다중 사용자 재료 특성화 실험실 시설에 감사드립니다. 아달베르토 비에이라 박사, 제니퍼 로우 박사, 라파엘 린도소 교수, 유니버시다드 연방 교수 리우데자네이루, UFRJ, 브라질, 초원심분리기의 사용; 알렉산드르 게데스 토레스 박사와 다니엘 페로네 박사에게, 유니버시다드 연방 교수인 리우데자네이루, UFRJ, 브라질, 회전증발기 의 사용; 베를린의 프레이 대학교의 롤랜드 보드마이어 교수와 안드리 다셰프스키 박사에게 자원 을 지원한 후 새로운 방법론을 제공하고 독일에서 6 개월 동안 Erasmus + 펠로우십을 감독했습니다. 로사나 티레 박사와 알레인 페르난데스 박사, 유니버시다드 연방 의원 리오 데 자네이로, UFRJ, 브라질에서 교수 및 기술자, 제타제르 말번의 사용에 대한; 블루마 겐더와 타이사 로드리게스, 교수 및 Universidade 연방 두 리오 데 자네이로에서 기술자, UFRJ, 브라질, SEM의 사용에 대한; 레이첼 앤 하우저 데이비스 박사, Fundação 오스왈도 크루즈의 연구원, 내레이션. 이 연구는 코르데나카오 드 아페르페이소아멘토 드 페소알 드 니벨 슈페리어, 브라질 (CAPES) - 금융 코드 001 (교부금 번호 1627392; 1811605);에 의해 부분적으로 자금을 조달했다; by Fundação 카를로스 Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (그랜트 번호. E-26/202.815/2018; E-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 및 E-26/202.860/2016); 콘셀호 나시오날 드 데센볼비멘토 에 테놀로지코(CNPq) (그랜트 No. 406601/2018-6), 피난시아도라 데 에스투도스 e 프로제토스(FINEP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich Co | A4418 | |
| Analitycal Ballance Mettler H10Tw | Mettler Inc. | 417870 | |
| Beckman DU-640 Spectrophotometer | Beckman Coulter | 8043-30-1090 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Co | 5470 | |
| BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump | Thermo Fischer Scientific | 05-001-022PM | |
| CHEMS (cholesterylhemisuccinate) | Sigma-Aldrich Co | C6512 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich Co | 48520-U | CAUTION |
| Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) | Sigma-Aldrich Co | 209198 | |
| Coverslips (13mm diameter) | Thermo Scientific Nunc | EW-01839-00 | |
| DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) | Lipoid GMBH | 565600.1 | |
| Ethanol Absolute | Sigma-Aldrich Co | 32205 | |
| Folin -Ciocalteu phenol reagent | Sigma-Aldrich Co | F9252 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich Co | G5882 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3375 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich Co | 440191 | CAUTION |
| JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope | JEOL LTD | ||
| Mini Extruder 7 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Lipoid GMBH | 588200.1 | |
| Optima L-90k Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| Phosphate Buffer | Sigma-Aldrich Co | P3619 | |
| Poli-L-lysine | Sigma-Aldrich Co | P8920 | |
| Potassium L-tartrate monobasic | Sigma-Aldrich Co | 243531 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich Co | S7795 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co | S7653 | |
| Sodium Deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich Co | D6750 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich Co | L3771 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich Co | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich Co | RES20908-A7 | |
| TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope | Tescan | #657874 | |
| Trichloroacetic Acid (TCA) | Sigma-Aldrich Co | 91230 | |
| Zetasizer Nano ZSP | Malvern Panalytical LTD | ||
| Ultrasonic cleaning bath model 2510 | Branson |
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