यह अध्ययन नैनोकण अभिलक्षण के बाद नैनोलिपोसोम तैयारी के लिए पतली लिपिड फिल्म विधि का उपयोग करके शास्त्रीय जलयोजन का वर्णन करता है। एक 47 kDa-hydrophilic और गोलाकार प्रोटीन, टारिन, सफलतापूर्वक स्थिरता में सुधार करने के लिए एक रणनीति के रूप में encapsulated है, तेजी से निकासी से बचने, और नियंत्रित रिलीज को बढ़ावा देने के. विधि hydrophobic अणुओं encapsulation के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
वसासम नैनोकैप्स्यूल्स को दवा, कॉस्मेटिक और खाद्य उद्योगों में कई उद्देश्यों के लिए लागू किया गया है। liposomes के गुण उनके biocompatibility, biodegradability, गैर-प्रतिरक्षा, गैर विषैले, और दोनों हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक यौगिकों को फंसाने की क्षमता शामिल हैं. एक कार्बनिक विलायक में पतली लिपिड फिल्मों के शास्त्रीय जलयोजन एक तकनीक के रूप में यहाँ लागू किया जाता है टारिन encapsulate करने के लिए, एक संयंत्र लैक्टिन, nanoliposomes में. नानोलिपोसम आकार, स्थिरता, जालन दक्षता, और आकृतिक लक्षणीकरण का विस्तार से वर्णन किया गया है। नानोलिपोसोम 1,2-डाइलियोइल-स्न-ग्लिसरॉल-3-फॉस्फोएथेनोलमाइन (डीओपीई), 1,2-डिस्टेरॉयल-एसएन-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोएथेनोलेमिन-एन-जोमिनो (पॉलीथीन ग्लीकोल)-2000 (एमोनियम साल्ट; DSPE-MPEG 2000), और मुख्य घटक के रूप में cholesterylhemisuccinate (CHEMS). लिपिड को पहले क्लोरोफॉर्म में भंग कर दिया जाता है ताकि एक पतली लिपिड फिल्म प्राप्त की जा सके जिसे बाद में अमोनियम सल्फेट समाधान में पुनः हाइड्रेटेड किया जाता है जिसमें प्रोटीन को फंसाया जाता है और रात भर इनक्यूबेट किया जाता है। फिर, sonication और बाहर निकालना तकनीक नैनोसाइज़्ड unilamellar vesicles उत्पन्न करने के लिए लागू कर रहे हैं। नैनोवेसिकल्स के आकार और बहुपरिक्षेप सूचकांक गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन द्वारा निर्धारित होते हैं, जबकि नैनोवेस्कल आकारिकी का मूल्यांकन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैन करके किया जाता है। Entrapment दक्षता शुरू में भरी हुई प्रोटीन की मूल राशि के लिए unencapsulated प्रोटीन की मात्रा के अनुपात से निर्धारित होता है. होमोजीनियस लिपोसोम 0.168 के 155 एनएम और बहुपरिक्षेपिता सूचकांक मूल्य के औसत आकार के साथ प्राप्त किए जाते हैं। 83% की एक उच्च जाल क्षमता हासिल की है.
हाल के वर्षों में कुशल दवा वितरण प्रणालियों की जांच करने वाले अध्ययनों की संख्या बढ़ी है। हालांकि, इस तरह के तेजी से निकासी के रूप में सीमाओं, गरीब biodistribution, और शारीरिक पीएच पर घुलनशीलता और अपर्याप्त सेलुलर तेज अभी भी पार करने की जरूरत है. नैनोसिस्टम्स का उपयोग कैंसर चिकित्सकीय में हाल ही में प्रगति के रूप में उभरा है, जबकि स्वस्थ कोशिकाओं में विषाक्तता को कम करते हुए कैंसर कोशिकाओं के अंदर दवाओं के intracellular एकाग्रता बढ़ाने के लिए लागू किया गया है। इसके अलावा, सामग्री की एक अलग रेंज से प्राप्त नैनोकणों (यानी, पॉलिमर, डेन्ड्रिमर, liposomes, वायरस, कार्बन नैनोट्यूब, और लौह ऑक्साइड और सोने के रूप में धातुओं) वर्तमान में कैंसर विरोधी प्रभाव को बढ़ाने और प्रणालीगत को कम करने के लिए लागू किया जा रहा है विषाक्तता1| विशेष रूप से Liposome नैनोकैप्स्यूल्स दवा, कॉस्मेटिक, और खाद्य उद्योगों में कई प्रयोजनों के लिए लागू किया गया है। हाल के वर्षों में, विटामिन, एंजाइम, और हर्बल निष्कर्षों जैसे विभिन्न न्यूरेस्यूट्यूटिकल उत्पादों liposome प्रौद्योगिकी2का उपयोग कर तैयार किया गया है।
लिपोसोम गोलाकार आशय होते हैं , जिसमें एक या अधिक संकेंद्री लिपिड द्विपरत होते हैं जो जलीय मीडिया3,4में फॉस्फोलिपिड के फैलाव से स्वत : निर्मित होते हैं . फॉस्फोलिपिड के ध्रुवीय शीर्ष झिल्ली की बाहरी और आंतरिक सतहों पर स्थित हैं, जलीय वातावरण के संपर्क में. इसके विपरीत, फैटी एसिड चेन झिल्ली के हाइड्रोफोबिक कोर का निर्माण करते हैं औरपानीसे 5 सुरक्षित होते हैं। liposomes के कुछ गुण है कि उन्हें आकर्षक दवा वितरण प्रणाली बनाने के अपने biocompatibility, biodegradability, गैर-प्रतिरक्षा, गैर विषैले, और दोनों हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक यौगिकों जाल करने की क्षमता शामिल6.
Liposomes इस तरह के आंदोलन, sonication, बाहर निकालना, lyophilization, ठंड, और thawing के रूप में विभिन्न प्रक्रियाओं चरणों का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है। शास्त्रीय तरीकों में रिवर्स वाष्पीकरण, विलायक इंजेक्शन, और डिटर्जेंट डायलिसिस शामिल हैं। सबसे अधिक अनुप्रयुक्त विधि पतली लिपिड फिल्म जलयोजन है, जिसे बंगम की विधि केरूप में भी जाना जाता है, जिसका उपयोग वेसिकुलर-लिपिड रूप 7,8,9,10,11प्राप्त करने के लिए किया जाता है। लैमेलेरिटी (फॉस्फोलिपिड बाइलेयर की संख्या) और कण आकार क्लासिकल पैरामीटर हैं जिनका उपयोग लिपोसोम की विशेषता के लिए किया जाता है 1) यूनिमेलर vesicles (ULVs), जो एक अद्वितीय फॉस्फोलिपिड द्वि परत द्वारा गठित किया जाता है और आकार में इस प्रकार अलग होता है: i) छोटे unilamellar vesicles (एसयूवी, $0.02-0.20 $m), ii) बड़े unilamellar vesicles (LUVs, $0.2-1.0 $m), और iii) विशाल unilamellar vesicles (GUVs, और gt;1 $m); या 2) बहुलैमेलर vesicles (MLVs, gt; 0.1 डिग्री मी)3,12. चिकित्सीय उपयोग के लिए विचार करते समय वेसिकल आकार एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है, जैसे कैंसर के उपचार में, जिसमें के आकार और 200 एनएम नैनोवेसिकल्स को एंडोथेलियल बाधा को पार करने और ट्यूमर ऊतकोंतकपहुंचने की अनुमति देने के लिए आदर्श होते हैं।
यहाँ, एक पतली लिपिड फिल्म तकनीक7 के शास्त्रीय जलयोजन के बाद encapsulation प्रक्रिया tarin का उपयोग कर वर्णित किया गया था, एक संयंत्र लैक्टिन एक हाइड्रोफिलिक गोलाकार प्रोटीन के रूप में विशेषता13,14,15 . Nanosized vesicles मुख्य तकनीक में sonication और बाहर निकालना कदम सहित द्वारा उत्पादित कर रहे हैं, उच्च जाल दक्षता16के साथ स्थिर liposomal नैनोवेसिकल्स में जिसके परिणामस्वरूप.
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का परीक्षण कोरिया एट अल 16 द्वारा किया गया था ताकि एक इम्यूनोमॉड्यूलेटरी और एटिट्यूमोरल लेक्टिन को कोलोकेसिया एस्कुलेंटा22से शुद्ध किया जा सके . पद्धति सफल परिणाम मिले, चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त आकार के स्थिर nanoliposomes के उत्पादन के लिए अनुमति देता है. निर्माण शारीरिक स्थितियों के तहत विभिन्न पीएच स्तरों पर नियंत्रित रिलीज प्रस्तुत करता है। यह भी इस तरह के मानव ग्लियोब्लास्टोमा U-87 एमजी और स्तन कैंसर एमडीए-एमबी-231 सेल लाइनों और चूहों अस्थि मज्जा कोशिकाओं की उत्तेजना के निषेध के रूप में टारिन औषधीय गुणों, potentiates। लिपोसोमल तैयारी स्वस्थ चूहों कोशिकाओं16में कोई विषाक्त प्रभाव का प्रदर्शन किया .
शास्त्रीय विधि, पहले Bangham एटअल द्वारा वर्णित 7, बड़े multilamellar liposome vesicles के उत्पादन के लिए अनुमति देता है, आकार और आकार में विषम. इस विधि के अनुकूलन, के रूप में वर्तमान अध्ययन में बताया, सफलतापूर्वक इस तरह के एक 0.2 डिग्री पॉली कार्बोनेट झिल्ली के माध्यम से sonication और बाहर निकालना के रूप में अतिरिक्त कदम शामिल करके लागू कर रहे हैं. इससे नैनोमीटर रेंज16,23,24में आकार के संबंध में अधिक सजातीय फैलाव का उत्पादन हो जाता है . इसलिए, सफल परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, encapsulation प्रोटोकॉल और liposomal तैयार यहाँ वर्णित सख्ती से पालन किया जाना चाहिए.
नानोलिपोसम संरचना सावधानी से DOPE के साथ एक bilayer झिल्ली के गठन को सुनिश्चित करने के लिए चुना गया था, MPEG 2000-DSPE, और मुख्य घटक के रूप में CHEMS. ये प्राकृतिक पशु झिल्ली द्वि परत घटक हैं और बाद nanoliposome वास्तुकला के लिए तरलता प्रदान कर सकते हैं, मनुष्य में bioactive यौगिक वितरण के लिए व्यापक आवेदन सुनिश्चित करने.
नानोलिपोसम पेगिलेशन लिपोसोम संरचना स्थिरता की गारंटी के लिए आवश्यक है। खूंटी की अनुपस्थिति आकार वृद्धि की ओर जाता है, एक उच्च polydispersity सूचकांक, और कम entrapment दक्षता. इष्टतम परिणाम मुख्य liposome घटक के रूप में DOPE के साथ प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि, यह एक उच्च लागत फॉस्फोलिपिड है। नानोलिपोसोम उत्पादन की वित्तीय लागत DOPC (1,2-dioleoyl-sn-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोकोलीन) जैसे अन्य समान लिपिड के साथ DOPE की जगह द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। CHEMS एक कोलेस्ट्रॉल अणु स्वाभाविक रूप से पशु कोशिका झिल्ली में पाया जाता है, जो तैयार करने सेबाहर नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि यह लिपिड bilayer तरलता और आघात 16 सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
encapsulation प्रोटोकॉल के अन्य पहलुओं को भी अनुकूलित किया जा सकता है. लिपोसोमल घटकों को भंग करने के लिए उपयोग किया जाने वाला क्लोरोफॉर्म आसानी से आकार औसत, एकरूपता, और जाल दक्षता पर कोई प्रभाव के साथ मेथनॉल द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। तथापि, 4 डिग्री सेल्सियस16के अंतर्गत भंडारण पर कुछ प्रोटीन रिसाव हो सकता है। टारिन युक्त अमोनियम सल्फेट समाधान के साथ रात भर ऊष्मायन कदम अनिवार्य नहीं है; हालांकि, सुविधा के लिए यह nanoliposomal जैव भौतिक विशेषताओं, encapsulation, या स्थिरता दक्षता नुकसान के लिए कोई नुकसान के साथ किया जा सकता है, के रूप में Correa एट अल द्वारा प्रदर्शन16. बाहर निकालना कदम कमरे के तापमान पर किया जाता है, जो सिरिंजों के बीच प्रवाह दर कम कर सकते हैं अगर एक 0.1 मीटर pores आकार झिल्ली का उपयोग किया जाता है.
इस मुद्दे को दूर करने के लिए, एक 0.2 मीटर के छिद्र आकार झिल्ली या लिपिड संक्रमण तापमान के ऊपर extruder धारक के हीटिंग का उपयोग पर विचार किया जाना चाहिए. विश्लेषक लिपिड या प्रोटीन है कि निष्क्रिय किया जा सकता है और जैविक गतिविधि खो नुकसान नहीं सावधान रहना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, liposomal तैयारी अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन के बजाय HBS के खिलाफ dilyzed किया जा सकता है, प्रोटीन आणविक वजन के अनुसार एक कट-ऑफ झिल्ली का उपयोग कर. बफर की रासायनिक प्रकृति का चुनाव जिसमें अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन के बाद नैनोलिपोसोम निलंबित कर दिए जाते हैं, इसका सीधा संबंध इसके बाद के अनुप्रयोग से होता है। चूंकि इस अध्ययन के दृष्टिकोण में विवो और इन विट्रो परख में शामिल हैं, HEPES बफर ्ड लवण में निलंबन कोई साइटोटॉक्सिक प्रभाव और शारीरिक स्थितियों के करीब एक पीएच रेंज सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त था।
Liposomes पतले इलाज किया जाना चाहिए, जीवित कोशिकाओं के समान, उच्च गुणवत्ता SEM छवियों को प्राप्त करने के लिए. फिक्सेशन और सुखाने की प्रक्रिया शून्य परिस्थितियों के तहत 20 केवी से अधिक मूल्यों का समर्थन है कि छोटे बरकरार vesicles के दृश्य सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। चित्र 2 ए, बी बाहर निकालना प्रक्रिया के साथ संगत नैनोसाइज़्ड vesicles प्रदर्शित करता है। 51-396 एनएम से लेकर vesicles का दृश्य संभव है अगर इस प्रक्रिया के बाद पर्याप्त नमूना तैयारी की जाती है। कदम निर्धारण शामिल हैं, इथेनॉल सांद्रता बढ़ाने के द्वारा सुखाने, और रासायनिक निर्जलीकरण समुच्चय और टूट vesicles वैक्यूम और इलेक्ट्रॉन बीम की वजह से के गठन से बचने के लिए. दूसरी ओर, चित्र 2सी,डी कमरे के तापमान के नीचे सूख liposome vesicles से पता चलता है और किसी भी उपचार के अधीन नहीं यहाँ वर्णित है, जिसका अर्थ है कि वे अपर्याप्त तैयार किए गए थे. अपर्याप्त प्रक्रिया का एक परिणाम के रूप में, विशाल vesicles का गठन कर रहे हैं, यहां तक कि एक 0.2 डिग्री मीटर pores आकार झिल्ली के माध्यम से बाहर निकालना के बाद. वैक्यूम और इलेक्ट्रॉन बीम क्षति के परिणामस्वरूप दोनों पैनलों में रूपित vesicles भी पाए जाते हैं।
नानोलिपोसम vesicles एक encapsulation और hydrophobic अणुओं के लिए वितरण प्रणाली के रूप में पता लगाया गया है, resveratrol सहित (3,5,4′-trihydroxystilbene), कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ एक bioactive यौगिक. encapsulation प्रक्रिया lipophilic यौगिकों की गरीब घुलनशीलता को दूर कर सकते हैं biocompatibility प्रदान करने के अलावा, biodegradability, गैर-प्रतिरक्षा, और गैर विषैले विशेषताओं liposome नैनोकैप्स्यूल्स25के लिए निहित . प्रोटोकॉल अनुकूलन ों को प्रशासन मार्ग और उद्देश्य के आधार पर ध्यान में रखा जाना चाहिए, जैसे मौखिक प्रशासन के लिए नए लिपोसोम योगों का विकास।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों COPPE/UFRJ, इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी प्रयोगशाला, और Multiuser सामग्री विशेषता प्रयोगशाला सुविधाओं के आभारी हैं; डॉ Adalberto Vieyra, डॉ जेनिफर लोव, और राफेल Lindoso, Universidade संघीय में प्रोफेसरों रियो डी जनेरियो, UFRJ, ब्राजील, ultracentrifuge के उपयोग के लिए; डॉ Alexandre Guedes Torres और डैनियल Perrone, Universidade संघीय रियो डी जनेरियो, UFRJ, ब्राजील में प्रोफेसरों, रोटरी वाष्पित्र के उपयोग के लिए; प्रोफेसर रोलाण्ड Bodmeier और बर्लिन में Freie Universitt से डॉ Andriy Dashevskiy, जो संसाधनों के साथ मदद की, नए तरीके प्रदान की है, और जर्मनी में एक 6 महीने इरास्मस + फैलोशिप के दौरान ACNTF निरीक्षण; जेटाइजर मालवेर्न के उपयोग के लिए Universidade संघीय क्या रियो डी जनेरियो, UFRJ, ब्राजील में प्रोफेसर और तकनीशियन डॉ Rossana Thir$ और Aline फर्नांडीस के लिए; Sem के उपयोग के लिए Bluma Guenther और Taissa Rodrigues, Universidade संघीय रियो डी जनेरियो, UFRJ, ब्राजील में प्रोफेसर और तकनीशियन के लिए; डॉ राहेल एन Hauser डेविस, Fundao Oswaldo Cruz में शोधकर्ता, कथन के लिए. इस अध्ययन के भाग में Coordenazo de Aperfei-oamento de Pessoal de N$vel सुपीरियर, ब्राजील (CAPES) द्वारा वित्त पोषण किया गया था – वित्त कोड 001 (अनुदान संख्या 1627392; 1811605); द्वारा फंडाओ कार्लोस Chagas Filho de Amparo ] PesQuisa करते हैं Estado रियो डी जनेरियो (FAPERJ) (ग्रेंट नं. ई-26/202.815/2018; ई-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 और ई-26/ Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient]fico e Tecnol]gico (CNPQ) (अनुदान संख्या 406601/2018-6), और Financiadora de Estudos e Prozetos (FINEP) द्वारा.
Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich Co | A4418 | |
Analitycal Ballance Mettler H10Tw | Mettler Inc. | 417870 | |
Beckman DU-640 Spectrophotometer | Beckman Coulter | 8043-30-1090 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Co | 5470 | |
BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump | Thermo Fischer Scientific | 05-001-022PM | |
CHEMS (cholesterylhemisuccinate) | Sigma-Aldrich Co | C6512 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich Co | 48520-U | CAUTION |
Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) | Sigma-Aldrich Co | 209198 | |
Coverslips (13mm diameter) | Thermo Scientific Nunc | EW-01839-00 | |
DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) | Lipoid GMBH | 565600.1 | |
Ethanol Absolute | Sigma-Aldrich Co | 32205 | |
Folin -Ciocalteu phenol reagent | Sigma-Aldrich Co | F9252 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich Co | G5882 | |
HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3375 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich Co | 440191 | CAUTION |
JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope | JEOL LTD | ||
Mini Extruder 7 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Lipoid GMBH | 588200.1 | |
Optima L-90k Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
Phosphate Buffer | Sigma-Aldrich Co | P3619 | |
Poli-L-lysine | Sigma-Aldrich Co | P8920 | |
Potassium L-tartrate monobasic | Sigma-Aldrich Co | 243531 | |
Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich Co | S7795 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co | S7653 | |
Sodium Deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich Co | D6750 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich Co | L3771 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich Co | S8045 | |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich Co | RES20908-A7 | |
TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope | Tescan | #657874 | |
Trichloroacetic Acid (TCA) | Sigma-Aldrich Co | 91230 | |
Zetasizer Nano ZSP | Malvern Panalytical LTD | ||
Ultrasonic cleaning bath model 2510 | Branson |