Summary
Deze studie beschrijft klassieke hydratatie met behulp van de dunne lipide-film methode voor de bereiding van nanoliposome gevolgd door nanodeeltjes karakterisatie. Een 47 kDa-hydrofiele en bolvormige proteïne, Tarin, is met succes ingekapseld als een strategie om de stabiliteit te verbeteren, snelle klaring te voorkomen en gecontroleerde afgifte te bevorderen. De methode kan worden aangepast aan hydrofobe moleculen inkaping.
Abstract
Liposome Nanocapsules zijn toegepast voor vele doeleinden in de farmaceutische, cosmetische en voedingsmiddelenindustrie. Kenmerken van liposomen omvatten hun biocompatibiliteit, biologische afbreekbaarheid, niet-immunogeniciteit, niet-toxiciteit, en het vermogen om zowel hydrofiele als hydrofobe verbindingen te verankeren. De klassieke hydratatie van dunne lipide films in een organisch oplosmiddel wordt hierin toegepast als een techniek om Tarin in te kapen, een planten lectine, in nanoliposomes. Nanoliposome grootte, stabiliteit, Entrapment efficiency en morfologische karakterisering worden gedetailleerd beschreven. De nanoliposomes worden bereid met 1,2-dioleoyl-SN-glycerol-3-foshoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-SN-glycero-3-foshoethanolamine-N-[amino (polyethyleenglycol)-2000] (ammoniumzout; DSPE-MPEG 2000), en cholesterylhemisuccinaat (CHEMS) als de belangrijkste bestanddelen. Lipiden worden voor het eerst opgelost in chloroform om een dunne lipide-film te verkrijgen die vervolgens opnieuw wordt gehydrateerd in ammoniumsulfaat oplossing die het eiwit bevat dat moet worden ingesloten en 's nachts worden geïnprimeerd. Vervolgens worden sonicatie-en extrusietechnieken toegepast voor het genereren van nanoformaat unilamellaire blaasjes. De index van de grootte en polydispersiteit van de nano blaasjes wordt bepaald door Dynamische lichtverstrooiing, terwijl de morfologie van de nanovesicle wordt beoordeeld door het scannen van elektronenmicroscopie. De efficiëntie van het Entrapment wordt bepaald door de verhouding tussen de hoeveelheid niet-ingekapselde eiwitten en de oorspronkelijke hoeveelheid oorspronkelijk geladen eiwitten. Homogene liposomen worden verkregen met een gemiddelde grootte van 155 nm en een polydispersiteit indexwaarde van 0,168. Een hoge Entrapment-efficiëntie van 83% wordt bereikt.
Introduction
Het aantal studies dat onderzoek doet naar efficiënte systemen voor de afgifte van geneesmiddelen is de afgelopen jaren gestegen. Echter, beperkingen zoals snelle klaring, slechte biodistributie, en oplosbaarheid op fysiologische pH en onvoldoende cellulaire opname moeten nog worden overtroffen. Het gebruik van nanosystemen is ontstaan als recente vooruitgang in kanker therapeuten, toegepast om de intracellulaire concentratie van geneesmiddelen binnen tumorcellen te verhogen terwijl de toxiciteit in gezonde cellen wordt geminimaliseerd. Bovendien worden nanodeeltjes die zijn verkregen uit een ander bereik van materialen (d.w.z. polymeren, dendrimers, liposomen, virussen, koolstofnanobuizen en metalen zoals ijzeroxide en goud) momenteel toegepast om de antikanker effecten te verbeteren en systemische toxiciteit1. Met name Liposome Nanocapsules zijn toegepast voor vele doeleinden in de farmaceutische, cosmetische en voedingsmiddelenindustrie. In de afgelopen jaren zijn verschillende nutraceutische producten zoals vitaminen, enzymen en kruidenextracten geformuleerd met behulp van liposoom technologie2.
Liposomen zijn sferische blaasjes bestaande uit een of meer concentrische lipide-bilayers spontaan gevormd door de dispersie van fosfolipiden in waterige media3,4. De pool hoofden van de fosfolipiden bevinden zich op de buitenste en binnenste oppervlakken van de membranen, in contact met de waterige omgeving. Vetzuurketens vormen daarentegen de hydrofobe kern van de membranen en worden beschermd tegen water5. Sommige kenmerken van liposomen die ze aantrekkelijk medicijn bezorgings systemen maken, zijn hun biocompatibiliteit, biologische afbreekbaarheid, niet-immunogeniciteit, niet-toxiciteit en het vermogen om zowel hydrofiele als hydrofobe verbindingen te verankeren6.
Liposomen kunnen worden bereid met behulp van verschillende processen stappen zoals agitatie, ultrasoonapparaat, extrusie, lyofilisatie, bevriezing, en ontdooien. Klassieke methoden omvatten achteruit fase verdamping, oplosmiddel injectie, en detergenten dialyse. De meest toegepaste methode is dunne lipide film hydratatie, ook bekend als bangham de methode, die wordt gebruikt voor het verkrijgen van vesicular-lipide vormen7,8,9,10,11. Lamelariteit (het aantal fosfolipide bilayers) en de deeltjesgrootte zijn klassieke parameters die worden gebruikt om liposomen te karakteriseren als 1) unilamellaire blaasjes (Ulv's), gevormd door een unieke fosfolipide dubbeltje en variërend in grootte als volgt: i) kleine unilamellaire blaasjes (suv's, ~ 0,02-0,20 μm), II) grote unilamellaire blaasjes (luv's, ~ 0.2-1.0 μm), en III) gigantische unilamellaire blaasjes (guv's, > 1 μm); of 2) multilamellaire blaasjes (mlv's, > 0,1 μm)3,12. Vesicle grootte is een belangrijke parameter bij het overwegen van therapeutisch gebruik, zoals bij kankerbehandeling, waarbij de maten van < 200 nm ideaal zijn om nano blaasjes de endotheliale barrière te laten passeren en tumorele weefsels4te bereiken.
Hierin werd de inkapseling procedure na de klassieke hydratatie van een dunne lipide filmtechniek 7 beschreven met behulp van Tarin, een plant lectine gekenmerkt als een hydrofiele bolvormigeproteïne 13,14,15 . Nano-sized blaasjes worden geproduceerd door sonicatie-en extrusiestappen in de hoofd techniek, resulterend in stabiele Liposomale nano blaasjes met hoge Entrapment-efficiëntie16.
Protocol
1. bereiding van Tarin Liposomale Nanocapsules16
Opmerking: alle preparaten dienen in drievultaat te worden bereid om een groter volume (7 mL) te verkrijgen en het monster in een ultra-trifuge te laten centrifugeren (zie details hieronder).
- Weeg de liposoom componenten af met een analytische balans, zoals weergegeven in tabel 1.
- Los de lipide-componenten op in chloroform met behulp van een maatkolf van 250 mL die in een roterende verdamper past om verlies van materiaal te voorkomen.
- Roer het mengsel met 150 rpm gedurende 15 min.
- Verwijder de chloroform met behulp van een roterende verdamper onder de volgende omstandigheden:
- Stel de volumetrische kolf mond in op de standaardpositie (25 °) voor optimale efficiëntie, terwijl u in contact komt met het water uit het verwarmingbad.
Opmerking: de apparatuurarm moet op 25 ° worden gekanteld om contact te houden tussen de volumetrische kolf en het waterbad, zonder de verdampings efficiëntie te beïnvloeden of het monster te beschadigen. De standaardpositie kan variëren naargelang het merk van de apparatuur. - Stel de condensor temperatuur in op minimaal 3 °C.
- Stel de temperatuur van het verwarmings bad in op 40 ± 1 °C.
- Stel de rotatie in op 120 rpm.
- Stel het vacuüm in op 207 mbar en kookpunt tot 20 °C.
- Na ~ 25 min, verwijder de kolf en gooi het verdampte oplosmiddel, resterende in de condensor, op de juiste manier.
Opmerking: een dunne en ondoorzichtige film, bestaande uit de liposoom componenten, wordt in deze stap gevormd en kan gemakkelijk worden gevisualiseerd. Het verdampte oplosmiddel in de condensor moet worden opgeslagen in afvalverwijderings ontvangers (gechloreerd) om door een gespecialiseerd bedrijf te worden behandeld voor een passende teruggooi.
- Stel de volumetrische kolf mond in op de standaardpositie (25 °) voor optimale efficiëntie, terwijl u in contact komt met het water uit het verwarmingbad.
- Hydrateer de lipide-film om een lipiden concentratie van 0,01 M te bereiken in 0,3 M ammoniumsulfaat oplossing (pH = 7,4) die Tarin op 1 mg/mL bevat tot een eindvolume van 10 mL.
- Roer het mengsel gedurende 40 minuten en inbroed 's nachts bij 4 °C.
Opmerking: deze stap kan worden beschouwd als een stoppunt. Een nachtelijke incubatie is niet verplicht.
- Roer het mengsel gedurende 40 minuten en inbroed 's nachts bij 4 °C.
- Na incubatie de suspensie gedurende 1 minuut bij 25 °C soniceren (kamertemperatuur; RT) om de vesikel grootte te verminderen en aggregatie te vermijden.
Opmerking: grootte reductie werd uitgevoerd in een ultrasone sonicator onder de volgende omstandigheden: 130 W en 40 kHz. - Voer een 12-cyclus extrusie uit met een 0,2 μm polycarbonaat porie membraan.
Opmerking: voordat het extrusieproces wordt uitgevoerd, test u de mini-extruderassemblage met water om monster lekkage te voorkomen. Een porie membraan van 0,1 μm is ook geschikt. In dit geval, Verwarm de mini-extruderhouder boven de lipide-overgangstemperatuur om extrusie te vergemakkelijken, terwijl de fysisch-chemische eigenschappen van zowel lipiden als eiwitten behouden blijven.- Monteer de onderdelen van de mini-extruder, zoals beschreven in de handleiding van de fabrikant.
- Plaats het polycarbonaat membraan tussen twee pre-natte filter steunen en plaats het in de houder.
- Plaats een lege spuit van 1 mL in het apparaat, vul de andere spuit tot het totale volume met de liposomale suspensie en plaats deze aan de andere kant.
- Voer een 12-cyclus extrusie uit met een 0,2 μm polycarbonaat porie membraan. Duw het monster langzaam van de ene spuit naar de andere. Verzamel de geëxtrudeerde suspensie in een voorgekoelde buis.
Opmerking: het polycarbonaat membraan moet alleen worden vervangen wanneer monster transferentie van de ene spuit naar de andere moeilijk wordt. De liposomale suspensie moet tijdens het extrusieproces duidelijk worden als gevolg van de afname van de grootte als gevolg van de vorming van Suv's. Ongeveer 0,2 mL van het monster kan tijdens deze stap verloren gaan.
- Afzonderlijke liposomen door ultracentrifugatie.
Opmerking: Houd de monsters in een ijsbad totdat de ultracentrifuge klaar is om te worden gebruikt. Scheid Suv's van de overblijvende componenten en ammoniumsulfaat door ultracentrifugatie met behulp van een ultracentrifuge met een zwenk emmer rotor (zie details hieronder).- Weeg het monster in de Titanium buis die bij de rotor past en breng de buizen in balans. Controleer het minimale volume dat nodig is volgens de rotor die wordt gebruikt om beschadiging van de buizen te voorkomen, en pas zo nodig het Liposomale suspensie volume met ammoniumsulfaat aan.
Opmerking: de swing emmer moet altijd worden ondersteund op de stand wanneer buiten de centrifuge om te voorkomen dat krassen op de "Zebra strepen" (dat wil zeggen, de zwarte en witte strepen op de bodem), die worden gebruikt door de centrifuge om de rotatiesnelheid te bepalen. - Schakel het vacuüm in voordat u de centrifuge gebruikt, zodat deze kan worden gekoeld.
- Monteer de Titanium buizen in de zwenk emmer.
Opmerking: Til de buizen naar de positie die ze aannemen tijdens het hardlopen om ervoor te zorgen dat ze perfect zijn gemonteerd. - Laat het vacuüm los, open de centrifuge deur en plaats de rotor erin.
Opmerking: Let op de cirkel markering aan de onderzijde van de rotor, die in de tegenovergestelde richting van dezelfde cirkel markering in de centrifuge zelf moet passen. - Sluit de centrifuge deur, druk op vacuüm en wacht tot het vacuüm reikt van 200 tot < 20 micron of van 26 pa tot < 3 pa.
- Pas de parameters in het ultracentrifuge-display aan op 150.000 x g (het equivalent van 29.600 rpm voor de bovengenoemde zwenk emmer) voor 90 min bij 4 °c (versnelling: Max, vertraging: Max).
Opmerking: zet de snelheid altijd om in x g als de specifieke centrifuge in rpm is ingesteld. Gebruik de centrifuge website om de eenheid te converteren volgens de gebruikte rotor. - Druk op terugroepen, Controleer de voorwaarden en druk op Start om uit te voeren.
Opmerking: wacht tot de centrifuge de gewenste snelheid bereikt. - Na 90 min, laat u het vacuüm los door op de vacuüm knop te drukken en de centrifuge deur te openen wanneer het vacuüm 200-700 micron bereikt (equivalent aan 26-93 PA).
- Schakel de centrifuge uit, verwijder de rotor van binnenuit en laat deze op de Bank staan met de emmers om te drogen.
- Handhaaf de ultra-trifuged monsters op ijs.
- Weeg het monster in de Titanium buis die bij de rotor past en breng de buizen in balans. Controleer het minimale volume dat nodig is volgens de rotor die wordt gebruikt om beschadiging van de buizen te voorkomen, en pas zo nodig het Liposomale suspensie volume met ammoniumsulfaat aan.
- Voorzichtig, scheid supernatant van de pellet door de buis ondersteboven te draaien in een wegwerp centrifugebuis van 15 mL om de supernatant en pellet te scheiden.
Opmerking: Bewaar het supernatant met het niet-ingekapselde eiwit bij 4 °C. Het zal worden gebruikt om de inkapings efficiëntie te bepalen. De pellet verschijnt als een doorschijnende gelei. - Suspendeer de pellet met het ingekapselde eiwit in HEPES gebufferde zoutoplossing (3 mL 1x HBS).
Opmerking: de HBS 2x (Stock Solution) wordt bereid door het verdunnen van de volgende hoeveelheden reagentia in gedestilleerd water: 140 mM NaCl, 1,5 mM na2HPO4, 50 mm Hepes, en vervolgens de pH op 7,4 en het eindvolume aan 100 ml aanpassen. Na2HPO4 kan worden vervangen door NaHCO3of weggelaten om interferentie te voorkomen als de liposoom concentratie moet worden bepaald. De HBS 2x Stock Solution moet worden verdund in gedistilleerd water om HBS 1x te verkrijgen voor gebruik.
2. inkapings efficiëntie
Opmerking: Bepaal de inkapings efficiëntie met behulp van het protocol17van Peterson om lipide-interferentie bij eiwit kwantificering te voorkomen. Alle monsters (BSA-normen en liposoom supernatant) moeten in drievis worden geanalyseerd. Maak ook een lege tube.
- Bereiding van voorraad reagentia en werkoplossingen17
- Bereid voor voorraad reagentia koper-tartraat-carbonaat (CTC) door 10 mL 20% natriumcarbonaat, 200 μL van 0,1% kopersulfaat, 200 μL 0,2% kaliumtartraat met 9,6 mL gedistilleerd water te mengen. Bereid 100 mL 10% natriumdodecylsulfaat (SDS) en 0,8 N natriumhydroxide (NaOH).
- Voor werkoplossingen, bereid 10 mL van 0,15% natrium deoxycholaat (DOC) en 72% Trichloorazijnzuur (TCA). Los 10 mg boviene serumalbumine (BSA) op in 10 mL gedistilleerd water om een standaardoplossing van 1 mg/mL te verkrijgen. Bereid reagens A door gelijke delen van CTC, NaOH, SDS en H2O toe te voegen. reagens B bereiden door het Folin-Ciocalteu fenol reagens 1:5 in gedistilleerd water te verdunen.
Opmerking: reagens A vereist 1 mL voor elke reactie buis, terwijl reagens B 0,5 mL vereist. Om de uiteindelijke volumes van de reagentia A en B te bepalen, definieert u eerst het aantal te gebruiken reactie buisjes, waarbij drie verschillende concentraties BSA, blanco en monsters in drievand worden gezien. Reagens A moet vóór gebruik goed worden gehomogeniseerd en kan gedurende 2 weken bij 25 °C (RT) worden bewaard. Reagens B is ook stabiel bij 25 °C (RT) indien opgeslagen in een amberkleurige fles.
- Neerslag
Opmerking: deze stap wordt uitgevoerd in micro centrifugebuizen.- Verdun het liposoom supernatant met water tot een eindvolume van 1 mL met 5-100 μg eiwit.
Opmerking: de lege buis moet worden gevuld met 1 mL gedistilleerd water. - Voeg 0,1 mL 0,15% DOC toe, homogeniseer door vortexing en inincuberen gedurende 10 minuten bij RT.
- Voeg 0,1 mL 72% TCA toe, meng goed en centrifugeer bij 3.000 x g en RT gedurende 15 minuten.
Opmerking: DOC-TCA bevordert de neerslag van eiwitten en vormt twee verschillende fasen. Het doeleiwit kan worden teruggewonnen door centrifugeren, waarbij lipide-interferentie wordt vermeden. - Gooi het supernatant voorzichtig weg door de buis naar beneden te verteren en leg het op een absorberend papier. Bewaar de pellet voor de volgende stap.
Opmerking: de pellet kan heel moeilijk te zien zijn, maar de buis moet ondersteboven worden gedraaid, zelfs als deze niet zichtbaar is.
- Verdun het liposoom supernatant met water tot een eindvolume van 1 mL met 5-100 μg eiwit.
- Spectrofotometrie
- Suspendeer de pellet verkregen uit stap 2.2.4 in 1 mL gedistilleerd water. Meng grondig om ervoor te zorgen dat de pellet is opgelost en breng het monster over naar een nieuwe reageerbuis.
- Bereid verdunningen van albumine (BSA)-normen tot een eindvolume van 1 mL.
Opmerking: eiwit normen moeten worden bereid tussen 5-100 μg/mL. - Voeg 1 mL reagens A toe aan de buizen van stap 2.3.1 en 2.3.2 zonder uitzondering, meng goed en inincuberen gedurende 10 min bij RT.
Opmerking: SDS kan mogelijke lipideinterferenties verlichten terwijl het helpt bij eiwit solubilization. - Voeg 0,5 mL reagens B toe aan de buizen van stap 2.3.1 en 2.3.2, meng goed en inincuberen gedurende 30 min bij RT, terwijl beschermd tegen het licht.
NB: het Follin-Ciocalteu fenol reagens is een mengsel van fosfoliolybdaat en foshotungstate dat wordt gebruikt voor colorimetrische assays van sommige stikstof bevattende verbindingen, zoals eiwitten. Koperen complexatie verhoogt de reactiviteit van fenolen naar dit reagens, waardoor een blauw/paars complex wordt geproduceerd volgens de eiwitconcentratie. - Bepaal gemiddelde bij 750 nm met behulp van een spectrofotometer.
- Bereken de eiwitconcentratie in het supernatant op basis van de standaard curve als volgt.
- Plot extinctiewaarde (ABS) versus BSA-concentratie (mg/ml) om de hoek coëfficiënt (k) te verkrijgen, gezien een lineaire tendens lijn.
- Bepaal de supernatant-eiwitconcentratie (C) door de verhouding tussen de extinctiewaarde en de hoek coëfficiënt (k), en vermenigvuldig vervolgens met het totale volume als volgt:
- Bepaal de inkapings efficiëntie volgens de volgende formule:
- waar geladen proteïne = 10 mg, niet-ingekapselde proteïne = waarde van C verkregen in stap 2.3.6.2.
Opmerking: in dit geval wordt in totaal 10 mg Tarin opgelost in ammoniumsulfaat oplossing (1 mg/ml) gebruikt om de inkapings procedure uit te voeren, aangezien deze concentratie voldoende is om bevredigende in vitro effecten te verkrijgen13,16, 18.
3. bepaling van grootte en stabiliteit
Opmerking: grootteverdeling en polidispersiteit index (PdI) van de liposomale preparaten worden geëvalueerd door Dynamische lichtverstrooiing (DLS). Een PdI dicht bij 0,1 duidt op een homogene bereiding. Voor de bepaling van de stabiliteit, bewaar liposomen bij 4 °C en controleer de grootteverdeling en de grootte gemiddeld regelmatig.
- Schakel de DLS-apparatuur 30 minuten voor gebruik in om de laser lamp op te warmen.
- Breng het Liposomale preparaat dat in stap 1,10 is verkregen over naar een wegwerpbare maat Cuvette.
- Stel de apparatuurparameters als volgt in: dispergeermiddel type = water (RI = 1,33); materiaal = lipiden (RI = 1,45); en RT.
- Druk op Start en wacht terwijl het apparaat klaar is met lezen.
- Verwijder de cuvette en schakel de apparatuur uit.
Let op: Breng het monster van de Cuvette terug naar de wegwerp centrifugebuis van 15 mL voor daaropvolgende analyses, of gooi het weg als er voldoende is voor nieuwe leesbewerkingen.
4. Morfologische karakterisering
Opmerking: Liposome karakterisering wordt uitgevoerd volgens Murtey en Ramasamy19. Monsters die nanoliposomes bevatten, verkregen bij stap 1,10, worden in drievis bereid.
- Bevestig de glazen dekstroken (diameter 13 mm) in de bodem van een Petri schaaltje met dubbelzijdige tape. Snijd de tape in kleine stukjes (passende maat om de dekstroken te bevestigen), verwijder het beschermende papier eronder en bevestig het op de bodem van de Petri schaal. Verwijder met behulp van een pincet het beschermende papier bovenop de tape en bevestig de dekstroken erop.
Opmerking: Wees voorzichtig in de volgende stappen om de afdek stroken niet vrij te geven en gebruik een sterke tape. - Mantel de dekstroken met poly-L-lysine. Plaats natte filter papieren in de Petri schaal om vocht te behouden en incuberen gedurende 1 uur bij RT (25 °C).
- Spoel de dekstroken na de coating af met gedestilleerd water.
- Vul de afdek stroken met een druppel van het monster uit stap 1,10 en laat ze 1 uur drogen bij RT.
- Om de monsters te fixeren, dek ze af met 4% Glutaaraldehyde bereid in 0,1 M fosfaatbuffer, pH = 7,2. Plaats natte filtreerpapier in de Petri schaal en verzegel het gerecht om het vocht peil te behouden. Inincuberen bij 4 °C gedurende 48 uur.
- Spoel de afdek stroken 3x gedurende 5 minuten af met dezelfde fosfaatbuffer.
- Dehydraat monsters als hieronder: 35% ethanol 1x voor 15 min, 50% ethanol 1x voor 15 min, 75% ethanol 1x voor 15 min, 95% ethanol 2x voor 15 min, en absolute ethanol 3x voor 20 min.
- Chemisch droog de monsters door onderdompeling 2x in 1 − 2 mL Hexamethyldisilazaan (HMDS) gedurende 10 min.
Opmerking: de HMDD'S moeten zorgvuldig worden gemanipuleerd in een rook afzuigkap. De monsters moeten 's nachts in een exsiccator of in de damp afzuigkap op RT kunnen drogen. - Monteer de gedroogde monsters op een stub met een koolstof geleidende plakband.
- Sputter het oppervlak van de dekslip in een vacuüm met een elektrisch geleidende laag (20 nm dikte) van goud-palladium.
- Neem beelden op met een scanning elektronen microscoop (SEM) bij lage vacuüm modus en lage spanning (20 kV).
Representative Results
Figuur 1 beschrijft de voorbereiding van nanoliposome16,20,21. Fosfolipiden, 1,2-dioleoyl-SN-glycerol-3-foshoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-SN-glycero-3-foshoethanolamine-N-[amino (polyethyleenglycol)-2000] (ammoniumzout; DSPE-MPEG 2000), en cholesterylhemisuccinaat (CHEMS), de belangrijkste liposoom bestanddelen, werden voor het eerst opgelost in chloroform om de lipide-film te verkrijgen. De lipide-film werd vervolgens gerehydrateerd in ammoniumsulfaat oplossing met het hydrofiele eiwit (tarine) om te worden ingesloten, en de incubatie werd 's nachts uitgevoerd. Vervolgens werden sonicatie-en extrusietechnieken toegepast om kleine unilamellaire-blaasjes te genereren. De ultracentrifugatie-stap scheidde de liposomale voorbereiding van vrije lipiden en niet-ingekapselde eiwitten, terwijl het supernatant werd gebruikt voor de bepaling van de efficiëntie van het Entrapment.
Nanoliposomes die met de bovengenoemde methodologie werden geproduceerd vertoonden een grootteverdeling variërend van 51 − 396 nm en een gemiddelde grootte van 155 nm (tabel 2). De bereiding was homogeen, omdat de index van de polydispersiteit 0,168 was. Een hoge Entrapment-efficiëntie van 83% kan worden bereikt als de liposomen worden geëxtrudeerd door een poriegrootte membraan van 0,2 μm (tabel 2).
Morfologische nanoliposome karakteristieken werden geëvalueerd door SEM. Figuur 2A, B geeft ronde Liposomale blaasjes in het bereik van 121 nm weer en wordt geanalyseerd op 20 KV, terwijl Figuur 2C, D onvoldoende voorbereide Monsters. Nanoliposomes waren simpelweg lucht gedroogd zonder eerdere fixatie of een andere behandeling die in deze studie werd beschreven. Als gevolg hiervan werden grotere en beschadigde blaasjes in het bereik van 332 μm en geanalyseerd op 5 kV waargenomen.
Figuur 1: schematische weergave van de voorbereiding van nanoliposome. DOPE, PEG en CHEMS, de belangrijkste liposoom bestanddelen, werden voor het eerst opgelost in chloroform om de lipide-film te verkrijgen (1, 2, 3). De lipide-film werd vervolgens gerehydrateerd in een zout buffer met het hydrofiele eiwit (Tarin) om te worden ingesloten, en de incubatie werd 's nachts uitgevoerd (4). Vervolgens werden sonicatie-en extrusietechnieken toegepast om Suv's (5, 6) te genereren. De ultracentrifugatie-stap scheidde de liposomale bereiding van vrije lipiden en niet-ingekapselde eiwitten, terwijl het supernatant werd gebruikt voor het bepalen van de verharding (7). Dit cijfer is gewijzigd van Correa et al.16. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Nanoliposome photomicroscopie door SEM. (a, B) Beelden van ronde-vormige Liposomale blaasjes in het bereik van 121 nm en geanalyseerd op 20 kV. (C, D) Afbeeldingen van onvoldoende voorbereide monsters. Mishandelde monsters voor de waarneming van grotere en/of beschadigde blaasjes, die niet kunnen weerstaan aan vacuüm-en/of spannings condities bij 5 kV. Dit cijfer is gewijzigd van Correa et al.16. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Liposome componenten | Gewicht (g) | Concentratie (mM) | Eindvolume |
| Dope | 0,0420 | 5,7 | 10 mL |
| MPEG 2000-DSPE | 0,1059 | 3,8 | |
| CHEMS | 0,0024 | 0,5 |
DOPE-1,2-dioleoyl-SN-glycerol-3-foshoethanolamine); MPEG 2000-DSPE-1,2-distearoyl-SN-glycero-3-foshoethanolamine-N-[amino (polyethyleenglycol)-2000] (ammoniumzout); CHEMS – cholesterylhemisuccinaat.
Tabel 1: bereiding van Tarin Liposomale Nanocapsules.
| Membraan poriegrootte (μm) | Grootteverdeling (nm) | Gemiddelde grootte (nm) | Polydispersiteit index (PdI) | Piek (nm) | De efficiëntie van het Entrapment |
| 0,2 | 51-396 | 155 | 0.168 | 94 ± 39 | 0,83 |
Grootte en polydispersiteit index werden geëvalueerd door Dynamische lichtverstrooiing, terwijl inkapings efficiëntie werd bepaald volgens Peterson17.
Tabel 2: grootte, polidispersiteit index, en Entrapment efficiëntie van de nanoliposome voorbereiding.
Discussion
Het hier beschreven protocol werd getest door Correa et al.16 om Tarin in te kapen, een immunomodulerende en antitumorele lectine gezuiverd uit Colocasia esculenta22. De methodologie leverde succesvolle resultaten op, waardoor de productie van stabiele nanoliposomes van passende grootte voor therapeutische toepassingen mogelijk werd. De formulering presenteert gecontroleerde afgifte op verschillende pH-niveaus onder fysiologische omstandigheden. Het versterkt ook Tarin farmacologische eigenschappen, zoals remming van humaan multiform glioblastoom U-87 mg en borstkanker MDA-MB-231 cellijnen en stimulatie van muizen beenmergcellen. Het Liposomale preparaat vertoonde geen toxische effecten in gezonde muizen cellen16.
De klassieke methode, voor het eerst beschreven door bangham et al.7, maakt de productie mogelijk van grote multilamellaire liposoom blaasjes, heterogeen in grootte en vorm. Aanpassingen van deze methode, zoals gerapporteerd in de huidige studie, worden met succes toegepast door aanvullende stappen zoals sonicatie en extrusie toe te passen via een 0,2 μm polycarbonaat membraan. Dit maakt de productie van een meer homogene dispersie met betrekking tot de grootte in de nanometer bereik16,23,24. Daarom, om succesvolle resultaten te garanderen, de inkapseling protocol en Liposomale formulering hier beschreven moet strikt worden gevolgd.
De nanoliposome samenstelling werd zorgvuldig geselecteerd om te zorgen voor de vorming van een dubbelmembraan met DOPE, MPEG 2000-DSPE, en CHEMS als de belangrijkste bestanddelen. Dit zijn natuurlijke dier membraan dubbellaagse bestanddelen en de laatstgenoemde kan vloeibaarheid verlenen aan nano-architectuur, waardoor een brede toepassing voor bioactieve samengestelde levering bij mensen.
Nanoliposome pegylation is essentieel om de stabiliteit van de liposoom structuur te garanderen. De afwezigheid van PEG leidt tot de grootte van de uitbreiding, een hoge polydispersiteit index, en lage Entrapment efficiëntie. Optimale resultaten kunnen worden verkregen met DOPE als de belangrijkste liposoom component. Echter, dit is een hoge kosten fosfolipide. De financiële kosten van de productie van nanoliposome kunnen worden bereikt door het vervangen van DOPE met andere soortgelijke lipiden zoals DOPC (1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-fosfocholine). CHEMS is een cholesterol molecuul natuurlijk gevonden in dierlijke celmembranen, die niet mag worden uitgesloten van de formulering, omdat het belangrijk is om te zorgen voor lipide dubbeldetheid en smeedbaarheid16.
Andere aspecten van het inkapseling protocol kunnen ook worden aangepast. De chloroform die wordt gebruikt om de liposomale componenten op te lossen, kan gemakkelijk worden vervangen door methanol zonder effecten op de gemiddelde grootte, homogeniteit en inschakel efficiëntie. Echter, sommige eiwit lekkage kan optreden bij opslag onder 4 °C16. De nachtelijke incubatie stap met ammoniumsulfaat oplossing die Tarin bevat, is niet verplicht; echter, voor het gemak kan worden uitgevoerd zonder schade aan nanoliposomale biopfysische kenmerken, inkaping, of stabiliteit efficiëntie verliezen, zoals aangetoond door Correa et al.16. De extrusiestap wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur, die de stroomsnelheid tussen de spuiten kan verlagen als een poriegrootte membraan van 0,1 μm wordt gebruikt.
Om dit probleem te verhelpen, moet het gebruik van een poriegrootte membraan van 0,2 μm of verwarming van de extruderhouder boven de lipide-overgangstemperatuur worden overwogen. De analist moet oppassen niet te beschadigen de lipiden of eiwitten die kunnen worden geïnactiveerd en verliezen biologische activiteit. Als alternatief kan liposomaal preparaat worden gedialyseerd tegen HBS in plaats van ultracentrifugatie, met behulp van een cut-off membraan volgens eiwit moleculair gewicht. De keuze van de chemische aard van de buffer waarin nanoliposomes worden opgeschort na ultracentrifugatie is direct gerelateerd aan de daaropvolgende toepassing. Aangezien de perspectieven van deze studie in vivo en in vitro testen omvatten, was suspensie in HEPES gebufferde zoutoplossing voldoende om te zorgen voor geen cytotoxische effecten en een pH-bereik in de buurt van fysiologische omstandigheden.
Liposomen moeten fijn worden behandeld, vergelijkbaar met levende cellen, om een hogere kwaliteit SEM-beelden te verkrijgen. Fixatie-en droog procedures zijn belangrijk om te zorgen voor de visualisatie van kleinere intacte blaasjes die waarden hoger dan 20 kV ondersteunen onder vacuüm condities. Figuur 2 A, B geeft zilver blaasjes aan die compatibel zijn met de extrusieprocedure. Visualisatie van blaasjes variërend van 51-396 nm is mogelijk als een adequate monstervoorbereiding na deze procedure wordt uitgevoerd. De stappen omvatten fixatie, drogen door toenemende ethanol concentraties, en chemische uitdroging om de vorming van aggregaten en gescheurde blaasjes veroorzaakt door de vacuüm-en elektronenstraal te voorkomen. Aan de andere kant toont Figuur 2C, D liposomen blaasjes gedroogd onder kamertemperatuur en niet onderworpen aan de hier beschreven behandelingen, wat betekent dat ze onvoldoende voorbereid waren. Als gevolg van de ontoereikende procedure worden er reuzen blaasjes gevormd, zelfs na extrusie door een poriegrootte van 0,2 μm. In beide panelen worden ook gescheurde blaasjes waargenomen als gevolg van beschadiging van de vacuüm-en elektronenstraal.
Nanoliposome blaasjes zijn onderzocht als een inkapseling en levering systeem voor hydrofobe moleculen, met inbegrip van Resveratrol (3, 5, 4 '-trihydroxystilbene), een bioactieve verbinding tegen colorectale kankercellen. De inkapings procedure kan de slechte oplosbaarheid van lipofiele verbindingen overwinnen, naast het verstrekken van biocompatibiliteit, biologische afbreekbaarheid, niet-immunogeniciteit en niet-toxiciteits kenmerken die inherent zijn aan liposoom Nanocapsules25. Er moet rekening worden gehouden met protocol aanpassingen, afhankelijk van de toedieningsroute en het doel, zoals de ontwikkeling van nieuwe liposoom formuleringen voor orale toediening.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs zijn dankbaar voor de COPPE/UFRJ, elektronische microscopie laboratorium, en multi user materialen karakteriseren laboratoriumfaciliteiten; aan Dr. Adalberto Vieyra, Dr. Jennifer Lowe en Rafael Lindoso, professoren aan de Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brazilië, voor het gebruik van de ultracentrifuge; aan Dr. Alexandre Guedes Torres en Daniel Perrone, professoren aan de Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brazilië, voor het gebruik van de roterende verdamper; aan professor Roland Bodmeier en Dr. Andriy Dashevskiy van Freie Universität in Berlijn, die geholpen met middelen, voorzien van nieuwe methodologieën, en begeleid ACNTF tijdens een 6 maanden Erasmus + Fellowship in Duitsland; aan Dr. Rossana Thiré en Aline Fernandes, professor en technicus aan de Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brazilië, voor het gebruik van Zetasizer Malvern; aan Bluma Guenther en Taissa Rodrigues, professor en technicus aan de Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brazilië, voor het gebruik van de SEM; aan Dr. Rachel Ann Hauser Davis, onderzoeker bij Fundação Oswaldo Cruz, voor vertelling. Deze studie werd deels gefinancierd door de Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de nível Superior, Brasil (CAPES)-Finance code 001 (Grant No. 1627392; 1811605); door Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (Grant No. E-26/202.815/2018; E-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 en E-26/202.860/2016); door Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (Grant No. 406601/2018-6), en Financiadora de Estudos e projetos (FINEP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich Co | A4418 | |
| Analitycal Ballance Mettler H10Tw | Mettler Inc. | 417870 | |
| Beckman DU-640 Spectrophotometer | Beckman Coulter | 8043-30-1090 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Co | 5470 | |
| BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump | Thermo Fischer Scientific | 05-001-022PM | |
| CHEMS (cholesterylhemisuccinate) | Sigma-Aldrich Co | C6512 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich Co | 48520-U | CAUTION |
| Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) | Sigma-Aldrich Co | 209198 | |
| Coverslips (13mm diameter) | Thermo Scientific Nunc | EW-01839-00 | |
| DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) | Lipoid GMBH | 565600.1 | |
| Ethanol Absolute | Sigma-Aldrich Co | 32205 | |
| Folin -Ciocalteu phenol reagent | Sigma-Aldrich Co | F9252 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich Co | G5882 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3375 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich Co | 440191 | CAUTION |
| JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope | JEOL LTD | ||
| Mini Extruder 7 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Lipoid GMBH | 588200.1 | |
| Optima L-90k Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| Phosphate Buffer | Sigma-Aldrich Co | P3619 | |
| Poli-L-lysine | Sigma-Aldrich Co | P8920 | |
| Potassium L-tartrate monobasic | Sigma-Aldrich Co | 243531 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich Co | S7795 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co | S7653 | |
| Sodium Deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich Co | D6750 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich Co | L3771 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich Co | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich Co | RES20908-A7 | |
| TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope | Tescan | #657874 | |
| Trichloroacetic Acid (TCA) | Sigma-Aldrich Co | 91230 | |
| Zetasizer Nano ZSP | Malvern Panalytical LTD | ||
| Ultrasonic cleaning bath model 2510 | Branson |
References
- Wang, X., Wang, Y., Chen, Z. G., Shin, D. M. Advances of cancer therapy by nanotechnology. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 41 (1), 1 (2009).
- Keller, B. C. Liposomes in nutrition. Trends in Food Science & Technology. 12 (1), 25-31 (2001).
- Frézard, F., Schettini, D. A., Rocha, O. G., Demicheli, C. Lipossomas: propriedades físico-químicas e farmacológicas, aplicações na quimioterapia à base de antimônio. Quimica Nova. 28 (3), 511-518 (2005).
- Ferreira, D. dS., Lopes, S. C. dA., Franco, M. S., Oliveira, M. C. pH-sensitive liposomes for drug delivery in cancer treatment. Therapeutic Delivery. 4 (9), 1099-1123 (2013).
- Papachristos, A., Pippa, N., Ioannidis, K., Sivolapenko, G., Demetzos, C. Liposomal forms of anticancer agents beyond anthracyclines: present and future perspectives. Journal of Liposome Research. 25 (2), 166-173 (2015).
- Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102 (2013).
- Bangham, A., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), 238-252 (1965).
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4194-4198 (1978).
- Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 298 (4), 1015-1019 (1973).
- Zumbuehl, O., Weder, H. G. Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid/detergent mixed micelles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 640 (1), 252-262 (1981).
- Szebeni, J., et al. Oxidation and denaturation of hemoglobin encapsulated in liposomes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 798 (1), 60-67 (1984).
- Coelho, J. F., et al. Drug delivery systems: Advanced technologies potentially applicable in personalized treatments. EPMA Journal. 1 (1), 164-209 (2010).
- Pereira, P. R., et al. Purification and characterization of the lectin from taro (Colocasia esculenta) and its effect on mouse splenocyte proliferation in vitro and in vivo. The Protein Journal. 33 (1), 92-99 (2014).
- Pereira, P. R., et al. Structural analysis and binding properties of isoforms of tarin, the GNA-related lectin from Colocasia esculenta. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (1), 20-30 (2015).
- Pereira, P. R., et al. High-resolution crystal structures of Colocasia esculenta tarin lectin. Glycobiology. 27 (1), 50-56 (2016).
- Correa, A., Vericimo, M. A., Dashevskiy, A., Pereira, P. R., Paschoalin, V. M. F. Liposomal Taro Lectin Nanocapsules Control Human Glioblastoma and Mammary Adenocarcinoma Cell Proliferation. Molecules. 24 (3), 471 (2019).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Merida, L. A., et al. Tarin stimulates granulocyte growth in bone marrow cell cultures and minimizes immunosuppression by cyclo-phosphamide in mice. PLoS ONE. 13 (11), e0206240 (2018).
- Murtey, M. D., Ramasamy, P. Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy - Life Sciences. Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. Janecek, M., Kral, R. , InTechOpen. (2016).
- Andrade, C. A., Correia, M. T., Coelho, L. C., Nascimento, S. C., Santos-Magalhães, N. S. Antitumor activity of Cratylia mollis lectin encapsulated into liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 278 (2), 435-445 (2004).
- dos Santos Ferreira, D., et al. Development of a bone-targeted pH-sensitive liposomal formulation containing doxorubicin: physicochemical characterization, cytotoxicity, and biodistribution evaluation in a mouse model of bone metastasis. International Journal of Nanomedicine. 11, 3737 (2016).
- Pereira, P. R., Corrêa, A. C. N. T. F., Vericimo, M. A., Paschoalin, V. M. F. Tarin, a Potential Immunomodulator and COX-Inhibitor Lectin Found in Taro (Colocasia esculenta). Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 17 (4), 878-891 (2018).
- Olson, F., Hunt, C., Szoka, F., Vail, W., Papahadjopoulos, D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 557 (1), 9-23 (1979).
- Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. Extrusion technique to generate liposomes of defined size. Methods in Enzymology. 367, 3 (2003).
- Soo, E., et al. Enhancing delivery and cytotoxicity of resveratrol through a dual nanoencapsulation approach. Journal of Colloid and Interface Science. 462, 368-374 (2016).
