Summary
Bu çalışmada nanopartikül karakterizasyonu takip nanoliposome hazırlık için ince lipid film yöntemi kullanılarak klasik hidrasyon açıklanır. A 47 kDa-hidrofilik ve küresel protein, tarin, başarıyla istikrarı artırmak için bir strateji olarak kapsüllenir, hızlı açıklık önlemek, ve kontrollü salınımı teşvik. Bu yöntem hidrofobik moleküllerkapsülasyonuna adapte edilebilir.
Abstract
Lipozom nanokapsüller ilaç, kozmetik ve gıda endüstrilerinde birçok amaç için uygulanmıştır. Lipozomların özellikleri biyouyumluluk, biyobozunurluk, immünojenite dışı, toksisite olmayan ve hem hidrofilik hem de hidrofobik bileşikleri tuzağa düşürme yeteneğini içerir. Organik bir çözücüde ince lipid filmlerinin klasik hidrasyonu, nanoliposomes'te bir bitki lektini olan tarini kapsüllemek için bir teknik olarak burada uygulanır. Nanoliposome boyutu, stabilite, tuzak verimliliği ve morfolojik karakterizasyon ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Nanoliposomesomes kullanılarak hazırlanır 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-fosfoetanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosfoetanolamine-N-[amino(polietilen glikol)-2000] (amonyum tuzu; DSPE-MPEG 2000) ve kolesterylhemisuccinate (CHEMS) ana bileşenleri olarak. Lipidler ilk sonra bir gecede bağlı ve inkübasyon protein içeren amonyum sülfat çözeltisi rehydrated ince bir lipid film elde etmek için kloroform içinde çözülür. Daha sonra, sonication ve ekstrüzyon teknikleri nanoboyutlu unilamellar veziküller oluşturmak için uygulanır. Nanoveziküllerin büyüklüğü ve polidispersitinin indeksi dinamik ışık saçılımı ile belirlenirken, nanovezikül morfolojisi taramalı elektron mikroskobu ile değerlendirilir. Tuzak verimliliği, kapsülsüz protein miktarının başlangıçta yüklenen proteinin orijinal miktarına oranı ile belirlenir. Homojen lipozomlar ortalama büyüklüğü 155 nm ve polidispersitin indeks değeri 0.168 ile elde edilir. %83'lük yüksek tuzak verimi elde edilir.
Introduction
Verimli uyuşturucu dağıtım sistemlerini araştıran çalışmaların sayısı son yıllarda artmıştır. Ancak, hızlı açıklık, kötü biyodağıtım ve fizyolojik pH çözünürlük ve yetersiz hücresel alım gibi sınırlamalar hala aşılması gerekir. Nanosistemlerin kullanımı kanser terapötik son ilerleme olarak ortaya çıkmıştır, sağlıklı hücrelerde toksisiteyi en aza indirirken kanserli hücrelerin içinde ilaçların hücre içi konsantrasyonunu artırmak için uygulanan. Ayrıca, farklı bir malzeme yelpazesinden elde edilen nano partiküller (yani, polimerler, dendrimerlar, lipozomlar, virüsler, karbon nanotüpler ve demir oksit ve altın gibi metaller) şu anda antikanser etkilerini artırmak ve sistemik azaltmak için uygulanmaktadır. toksisite1. Özellikle lipozom nanokapsüller ilaç, kozmetik ve gıda endüstrilerinde birçok amaç için uygulanmıştır. Son yıllarda, vitaminler, enzimler ve bitkisel özler gibi çeşitli nutraceutical ürünler lipozom teknolojisikullanılarakformüle edilmiştir 2.
Lipozomlar bir veya daha fazla konsantrik lipid iki kat larından oluşan küresel veziküllerdir. Fosfolipidlerin kutup başları, sulu ortamla temas halinde, membranların dış ve iç yüzeylerinde yer alır. Buna karşılık, yağ asidi zincirleri membranların hidrofobik çekirdekformu ve su korunur 5. Onları çekici ilaç dağıtım sistemleri yapmak lipozomların bazı özellikleri biyouyumluluk dahil, biyobozunurluk, non-immünojenite, non-toksisite, ve yeteneği hem hidrofilik ve hidrofobik bileşikler ikapan6.
Lipozomlar ajitasyon, sonication, ekstrüzyon, lyophilization, dondurma ve eritme gibi çeşitli süreçler adımları kullanılarak hazırlanabilir. Klasik yöntemler arasında ters faz buharlaşması, solvent enjeksiyonu ve deterjan diyalizi sayılabilir. En çok uygulanan yöntem ince lipid film hidrasyon, ayrıca Bangham yöntemi olarak bilinen, veziküler-lipid formları elde etmek için kullanılan7,8,9,10,11. Lamellarite (fosfolipid çift katmanlı sayısı) ve partikül boyutu lipozomları karakterize etmek için kullanılan klasik parametrelerdir 1) unilamellar veziküller (ULV), benzersiz fosfolipid çift katmanlı oluşan ve aşağıdaki gibi boyutu değişen: i) küçük unilamellar veziküller (SUV' lar, ~0.02-0.20 μm), ii) büyük unilamellar veziküller (LUVs, ~0.2-1.0 μm) ve iii) dev unilamellar veziküller (GUVs, >1 μm); veya 2) multilamellar veziküller (MLVs, >0.1 μm)3,12. Vezikül boyutu terapötik kullanım için düşünürken önemli bir parametredir, kanser tedavisinde olduğu gibi, hangi boyutlarda <200 nm endotel bariyerini geçmek ve tümöral dokulara ulaşmak için nanoveziküller izin vermek için idealdir4.
Burada, ince bir lipid film tekniği7 klasik hidrasyon aşağıdaki kapsülleme prosedürü tarin kullanılarak tarif edilince, bir bitki lektin hidrofilik globüler protein olarak karakterize13,14,15 . Nanoboyutlu veziküller ana teknikte sonication ve ekstrüzyon adımları dahil edilerek üretilmektedir, yüksek tuzak verimliliği ile kararlı lipozomal nanoveziküller sonuçlanan16.
Protocol
1. Tarin lipozomal nanokapsüllerin hazırlanması16
NOT: Tüm preparatlar daha büyük bir hacim (7 mL) elde etmek ve numunenin ultracentrifuge ile santrifüj edilebilmesi için triplicate olarak hazırlanmalıdır (aşağıdaki ayrıntılara bakın).
- Tablo1'de gösterildiği gibi, lipozom bileşenleri analitik bir denge kullanarak tartın.
- Malzeme kaybını önlemek için bir döner evaporatör sığar 250 mL hacimsel şişe kullanarak kloroform lipid bileşenleri eritin.
- 15 dakika boyunca 150 rpm karışımı karıştırın.
- Kloroformu aşağıdaki koşullar altında bir döner evaporatör kullanarak çıkarın:
- Isıtma banyosundaki suyla temas halindeyken, optimum verimlilik için hacimsel şişe ağzını standart konuma (25°) ayarlayın.
NOT: Ekipman kolu, buharlaşma verimliliğini etkilemez veya numuneye zarar vermezken hacimsel şişe ile su banyosu arasındaki teması korumak için 25° eğimli olmalıdır. Standart konum ekipman markasına göre değişebilir. - Kondansatör sıcaklığını en az 3 °C'ye ayarlayın.
- Isıtma banyo sıcaklığını 40 ± 1 °C'ye ayarlayın.
- Döndürmeyi 120 rpm'e ayarlayın.
- Vakumu 207 mbar ve kaynama noktasını 20 °C'ye ayarlayın.
- ~ 25 dk sonra, şişeçıkarın ve uygun kondansatör kalan, buharlaşmış çözücü atın.
NOT: Bu adımda lipozom bileşenlerinden oluşan ince ve opak bir film oluşturulur ve kolayca görselleştirilebilmiştir. Kondansatörde kalan buharlaşan çözücü, uygun bir atıliş için özel bir şirket tarafından işlenecek bertaraf alıcılarına (klorlu) depolanmalıdır.
- Isıtma banyosundaki suyla temas halindeyken, optimum verimlilik için hacimsel şişe ağzını standart konuma (25°) ayarlayın.
- 1 mg/mL'de tarin içeren 0,3 M amonyum sülfat çözeltisinde (pH = 7,4) lipid konsantrasyonuna ulaşmak için lipid filmini 10 mL'lik son hacminemde nemlendirin.
- Karışımı 40 dk karıştırın ve 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
NOT: Bu adım bir durak noktası olarak kabul edilebilir. Gece kuluçka zorunlu değildir.
- Karışımı 40 dk karıştırın ve 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
- Kuluçkadan sonra süspansiyonu 25 °C'de 1 dakika sonicate edin (oda sıcaklığında; RT) vezikül boyutunu azaltmak ve toplama önlemek için.
NOT: Boyut küçültme ultrasonik sonicator aşağıdaki koşullar altında yapıldı: 130 W ve 40 kHz. - 0,2 μm polikarbonat gözenek membranı ile 12 döngülü ekstrüzyon gerçekleştirin.
NOT: Ekstrüzyon işleminden önce, numune sızıntısını önlemek için mini ekstrüder tertibatını su kullanarak test edin. 0,1 μm gözenek membranı da uygundur. Bu durumda, hem lipidlerin hem de proteinlerin fizyokimyasal özelliklerini korurken, ekstrüzyonu kolaylaştırmak için mini ekstrüzyon tutucuyu lipid geçiş sıcaklığının üzerinde ısıtın.- Üretici kılavuzunda açıklandığı gibi mini ekstrüder parçaları uygun.
- Polikarbonat membranı iki önceden ıslak filtre destekleri arasına yerleştirin ve tutucuya yerleştirin.
- Cihaza 1 mL boş şırınga yerleştirin, diğer şırıngayı liposomal süspansiyonla toplam hacmine doldurun ve karşı tarafa takın.
- 0,2 μm polikarbonat gözenek membranı ile 12 döngülü ekstrüzyon gerçekleştirin. Numuneyi bir şırıngadan diğerine yavaşça itin. Önceden soğutulmuş bir tüp içinde ekstrüzyon süspansiyon toplayın.
NOT: Polikarbonat membran, ancak bir şırıngadan diğerine numune aktarımı zorlaştığında değiştirilmelidir. Lipozomal süspansiyon SUV oluşumu nedeniyle boyut küçültme sonucu ekstrüzyon işlemi sırasında netolmalıdır. Bu adımda numunenin yaklaşık 0,2 mL'si kaybedilebilir.
- Ultrasantrifüj ile ayrı lipozomlar.
NOT: Ultracentrifuge kullanıma hazır olana kadar numuneleri bir buz banyosunda saklayın. Kalan bileşenlerden ayrı SUV'lar ve ultracentrifugation tarafından amonyum sülfat bir salıncak kova rotor ile ultracentrifuge kullanarak (aşağıdaki ayrıntılara bakın).- Numuneyi rotora uyan titanyum tüpte tartın ve tüpleri dengeleyin. Tüplere zarar vermemek için kullanılan rotora göre gereken minimum hacmi kontrol edin ve gerekirse lipozomal süspansiyon hacmini amonyum sülfatile ayarlayın.
NOT: Salıncak kovası, santrifüjün dışında dönme hızını belirlemek için santrifüj tarafından kullanılan "zebra çizgileri" (yani alttaki siyah ve beyaz çizgiler) çizilmemek için her zaman standda desteklenmelidir. - Soğutabilmesi için santrifüjü kullanmadan önce vakumu açın.
- Titanyum tüpleri salıncak kovasına yerleştirin.
NOT: Tüpleri, mükemmel bir şekilde takıldıklarından emin olmak için çalışırken varsayarları konuma getirin. - Vakum bırakın, santrifüj kapağını açın ve rotor içinde yerleştirin.
NOT: Rotor alt kısmında daire işareti dikkat edin, hangi santrifüj kendisi içine aynı daire işareti ters yönde uyması gerekir. - Santrifüj kapağını kapatın, Vakum'a basın ve vakum 200 ila <20 mikrondan 26 Pa'dan <3 Pa'ya ulaşana kadar bekleyin.
- Ultracentrifuge ekranındaki parametreleri 4 °C'de 90 dakika (hızlanma: max, yavaşlama: max) için 150.000 x g (söz konusu salıncak kovası için 29.600 rpm'ye eşdeğer) ayarlayın.
NOT: Belirli santrifüj rpm'de ayarlanmışsa hızı her zaman x g'ye dönüştürün. Kullanılan rotora göre üniteyi dönüştürmek için santrifüj web sitesini kullanın. - Geri Çağır'a basın, koşulları kontrol edin ve çalıştırmak için Başlat'a basın.
NOT: Santrifüj istenilen hıza ulaşana kadar bekleyin. - 90 dakika sonra Vakum düğmesine basarak vakum bırakın ve vakum 200-700 mikron (26-93 Pa eşdeğer) ulaştığında santrifüj kapağını açın.
- Santrifüjkapatın, içinden rotoru çıkarın ve kovalar kuruması için tezgahta bırakın.
- Ultrasantrifüj lüzmitli numuneleri buz üzerinde saklar.
- Numuneyi rotora uyan titanyum tüpte tartın ve tüpleri dengeleyin. Tüplere zarar vermemek için kullanılan rotora göre gereken minimum hacmi kontrol edin ve gerekirse lipozomal süspansiyon hacmini amonyum sülfatile ayarlayın.
- Dikkatlice, supernatant ve pelet ayırmak için tek kullanımlık 15 mL santrifüj tüp içine tüp baş aşağı çevirerek pelet ayrı supernatant.
NOT: Kapsülsüz protein içeren süpernatantı 4 °C'de saklayın. Kapsülleme verimliliğini belirlemek için kullanılacaktır. Pelet yarı saydam bir jöle olarak görünür. - HEPES tamponlu salin (1x HBS 3 mL) kapsüllü protein içeren pelet askıya alın.
NOT: HBS 2x (stok çözeltisi) distile suda aşağıdaki reaktif miktarları seyreltilerek hazırlanır: 140 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4, 50 mM HEPES, daha sonra pH 7.4 ve son hacim 100 mL ayarlanarak. Na2HPO4, lipozom konsantrasyonu belirlenecekse girişimden kaçınmak için NaHCO3ile değiştirilebilir veya atlanabilir. HBS 2x stok çözeltisi kullanmadan önce HBS 1x elde etmek için distile suda seyreltilmelidir.
2. Kapsülleme verimliliği
NOT: Protein nicelemine lipid girişiminiönlemek için Peterson'ın protokol 17'sini kullanarak kapsülleme verimliliğini belirleyin. Tüm numuneler (BSA standartları ve lipozom supernatant) triplicate olarak analiz edilmelidir. Ayrıca boş bir tüp hazırlayın.
- Stok reaktiflerinin ve çalışma çözümlerinin hazırlanması17
- Stok reaktifleri için bakır-tartarat-karbonat (CTC) %20 sodyum karbonat, %200 0,1 bakır sülfat, %0,2 potasyum tartarat ve 9,6 mL distile su karıştırılarak bakır-tartarat-karbonat (CTC) hazırlayın. 100 mL %10 sodyum dodecyl sülfat (SDS) ve 0.8 N sodyum hidroksit (NaOH) hazırlayın.
- Çalışma çözümleri için 10 mL %0,15 sodyum deoksikoilat (DOC) ve %72 trikloroasetik asit (TCA) hazırlayın. 1 mg/mL standart çözelti elde etmek için 10 mg sığır serum albuminini (BSA) 10 mL distile suda çözün. CTC, NaOH, SDS ve H2O.'nun eşit parçalarını ekleyerek A reaktifini hazırlayın Folin-Ciocalteu fenol reaktifini 1:5 distile suda seyrelterek B'yi hazırlayın.
NOT: Reaktif A her reaksiyon tüpü için 1 mL, B reaktifi ise 0,5 mL gerektirir. A ve B reaktiflerinin son hacimlerini belirlemek için, öncelikle kullanılacak reaksiyon tüplerinin sayısını tanımlayın, üç ayrı BSA konsantrasyonu, boş ve üç ölçülü numune ler göz önünde bulundurularak. Reaktif A kullanılmadan önce iyi homojenize edilmeli ve 25 °C 'de (RT) 2 hafta saklanabilir. Reaktif B, kehribar şişede depolanırsa 25 °C 'de (RT) kararlıdır.
- Yağış
NOT: Bu adım mikrosantrifüj tüplerde yapılır.- 5-100 μg protein içeren 1 mL'lik son bir hacimde lipozom süpernatantını su ile seyreltin.
NOT: Boş tüp 1 mL distile su ile doldurulmalıdır. - 0.1 mL % 0.15 DOC ekleyin, girdap ile homojenize ve RT 10 dakika kuluçka.
- 0.1 mL 72% TCA ekleyin, iyice karıştırın ve 3.000 x g ve RT 15 dakika için santrifüj.
NOT: DOC-TCA protein çökeltmesini teşvik ederek iki farklı evre oluşturur. Hedef protein santrifüj ile kurtarılabilir, lipid girişimkaçınarak. - Tüpü aşağı doğru çevirerek ve emici bir kağıda koyarak supernatant'ı dikkatlice atın. Peleti sonraki adıma kaydedin.
NOT: Pelet görmek çok zor olabilir, ancak tüp görünür olmasa bile ters çevrilmelidir.
- 5-100 μg protein içeren 1 mL'lik son bir hacimde lipozom süpernatantını su ile seyreltin.
- Spektrofotometri
- 1 mL distile su damlet 2.2.4 adım dan elde edilen pelet askıya alın. Peletin çözünmüş olduğundan emin olmak için iyice karıştırın ve numuneyi yeni bir test tüpüne aktarın.
- Albumin (BSA) standartlarının seyreltmelerini 1 mL'lik son bir hacme hazırlayın.
NOT: Protein standartları 5-100 μg/mL arasında hazırlanmalıdır. - Adsız adım 2.3.1 ve 2.3.2'den tüplere 1 mL reaktif A ekleyin, iyi karıştırın ve RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: SDS protein solubilizasyon yardımcı olurken olası lipid girişimlerini rahatlatmak olabilir. - Adım 2.3.1 ve 2.3.2'den tüplere 0,5 mL reaktif B ekleyin, iyi karıştırın ve ışıktan korunurken RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Follin-Ciocalteu fenol reaktifi, proteinler gibi bazı azot içeren bileşiklerin kolorimetrik tahlillerinde kullanılan fosfolibat ve fosfotungdevletin karışımıdır. Bakır kompleksi fenollerin bu reaktife karşı reaktivitesini arttırarak protein konsantrasyonuna göre mavi/mor bir kompleks üretir. - Bir spektrofotometre kullanarak 750 nm'de absorbansları belirleyin.
- Aşağıdaki gibi standart eğrisi dayalı supernatant protein konsantrasyonu hesaplayın.
- Doğrusal bir eğilim çizgisi göz önünde bulundurularak açısal katsayı (k) eldeetmek için çizim emici değer (Abs) ve BSA konsantrasyonu (mg/mL).
- Süpernatant protein konsantrasyonu(C) emicideğer ve açısal katsayı(k) arasındaki oran ile belirlemek, sonra aşağıdaki gibi toplam hacmi ile çarpmak:
- Kapsülleme verimliliğini aşağıdaki formüle göre belirleyin:
- yüklenmiş protein = 10 mg, kapsülsüz protein = 2.3.6.2 adımda elde edilen C değeri.
NOT: Bu durumda, amonyum sülfat çözeltisinde çözünmüş toplam 10 mg tarin (1 mg/mL) kapsülleme işleminin gerçekleştirilmesi için kullanılır, çünkü bu konsantrasyon in vitro etkileri tatmin edici elde etmek için yeterlidir13,16, 18yaşında.
3. Boyut ve stabilite tayini
NOT: Lipozomal preparatların boyut dağılımı ve polidispersitinin indeksi (PdI) dinamik ışık saçılımı (DLS) ile değerlendirilir. 0,1'e yakın bir PdI homojen bir hazırlığı gösterir. Stabilite tayini için lipozomları 4 °C'de saklayın ve boyut dağılımını ve boyut ortalamalarını düzenli olarak kontrol edin.
- Lazer lambayı ısıtmak için kullanmadan önce DLS ekipmanını 30 dk açın.
- Adım 1.10'da elde edilen lipozomal preparatı tek kullanımlık boyutlandırma cuvette'ye aktarın.
- Ekipman parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: dağıtıcı tipi = su (RI = 1,33); malzeme = lipidler (RI = 1,45); ve RT.
- Başlat'a basın ve ekipman okumasını bitirirken bekleyin.
- Cuvette çıkarın ve ekipman kapatın.
NOT: Ya sonraki analizler için cuvette'den tek kullanımlık 15 mL santrifüj tüpüne numuneyi aktarın ya da yeni okumalar için yeterli miktarda varsa atın.
4. Morfolojik karakterizasyon
NOT: Lipozom karakterizasyonu Murtey ve Ramasamy19'agöre yapılır. Adım 1.10'da elde edilen nanolipozomiçeren numuneler triplicate olarak hazırlanır.
- Cam kapakları (13 mm çapında) bir Petri kabının altındaki çift taraflı bantla sabitleyin. Bandı küçük parçalara kesin (kapakları düzeltmek için uygun boyutta), altındaki koruyucu kağıdı çıkarın ve Petri kabının altına yerleştirin. Cımbız yardımıyla, bandın üstündeki koruyucu kağıdı çıkarın ve üzerindeki kapakları düzeltin.
NOT: Kapakları serbest bırakmamak için aşağıdaki adımlarda dikkatli olun ve güçlü bir bant kullanın. - Örtüleri poli-L-lizin ile kaplar. Nemi korumak ve RT'de (25 °C) 1 saat kuluçkaya yatabilmek için Petri kabının içine ıslak filtre kağıtları yerleştirin.
- Kaplamadan sonra, kapakları distile suyla durulayın.
- Kapakçıkları adım 1.10'dan bir damla numuneyle doldurun ve RT'de 1 saat kurumasını bekleyin.
- Numuneleri onarmak için 0,1 M fosfat tamponu, pH = 7,2 ile hazırlanan %4 glutaraldehit ile kaplayın. Petri kabının içine ıslak filtre kağıtları yerleştirin ve nem seviyelerini korumak için kabı kapatın. 4 °C'de 48 saat kuluçkaya yatırın.
- Aynı fosfat tamponu ile 5 dakika boyunca 3x kapakları durular.
- Aşağıdaki gibi dehydrate örnekleri: 15 dakika için% 35 etanol 1x, 15 dakika için% 50 etanol 1x, 15 dakika için% 75 etanol 1x, 15 dakika için% 95 etanol 2x ve 20 dakika için mutlak etanol 3x.
- 1−2 mL hexamethyldisilazane (HMDS) daldırma 2x tarafından kimyasal olarak 10 dakika boyunca numuneleri kurutun.
NOT: HMDS bir duman başlık içinde dikkatle manipüle edilmelidir. Numunelerin bir desiccator içinde veya RT'deki duman kaputunun içinde bir gecede kurumasına izin verilmelidir. - Kurutulmuş numuneleri karbon iletken yapışkan bantla bir sapa monte edin.
- Kapak yüzeyini elektriksel iletken bir tabaka (20 nm kalınlıkta) altın-paladyum ile vakum içinde püskürtün.
- Düşük vakum modunda ve düşük voltajda (20 kV) taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile görüntüleri kaydedin.
Representative Results
Şekil 1 nanoliposome hazırlıkaçıklar 16,20,21. Fosfolipidler, 1,2-dioleoyl-sn-gliserol-3-fosfoetanolamin (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polietilen glikol)-2000] (amonyum tuzu; DSPE-MPEG 2000) ve kolesterylhemisuccinate (CHEMS), ana lipozom bileşenleri, ilk lipid film elde etmek için kloroform içinde çözüldü. Lipid film daha sonra hidrofilik protein içeren amonyum sülfat çözeltisi rehydrated oldu (tarin) bağlı olmak, ve kuluçka gecede yapıldı. Daha sonra küçük unilamellar veziküller oluşturmak için sonication ve ekstrüzyon teknikleri uygulandı. Ultracentrifugation adım serbest lipidler ve kapsülsüz protein lipozomal preparat ayrılmış, supernatant tuzak verimliliği nin belirlenmesi için kullanılırken.
Söz konusu metodoloji kullanılarak üretilen nanolipozomlar 51−396 nm ve ortalama 155 nm boyutuarasında birboyut dağılımı sergilemişti (Tablo 2). Polidispersity indeksi 0.168 olduğundan preparat homojendi. Lipozomlar 0,2 μm gözenek boyutunda bir membrandan dışarı çıkarılırsa %83'lükyüksek bir tuzak verimine ulaşılabilir (Tablo 2).
Morfolojik nanolipozom özellikleri SEM. Şekil 2A,B tarafından 121 nm aralığında yuvarlak şekilli lipozomal veziküller gösterip 20 kV olarak analiz edilirken, Şekil 2C,D Örnekleri. Nanoliposomes sadece hava önceki fiksasyon veya bu çalışmada açıklanan başka bir tedavi olmadan kurutulmuş edildi. Sonuç olarak 332 μm aralığında daha büyük ve hasarlı veziküller 5 kV olarak incelendi.
Şekil 1: Nanoliposome hazırlık şematik gösterimi. DOPE, PEG ve CHEMS, ana lipozom bileşenleri, ilk lipid film elde etmek için kloroform içinde çözüldü (1, 2, 3). Lipid film daha sonra hidrofilik protein içeren bir tuzlu tampon rehydrated oldu (tarin) bağlı olmak, vekuluçka gecede yapıldı (4 ). Daha sonra SUV oluşturmak için sonication ve ekstrüzyon teknikleri uygulandı (5, 6). Ultrasantrifüj adımı lipozomal preparatı serbest lipidlerden ve kapsülsüz proteinden ayırırken, supernatant tuzak veriminin belirlenmesinde kullanılmıştır (7). Bu rakam Correa ve ark.16'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: SEM tarafından nanoliposome fotomikroskopi. (A,B) 121 nm aralığında yuvarlak şekilli lipozomal veziküllerin görüntüleri ve 20 kV analiz. (C,D) Yetersiz hazırlanmış örneklerin görüntüleri. 5 kV'de vakum ve/veya voltaj koşullarına dayanamayan daha büyük ve/veya hasarlı veziküllerin gözlemi için yanlış işlenmiş numuneler. Bu rakam Correa ve ark.16'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Lipozom Bileşenleri | Ağırlık (g) | Konsantrasyon (mM) | Son ses |
| Uyuşturucu | 0.0420 | 5.7 | 10 mL |
| MPEG 2000-DSPE | 0.1059 | 3.8 | |
| Chems | 0.0024 | 0.5 |
DOPE - 1,2-dioleoyl-sn-gliserol-3-fosfoetanolamin); MPEG 2000-DSPE - 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N- [amino (polietilen glikol)-2000] (amonyum tuzu); CHEMS - kolesterylhemisuccinate.
Tablo 1: Tarin lipozomal nanokapsüllerin hazırlanması.
| Membran gözenek boyutu (3m) | Boyut dağılımı (nm) | Ortalama boyut (nm) | Polidispersity indeksi (PdI) | Tepe noktası (nm) | Tuzak Verimliliği |
| 0.2 | 51 - 396 | 155 | 0. 168 | 94 ± 39 | 0.83 |
Boyut ve polidispersitasyon indeksi dinamik ışık saçılımı ile değerlendirilirken, Peterson17'yegöre kapsülleme verimi belirlenmiştir.
Tablo 2: Nanoliposome preparatın büyüklüğü, polidispersitinin indeksi ve tuzak verimi.
Discussion
Burada açıklanan protokol Correa ve ark.16 tarafından tarin kapsüllemek için test edildi, Colocasia esculenta22 saf bir immünomodülatör ve antitümöral lektin . Metodoloji, terapötik uygulamalar için uygun boyutta istikrarlı nanoliposomes üretimi için izin, başarılı sonuçlar verdi. Formülasyon fizyolojik koşullar altında farklı pH düzeylerinde kontrollü salınım sunar. Ayrıca insan glioblastoma U-87 MG ve meme kanseri MDA-MB-231 hücre hatları ve fareler kemik iliği hücrelerinin stimülasyonu inhibisyonu gibi tarin farmakolojik özellikleri, potentiates. Lipozomal preparat sağlıklı fare hücrelerinde toksik etki göstermedi16.
Klasik yöntem, ilk Bangham ve ark.7tarafından açıklanan, büyük multilamellar lipozom veziküller üretimi için izin verir, boyut ve şekil heterojen. Bu yöntemin adaptasyonları, bu çalışmada bildirildiği gibi, 0,2 μm polikarbonat membran üzerinden sonication ve ekstrüzyon gibi ek adımlar dahil edilerek başarıyla uygulanır. Bu nanometre aralığında boyutu ile ilgili daha homojen bir dağılım üretimi sağlar16,23,24. Bu nedenle, başarılı sonuçlar elde etmek için, burada açıklanan kapsülleme protokolü ve lipozomal formülasyon kesinlikle takip edilmelidir.
Nanoliposome bileşimi dikkatle dope, MPEG 2000-DSPE ve CHEMS ile iki katmanlı membran oluşumunu sağlamak için seçilmiştir ana bileşenleri olarak. Bu doğal hayvan zarı çift katmanlı bileşenleri ve ikincisi nanoliposome mimarisine akışkanlık verebilir, insanlarda biyoaktif bileşik teslim için geniş uygulama sağlanması.
Nanolipozom pegiletion lipozom yapı istikrarı nı garanti etmek için gereklidir. PEG'in yokluğu boyut genişlemesine, yüksek polidispersitlik indeksi ve düşük tuzak verimliliğine yol açar. Ana lipozom bileşeni olarak DOPE ile optimal sonuçlar elde edilebilir. Ancak, bu yüksek maliyetli fosfolipid olduğunu. Nanoliposome üretiminin finansal maliyetleri DOPE gibi diğer benzer lipidler ile DOPE değiştirerek elde edilebilir (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin). CHEMS doğal olarak hayvan hücre zarlarında bulunan bir kolesterol molekülüdür, formülasyon dışında olmamalıdır, lipid iki katmanlı akışkanlık ve dövülebilirlik sağlamak için önemlidir beri16.
Kapsülleme protokolünün diğer yönleri de uyarlanabilir. Lipozomal bileşenleri eritmek için kullanılan kloroform kolayca boyut ortalaması, homojenlik ve tuzak verimliliği üzerinde hiçbir etkisi ile metanol ile değiştirilebilir. Ancak, bazı protein sızıntısı depolama 4 °C16altında oluşabilir. Tarin içeren amonyum sülfat çözeltisi ile bir gecede kuluçka adımı zorunlu değildir; ancak, rahatlık için nanoliposomal biyofiziksel özellikleri, kapsülleme veya stabilite verimliliği kayıpları, correa ve ark.16tarafından gösterildiği gibi hiçbir zarar ile yapılabilir. Ekstrüzyon adımı oda sıcaklığında gerçekleştirilir ve 0,1 m'lik gözenek boyutunda bir membran kullanılırsa şırıngalar arasındaki akış hızını azaltabilir.
Bu sorunun üstesinden gelmek için, 0,2 m gözenek boyutunda membran kullanımı veya ekstrüder tutucunun lipid geçiş sıcaklığının üzerinde ısıtılması göz önünde bulundurulmalıdır. Analist inaktive edilebilir lipidler veya protein zarar ve biyolojik aktivite kaybetmek için dikkatli olmalıdır. Alternatif olarak, lipozomal preparat, protein moleküler ağırlığına göre bir kesme membran ı kullanılarak ultrasantrifüj yerine HBS'ye karşı diyalize salınabilir. Nanoliposomes ultracentrifugation sonra askıya alınan tampon kimyasal doğa seçimi doğrudan sonraki uygulama ile ilgilidir. Bu çalışmanın perspektifleri in vivo ve in vitro tahlilleri içerdiğinden, HEPES tamponlu tuzlu lunda süspansiyon, fizyolojik koşullara yakın bir pH aralığı ve sitotoksik etki sağlamak için yeterli ydi.
Lipozomlar ince, canlı hücrelere benzer, daha kaliteli SEM görüntüleri elde etmek için tedavi edilmelidir. Vakum koşullarında 20 kV'dan yüksek değerleri destekleyen daha küçük bozulmamış veziküllerin görüntülenmesi için fiksasyon ve kurutma prosedürleri önemlidir. Şekil 2 A,B ekstrüzyon prosedürü ile uyumlu nanoboyutlu veziküller görüntüler. Bu işlem den sonra yeterli numune hazırlama yapılırsa 51-396 nm arasında değişen veziküllerin görüntülenmesi mümkündür. Adımlar fiksasyon dahil, etanol konsantrasyonları artırarak kurutma, ve kimyasal dehidratasyon agregalar ve vakum ve elektron ışını neden yırtılmış veziküllerin oluşumunu önlemek için. Öte yandan Şekil 2C,D' de oda sıcaklığında kurutulmuş ve burada açıklanan herhangi bir tedaviye tabi tutulmayan lipozom veziküller gösterilmektedir, bu da yetersiz hazırlandıkları anlamına gelir. Yetersiz prosedürün bir sonucu olarak, 0,2 μm gözenek boyutunda bir membran ile ekstrüzyon sonra bile dev veziküller oluşur. Vakum ve elektron ışını hasarı sonucu her iki panelde de yırtık veziküller görülür.
Nanoliposome veziküller resveratrol dahil hidrofobik moleküller için bir kapsülleme ve dağıtım sistemi olarak araştırılmıştır (3,5,-trihidroksistilbene), kolorektal kanser hücrelerine karşı biyoaktif bir bileşik. Kapsülleme prosedürü biyouyumluluk, biyobozunurluk, immünojenite olmayan ve lipozom nanokapsüller 25 doğasında olmayan toksisite özellikleri sağlamanın yanısıra lipophilic bileşiklerin kötü çözünürlük üstesinden gelebilir . Protokol uyarlamaları, sözlü yönetim için yeni lipozom formülasyonlarının geliştirilmesi gibi yönetim güzergahına ve amacına bağlı olarak dikkate alınmalıdır.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar COPPE / UFRJ, Elektronik Mikroskopi Laboratuvarı ve Çok Kullanıcılı Malzeme Karakterizasyon Laboratuvarı tesisleri müteşekkir; Dr Adalberto Vieyra, Dr Jennifer Lowe ve Rafael Lindoso, Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brezilya, ultracentrifuge kullanımı için profesörler; Dr Alexandre Guedes Torres ve Daniel Perrone, Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brezilya, döner evaporatör kullanımı için profesörler için; Kaynaklara yardımcı olan, yeni metodolojiler sağlayan ve Almanya'da 6 aylık Erasmus+ bursu sırasında ACNTF'yi denetleyen Berlin'deki Freie Universität'tan Profesör Roland Bodmeier ve Dr. Andriy Dashevskiy'e; Dr Rossana Thiré ve Aline Fernandes, Profesör ve Teknisyen Universidade Federal rio de Janeiro, UFRJ, Brezilya, Zetasizer Malvern kullanımı için; Bluma Guenther ve Taissa Rodrigues, Profesör ve Teknisyen Universidade Federal rio de Janeiro, UFRJ, Brezilya, SEM kullanımı için; Dr Rachel Ann Hauser Davis, Fundação Oswaldo Cruz araştırmacı, anlatım için. Bu çalışma kısmen Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, Brasil (CAPES) - Finans Kodu 001 (hibe No. 1627392; 1811605); Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (hibe No. E-26/202.815/2018; E-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 ve E-26/202.860/2016); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (hibe No. 406601/2018-6) ve Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) tarafından.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich Co | A4418 | |
| Analitycal Ballance Mettler H10Tw | Mettler Inc. | 417870 | |
| Beckman DU-640 Spectrophotometer | Beckman Coulter | 8043-30-1090 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Co | 5470 | |
| BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump | Thermo Fischer Scientific | 05-001-022PM | |
| CHEMS (cholesterylhemisuccinate) | Sigma-Aldrich Co | C6512 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich Co | 48520-U | CAUTION |
| Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) | Sigma-Aldrich Co | 209198 | |
| Coverslips (13mm diameter) | Thermo Scientific Nunc | EW-01839-00 | |
| DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) | Lipoid GMBH | 565600.1 | |
| Ethanol Absolute | Sigma-Aldrich Co | 32205 | |
| Folin -Ciocalteu phenol reagent | Sigma-Aldrich Co | F9252 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich Co | G5882 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3375 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich Co | 440191 | CAUTION |
| JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope | JEOL LTD | ||
| Mini Extruder 7 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Lipoid GMBH | 588200.1 | |
| Optima L-90k Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| Phosphate Buffer | Sigma-Aldrich Co | P3619 | |
| Poli-L-lysine | Sigma-Aldrich Co | P8920 | |
| Potassium L-tartrate monobasic | Sigma-Aldrich Co | 243531 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich Co | S7795 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co | S7653 | |
| Sodium Deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich Co | D6750 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich Co | L3771 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich Co | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich Co | RES20908-A7 | |
| TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope | Tescan | #657874 | |
| Trichloroacetic Acid (TCA) | Sigma-Aldrich Co | 91230 | |
| Zetasizer Nano ZSP | Malvern Panalytical LTD | ||
| Ultrasonic cleaning bath model 2510 | Branson |
References
- Wang, X., Wang, Y., Chen, Z. G., Shin, D. M. Advances of cancer therapy by nanotechnology. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 41 (1), 1 (2009).
- Keller, B. C. Liposomes in nutrition. Trends in Food Science & Technology. 12 (1), 25-31 (2001).
- Frézard, F., Schettini, D. A., Rocha, O. G., Demicheli, C. Lipossomas: propriedades físico-químicas e farmacológicas, aplicações na quimioterapia à base de antimônio. Quimica Nova. 28 (3), 511-518 (2005).
- Ferreira, D. dS., Lopes, S. C. dA., Franco, M. S., Oliveira, M. C. pH-sensitive liposomes for drug delivery in cancer treatment. Therapeutic Delivery. 4 (9), 1099-1123 (2013).
- Papachristos, A., Pippa, N., Ioannidis, K., Sivolapenko, G., Demetzos, C. Liposomal forms of anticancer agents beyond anthracyclines: present and future perspectives. Journal of Liposome Research. 25 (2), 166-173 (2015).
- Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102 (2013).
- Bangham, A., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), 238-252 (1965).
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4194-4198 (1978).
- Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 298 (4), 1015-1019 (1973).
- Zumbuehl, O., Weder, H. G. Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid/detergent mixed micelles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 640 (1), 252-262 (1981).
- Szebeni, J., et al. Oxidation and denaturation of hemoglobin encapsulated in liposomes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 798 (1), 60-67 (1984).
- Coelho, J. F., et al. Drug delivery systems: Advanced technologies potentially applicable in personalized treatments. EPMA Journal. 1 (1), 164-209 (2010).
- Pereira, P. R., et al. Purification and characterization of the lectin from taro (Colocasia esculenta) and its effect on mouse splenocyte proliferation in vitro and in vivo. The Protein Journal. 33 (1), 92-99 (2014).
- Pereira, P. R., et al. Structural analysis and binding properties of isoforms of tarin, the GNA-related lectin from Colocasia esculenta. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (1), 20-30 (2015).
- Pereira, P. R., et al. High-resolution crystal structures of Colocasia esculenta tarin lectin. Glycobiology. 27 (1), 50-56 (2016).
- Correa, A., Vericimo, M. A., Dashevskiy, A., Pereira, P. R., Paschoalin, V. M. F. Liposomal Taro Lectin Nanocapsules Control Human Glioblastoma and Mammary Adenocarcinoma Cell Proliferation. Molecules. 24 (3), 471 (2019).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Merida, L. A., et al. Tarin stimulates granulocyte growth in bone marrow cell cultures and minimizes immunosuppression by cyclo-phosphamide in mice. PLoS ONE. 13 (11), e0206240 (2018).
- Murtey, M. D., Ramasamy, P. Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy - Life Sciences. Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. Janecek, M., Kral, R. , InTechOpen. (2016).
- Andrade, C. A., Correia, M. T., Coelho, L. C., Nascimento, S. C., Santos-Magalhães, N. S. Antitumor activity of Cratylia mollis lectin encapsulated into liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 278 (2), 435-445 (2004).
- dos Santos Ferreira, D., et al. Development of a bone-targeted pH-sensitive liposomal formulation containing doxorubicin: physicochemical characterization, cytotoxicity, and biodistribution evaluation in a mouse model of bone metastasis. International Journal of Nanomedicine. 11, 3737 (2016).
- Pereira, P. R., Corrêa, A. C. N. T. F., Vericimo, M. A., Paschoalin, V. M. F. Tarin, a Potential Immunomodulator and COX-Inhibitor Lectin Found in Taro (Colocasia esculenta). Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 17 (4), 878-891 (2018).
- Olson, F., Hunt, C., Szoka, F., Vail, W., Papahadjopoulos, D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 557 (1), 9-23 (1979).
- Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. Extrusion technique to generate liposomes of defined size. Methods in Enzymology. 367, 3 (2003).
- Soo, E., et al. Enhancing delivery and cytotoxicity of resveratrol through a dual nanoencapsulation approach. Journal of Colloid and Interface Science. 462, 368-374 (2016).
