본 연구는 나노리포솜 제제에 대한 얇은 지질 막 방법을 이용한 고전적인 수분 공급에 대해 설명하고 나노입자 특성화에 이어. 47 kDa-친수성 및 구형 단백질인 타린(tarin)은 안정성을 개선하고, 빠른 클리어런스를 피하며, 통제된 방출을 촉진하는 전략으로 성공적으로 캡슐화되었습니다. 이 방법은 소수성 분자 캡슐화에 적응될 수 있다.
리포솜 나노캡슐은 제약, 화장품 및 식품 산업에서 많은 목적으로 적용되어 왔다. 리포좀의 특성은 생체 적합성, 생분해성, 비 면역 원성, 비 독성 및 친수성 및 소수성 화합물을 모두 포획하는 능력을 포함합니다. 유기 용매에서 박막 립 필름의 고전적인 수화는 나노 리포솜에서 식물 렉틴 인 타린을 캡슐화하는 기술로 본원에 적용된다. 나노리포좀 크기, 안정성, 함정 효율 및 형태학적 특성화가 자세히 설명되어 있습니다. 나노리포솜은 1,2-디올레오일-sn-글리세롤-3-포스포에탄올라민(DOPE), 1,2-디스테로일-스n-글리세로-3-포스포에탄올라민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000](암모늄 염)을 사용하여 제조된다; DSPE-MPEG 2000, 및 콜레스테실헤미시네이트(CHEMS)를 주요 성분으로 한다. 지질은 먼저 클로로포름에 용해되어 밤새 포획되고 배양되는 단백질을 함유하는 황산암모늄 용액에서 이어서 재수화되는 얇은 지질 막을 얻었다. 그런 다음, 초음파 처리 및 압출 기술이 나노 크기의 unilamellar 소포를 생성하기 위해 적용됩니다. 나노베시클의 크기 및 다분산성 지수는 동적 광 산란에 의해 결정되며, 나노베시클 형태는 주사 전자 현미경으로 평가됩니다. 포획 효율은 처음에 로드된 단백질의 원래 양에 대한 캡슐화되지 않은 단백질의 양비율에 의해 결정된다. 동질 리포솜은 평균 크기 155 nm 및 다분산 지수 값 0.168로 수득된다. 83%의 높은 함정 효율을 달성합니다.
효율적인 약물 전달 시스템을 조사하는 연구의 수는 최근 몇 년 동안 증가했다. 그러나, 급속한 정리와 같은 제한, 가난한 biodistribution, 생리적인 pH에 용해도 및 부족한 세포 통풍관은 아직도 능가될 필요가 있습니다. 나노시스템의 사용은 최근 암 치료제의 진보로 대두되고 있으며, 건강한 세포의 독성을 최소화하면서 암세포 내 약물의 세포내 농도를 증가시키기 위해 적용되고 있다. 또한, 다양한 범위의 물질(즉, 폴리머, 덴드리머, 리포좀, 바이러스, 탄소 나노튜브 및 산화철 및 금과 같은 금속)에서 얻은 나노입자는 현재 항암 효과를 향상시키고 전신을 감소시키기 위해 적용되고 있습니다. 독성1. 특히 리포솜 나노캡슐은 제약, 화장품 및 식품 산업에서 많은 목적으로 적용되고 있다. 최근에는 리포솜 기술 2를 사용하여 비타민, 효소 및 허브 추출물과 같은 다양한 건강기능 식품이 제조되었습니다.
리포좀은 수성 매체3,4에서인지질의 분산에 의해 자발적으로 형성된 하나 이상의 동심 지질 이중층으로 구성된 구형 소포이다. 인지질의 극지 헤드는 수성 환경과 접촉하여 멤브레인의 외부 및 내부 표면에 있습니다. 대조적으로, 지방산 사슬은 막의 소수성 코어를 형성하고물 5에서 보호됩니다. 그들에게 매력적인 약물 전달 시스템을 만드는 리포좀의 일부 속성은 그들의 생체 적합성, 생분해성, 비 면역 원성, 비 독성, 및 친수성및 소수성 화합물을 모두 포획하는 능력을 포함한다 6.
리포좀은 교반, 초음파 처리, 압출, 동결, 동결 및 해동과 같은 다양한 공정 단계를 사용하여 제조할 수 있습니다. 고전적인 방법은 역상 증발, 용매 주입 및 세제 투석을 포함한다. 가장 많이 적용되는 방법은 방함의 방법으로 알려진 얇은 지질 막 수화이며, 이는 7, 8,9,10,11을얻기 위해 사용된다. Lamellarity (인지질 이중층의 수) 및 입자 크기는 리포좀을 1로 특성화하는 데 사용되는 고전적인 매개 변수입니다(ULV), 독특한 인지질 이중층에 의해 형성되고 크기가 다음과 같이 다양합니다: i) 작은 unilamellar 소포 (SUV, ~0.02-0.20 μm), ii) 큰 unilamellar 소포 (LUV, ~0.2-1.0 μm), 및 iii) 거대한 unilamellar 소포 (ROV, >1 μm); 또는 2) 다층 소포 (MlV, >0.1 μm)3,12. 소포 크기는 암 치료에서와 같은 치료적 사용을 고려할 때 중요한 파라미터이며, 이는 <200 nm의 크기가 나노베시클이 내피 장벽을 교차시키고 종양 조직에 도달할 수 있도록 하는 데 이상적이다4.
본 명세서에서, 얇은 지질막 기술 7의 고전적인 수화를 따르는 캡슐화 절차는 타린을 사용하여 기재하였으며, 식물 렉틴은 친수성 구형 단백질13,14,15를 특징으로 한다. . 나노 크기의 소포는 주요 기술에 초음파 처리 및 압출 단계를 포함하여 생산되며, 높은 함정 효율(16)을가진 안정적인 리포좀 나노 베시클을 초래한다.
본원에 기재된 프로토콜은 콜로시아 에스컬렌타22로부터정제된 면역조절 및 항종양 렉틴인 타린을 캡슐화하기 위해 코레아 외16에 의해 시험되었다. 이 방법론은 성공적인 결과를 낳았으며, 치료 응용 분야에 적합한 크기의 안정적인 나노 리포좀을 생산할 수 있게 되었습니다. 제형은 생리적 조건 하에서 상이한 pH 수준에서 조절방출을 제시한다. 또한 인간 교모세포종 U-87 MG 및 유방암 MDA-MB-231 세포주 및 마우스 골수 세포의 자극의 억제와 같은 타린 약리학적 특성을 강력하게 한다. 리포좀 제제는 건강한 마우스세포(16)에서독성 효과를 나타내지 않았다.
Bangham 등 7에 의해 처음기술된 고전적인 방법은 큰 다층 질 리포솜 소포의 생산을 허용하며, 크기와 모양면에서 이질적입니다. 본 연구에서 보고된 바와 같이 이 방법의 적응은 0.2 μm 폴리카보네이트 멤브레인을 통한 초음파 처리 및 압출과 같은 추가 단계를 포함함으로써 성공적으로 적용된다. 이것은 나노 미터 범위16,23,24의크기에 관한 보다 균일 한 분산의 생산을 허용한다. 따라서 성공적인 결과를 보장하기 위해 여기에 설명된 캡슐화 프로토콜 및 리포좀 제형은 엄격하게 따라야 합니다.
나노리포좀 조성물은 DOPE, MPEG 2000-DSPE 및 CHEMS를 주요 성분으로 하는 이중층 막의 형성을 보장하기 위해 신중하게 선택되었다. 이들은 자연 동물 막 이중 층 구성 요소 이며 후자는 나노 리 포 좀 아키텍처에 유동성을 부여할 수 있습니다., 인간에서 생리 활성 화합물 전달에 대 한 광범위 한 응용 프로그램을 보장.
나노 리포솜 페질화는 리포좀 구조 안정성을 보장하는 데 필수적입니다. PEG의 부재는 크기 확대, 높은 다분산성 지수 및 낮은 함정 효율로 이어집니다. 최적의 결과는 주요 리포솜 성분으로서 DOPE로 얻을 수 있다. 그러나, 이것은 고비용 인지질이다. 나노 리 포 솜 생산의 금융 비용 DOPC (1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-phocholine)와 같은 다른 유사한 지질으로 DOPE를 대체 하 여 달성 될 수 있다. CHEMS는 동물 세포막에서 자연적으로 발견되는 콜레스테롤 분자이며, 이는 지질 이중층 유동성 및 가변성을 보장하는 것이 중요하기 때문에 제형에서 배제되어서는 안된다.16.
캡슐화 프로토콜의 다른 양상들도 적응될 수 있다. 리포좀 성분을 용해하는 데 사용되는 클로로폼은 크기 평균, 균질성 및 함정 효율에 영향을 받지 않고 메탄올로 쉽게 대체 될 수 있습니다. 그러나 일부 단백질 누출은 4 °C16미만의 저장에서 발생할 수 있습니다. 타린을 함유한 황산암모늄용액을 함유한 하룻밤 배양 단계는 필수가 아니다; 그러나, 편의를 위해 코레아외 16에의해 입증된 바와 같이, 나노리포좀 생체물리학적 특성, 캡슐화, 또는 안정성 효율 손실에 대한 손상 없이 수행될 수 있다. 압출 단계는 실온에서 수행되며, 이는 0.1 μm 기공 크기 멤브레인이 사용되는 경우 주사기 사이의 유량을 감소시킬 수 있다.
이 문제를 극복하기 위해 0.2 μm 기공 크기의 멤브레인 을 사용하거나 지질 전이 온도 위의 압출기 홀더를 가열하는 것을 고려해야합니다. 분석가는 불활성화될 수 있는 지질 또는 단백질을 손상시키고 생물학적 활성을 잃지 않도록 주의해야 합니다. 대안적으로, 리포좀 제제는 단백질 분자량에 따라 컷오프 막을 사용하여 초원심분리 대신 HBS에 대해 투석될 수 있다. 초원심분리 후 나노리포좀이 부유되는 완충제의 화학적 특성의 선택은 후속 적용과 직접적으로 관련이 있습니다. 본 연구의 관점은 생체 내 및 시험관 내 검사를 포함하기 때문에, HEPES 완충식염수의 현탁액은 생리학적 조건에 가까운 세포독성 효과 및 pH 범위를 보장하기에 적절했다.
리포솜은 살아있는 세포와 유사하게 미세하게 처리되어야 하며, 더 높은 품질의 SEM 이미지를 얻을 수 있습니다. 고정 및 건조 절차는 진공 조건에서 20 kV 보다 높은 값을 지원하는 더 작은 손상되지 않은 소포의 시각화를 보장하는 데 중요합니다. 그림 2 A, B는 압출 절차와 호환 나노 크기의 소포를 표시합니다. 이 절차에 따라 적절한 샘플 준비를 수행하면 51-396 nm에 이르는 소포의 시각화가 가능합니다. 단계는 진공 및 전자 빔에 기인한 응집체 및 파열한 소포의 대형을 피하기 위하여 에탄올 농도를 증가시켜 고착, 건조, 및 화학적 탈수를 포함합니다. 한편, 도 2C,D는 실온 하에서 건조된 리포솜 소포를 나타내고 여기에 기재된 어떠한 처리도 실시하지 않았으며, 이는 그들이 부적절하게 제조되었다는 것을 의미한다. 부적당한 절차의 결과로, 거대한 소포는 0.2 μm 기공 크기 막을 통해 압출 후에도 형성됩니다. 파열 된 소포는 진공 및 전자 빔 손상의 결과로 두 패널에서 관찰됩니다.
나노리포솜 소포는 대장암 세포에 대한 생리활성 화합물인 레스베라트롤(3,5,4′-트리하이드록시스틸벤)을 포함한 소수성 분자에 대한 캡슐화 및 전달 시스템으로 탐구되었습니다. 캡슐화 절차는 리포좀 나노캡슐(25)에 내재된 생체적합성, 생분해성, 비면역원성 및 비독성 특성을 제공할 뿐만 아니라 친유성화합물의 열악한 용해도를 극복할 수 있다. 프로토콜 적응은 경구 투여를 위한 새로운 리포좀 제형의 개발과 같은 투여 경로 및 목적에 따라 고려되어야 한다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 COPPE / UFRJ, 전자 현미경 검사법 실험실 및 다중 사용자 재료 특성화 실험실 시설에 감사드립니다. 아달베르토 비에이라 박사, 제니퍼 로우 박사, 라파엘 린도소 교수, 유니버시다드 연방 교수 리우데자네이루, UFRJ, 브라질, 초원심분리기의 사용; 알렉산드르 게데스 토레스 박사와 다니엘 페로네 박사에게, 유니버시다드 연방 교수인 리우데자네이루, UFRJ, 브라질, 회전증발기 의 사용; 베를린의 프레이 대학교의 롤랜드 보드마이어 교수와 안드리 다셰프스키 박사에게 자원 을 지원한 후 새로운 방법론을 제공하고 독일에서 6 개월 동안 Erasmus + 펠로우십을 감독했습니다. 로사나 티레 박사와 알레인 페르난데스 박사, 유니버시다드 연방 의원 리오 데 자네이로, UFRJ, 브라질에서 교수 및 기술자, 제타제르 말번의 사용에 대한; 블루마 겐더와 타이사 로드리게스, 교수 및 Universidade 연방 두 리오 데 자네이로에서 기술자, UFRJ, 브라질, SEM의 사용에 대한; 레이첼 앤 하우저 데이비스 박사, Fundação 오스왈도 크루즈의 연구원, 내레이션. 이 연구는 코르데나카오 드 아페르페이소아멘토 드 페소알 드 니벨 슈페리어, 브라질 (CAPES) – 금융 코드 001 (교부금 번호 1627392; 1811605);에 의해 부분적으로 자금을 조달했다; by Fundação 카를로스 Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (그랜트 번호. E-26/202.815/2018; E-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 및 E-26/202.860/2016); 콘셀호 나시오날 드 데센볼비멘토 에 테놀로지코(CNPq) (그랜트 No. 406601/2018-6), 피난시아도라 데 에스투도스 e 프로제토스(FINEP).
Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich Co | A4418 | |
Analitycal Ballance Mettler H10Tw | Mettler Inc. | 417870 | |
Beckman DU-640 Spectrophotometer | Beckman Coulter | 8043-30-1090 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Co | 5470 | |
BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump | Thermo Fischer Scientific | 05-001-022PM | |
CHEMS (cholesterylhemisuccinate) | Sigma-Aldrich Co | C6512 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich Co | 48520-U | CAUTION |
Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) | Sigma-Aldrich Co | 209198 | |
Coverslips (13mm diameter) | Thermo Scientific Nunc | EW-01839-00 | |
DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) | Lipoid GMBH | 565600.1 | |
Ethanol Absolute | Sigma-Aldrich Co | 32205 | |
Folin -Ciocalteu phenol reagent | Sigma-Aldrich Co | F9252 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich Co | G5882 | |
HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3375 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich Co | 440191 | CAUTION |
JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope | JEOL LTD | ||
Mini Extruder 7 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Lipoid GMBH | 588200.1 | |
Optima L-90k Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
Phosphate Buffer | Sigma-Aldrich Co | P3619 | |
Poli-L-lysine | Sigma-Aldrich Co | P8920 | |
Potassium L-tartrate monobasic | Sigma-Aldrich Co | 243531 | |
Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich Co | S7795 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co | S7653 | |
Sodium Deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich Co | D6750 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich Co | L3771 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich Co | S8045 | |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich Co | RES20908-A7 | |
TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope | Tescan | #657874 | |
Trichloroacetic Acid (TCA) | Sigma-Aldrich Co | 91230 | |
Zetasizer Nano ZSP | Malvern Panalytical LTD | ||
Ultrasonic cleaning bath model 2510 | Branson |