Это исследование описывает классическую гидратацию с использованием тонкого метода липидной пленки для нанолипосомного препарата с последующей характеристикой наночастиц. 47 kDa-гидрофильных и шаровых белков, тарин, успешно инкапсулируется как стратегия для улучшения стабильности, избежать быстрого оформления, и способствовать контролируемому освобождению. Метод может быть адаптирован к инкапсуляции гидрофобных молекул.
Липосомы нанокапсулы были применены для многих целей в фармацевтической, косметической и пищевой промышленности. Атрибуты липосом включают их биосовместимость, биоразлагаемость, неиммуногенность, нетоксичность и способность заманивать как гидрофильные, так и гидрофобные соединения. Классическая гидратация тонких липидных пленок в органическом растворителе применяется в данном документе в качестве метода инкапсулирования тарина, растительного лектомного, в нанолипосомы. Нанолипосомного размера, стабильности, эффективности захвата и морфологической характеристики описаны в деталях. Нанолипосомы готовятся с использованием 1,2-диолеой-сн-глицерол-3-фосфоэтаноламин (DOPE), 1,2-дистеэроил-сн-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-амино (полиэтилен гликоль)-2000″ (амммонная соляная) (амммонная соляная) (аммоновый соляной; DSPE-MPEG 2000) и холестерилхемисуцинат (CHEMS) в качестве основных составляющих. Липиды сначала растворяются в хлороформе, чтобы получить тонкую липидную пленку, которая впоследствии регидратируется в растворе сульфата аммония, содержащем белок, который будет захвачен и инкубирован на ночь. Затем, sonication и экструзии методы применяются для создания наноразмерных unilamellar пузырьков. Индекс размера и полиписперсии нановезиклов определяется динамическим рассеянием света, в то время как морфология нановсикулов оценивается с помощью сканирующей электронной микроскопии. Эффективность захвата определяется соотношением количества неинкапсулированного белка к первоначальному количеству первоначально загруженного белка. Однородные липосомы получаются со средним размером 155 нм и значением индекса полидисперсности 0,168. Достигается высокая эффективность захвата в 83%.
В последние годы возросло число исследований, посвященных эффективным системам доставки лекарств. Однако такие ограничения, как быстрое расчистка, плохое биораспределение и растворимость при физиологическом рН и недостаточное клеточное поглощение, все еще должны быть преодолены. Использование наносистем стало недавний прогресс в терапии рака, применяется для увеличения внутриклеточной концентрации наркотиков внутри раковых клеток при минимизации токсичности в здоровых клетках. Кроме того, наночастицы, полученные из различных материалов (например, полимеров, дендримеров, липосом, вирусов, углеродных нанотрубок и металлов, таких как оксид железа и золото), в настоящее время применяются для усиления противораковых эффектов и снижения системных токсичность1. Липосомы нанокапсулы, в частности, были применены для многих целей в фармацевтической, косметической и пищевой промышленности. В последние годы различные нутрицевтические продукты, такие как витамины, ферменты и растительные экстракты были разработаны с использованием липосомного технологии2.
Липосомы являются сферические пузырьки, состоящие из одного или нескольких концентрических липидных двухслойных спонтанно формируется дисперсии фосфолипидов в водном носителе3,4. Полярные головки фосфолипидов расположены на наружной и внутренней поверхностях мембран, в контакте с водной средой. В отличие от этого, цепи жирных кислот образуют гидрофобное ядро мембран и защищены от воды5. Некоторые атрибуты липосомы, которые делают их привлекательными системдоставки наркотиков включают их биосовместимость, биоразлагаемость, неиммуногенность, нетоксичность, и способность заманить как гидрофильные и гидрофобные соединения6.
Липосомы могут быть подготовлены с помощью различных процессов, таких как возбуждение, звукование, экструзия, лиофилизация, замораживание и оттаивание. Классические методы включают обратное испарение фазы, инъекцию растворителя и диализ моющего средства. Наиболее прикладным методом является тонкая гидратация липидной пленки, также известный как метод Бангама, который используется для получения везикулярно-липидных форм7,8,9,10,11. Ламелларитность (количество фосфолипидных двуслой) и размер частиц являются классическими параметрами, используемыми для характеристики липосом как 1) униламеллярных пузырьков (ULVs), образованных уникальным флосфолипидным двуслойным и меняющимся по размеру следующим образом: i) небольшой униламеллар vesicles (SUVs, 0.02-0.20 мкм), ii) большие unilamellar пузырьки (LUVs, 0,2-1,0 мкм), и iii) гигантские unilamellar пузырьки (GUVs, или 2) мультиламеллярные пузырьки (MLVs, 0,1 мкм)3,12. Размер Vesicle является важным параметром при рассмотрении для терапевтического использования, например, в лечении рака, в котором размеры lt;200 нм идеально подходят, чтобы позволить нановезики пересечь эндотелиальный барьер и достичь опухолевых тканей4.
При этом, инкапсуляция процедура после классической гидратации тонкой липидной пленки техника7 была описана с использованием тарина, лектин растений характеризуется как гидрофильный шаровой белок13,14,15 . Наноразмерные пузырьки производятся путем включения звуковой и экструзионной ступеней в основной технике, в результате чего стабильные липосомальные нановезики с высокой эффективностью захвата16.
Протокол, описанный здесь, был протестирован Correa et al.16 для инкапсулировать тарин, иммуномодулирующий и противоопухолевый лектин, очищенный от Колокасии esculenta22. Методология дала успешные результаты, что позволило выработать стабильные нанолипосомы соответствующего размера для терапевтического применения. Формула представляет контролируемое высвобождение на различных уровнях рН в физиологических условиях. Он также потенцирует тарин фармакологические свойства, такие как ингибирование глиобластомы человека U-87 MG и рака молочной железы MDA-MB-231 клеточные линии и стимуляции клеток костного мозга мышей. Липосомальный препарат не проявлял токсического воздействия в здоровых клетках мышей16.
Классический метод, впервые описанныйBangham et al. 7, позволяет выравливать крупные многоламеллярные липосомы пузырьков, неоднородные по размеру и форме. Адаптация этого метода, как сообщается в настоящем исследовании, успешно применяется путем включения дополнительных шагов, таких как соникация и экструзия через 0,2 мкм поликарбонатной мембраны. Это позволяет вывести более однородную дисперсию относительно размера в диапазоне нанометров16,23,24. Поэтому для обеспечения успешных результатов следует строго соблюдать описанный здесь протокол инкапсуляции и липосомную формулировку.
Нанолипосомы композиция была тщательно отобрана для того, чтобы обеспечить образование двухслойной мембраны с DOPE, MPEG 2000-DSPE и CHEMS в качестве основных компонентов. Это естественные компоненты мембраны животных, и последние могут придать текучесть нанолипосомой архитектуры, обеспечивая широкое применение для биологической доставки соединений у человека.
Нанолипосомы pegylation имеет важное значение для обеспечения стабильности липосомы структуры. Отсутствие ПЭГ приводит к увеличению размера, высокому индексу полидисперсности и низкой эффективности захвата. Оптимальные результаты могут быть получены с DOPE в качестве основного компонента липосомы. Однако это дорогостоящий фосфолипид. Финансовые затраты на производство нанолипосом могут быть достигнуты путем замены DOPE другими аналогичными липидами, такими как DOPC (1,2-диолеил-сн-глицеро-3-фосфохолин). CHEMS является молекула холестерина, естественно, в клетках животных мембран, которые не должны быть исключены из формулировки, так как важно обеспечить липидной двухслойной текучести и податливости16.
Другие аспекты протокола инкапсуляции также могут быть адаптированы. Хлороформ, используемый для растворения липосомных компонентов, может быть легко заменен метанолом без каких-либо последствий для среднего размера, однородности и эффективности захвата. Тем не менее, некоторые утечки белка может произойти при хранении под 4 КК16. Ночной инкубационный шаг с раствором сульфата аммония, содержащим тарин, не является обязательным; однако, для удобства это может быть выполнено без ущерба для нанолипосомальных биофизических характеристик, инкапсуляции или потери эффективности стабильности, как показано на Correa et al.16. Шаг экструзии выполняется при комнатной температуре, которая может уменьшить скорость потока между шприцев, если 0,1 мкм размер мембраны размера.
Для преодоления этой проблемы следует рассмотреть вопрос об использовании мембраны размером 0,2 мкм или нагревательного держателя экструдера над температурой перехода липидов. Аналитик должен быть осторожным, чтобы не повредить липиды или белок, которые могут быть инактивированы и потерять биологическую активность. Кроме того, липосомный препарат можно диализать против HBS вместо ультрацентрифугации, используя отсеченную мембрану в соответствии с молекулярным весом белка. Выбор химического характера буфера, в котором нанолипосомы приостанавливаются после ультрацентрифугации, напрямую связан с его последующим применением. Поскольку перспективы этого исследования включают in vivo и in vitro анализы, подвеска в HEPES буферного соливого раствора была адекватной для обеспечения никаких цитотоксических эффектов и диапазона рН, близкого к физиологическим условиям.
Липосомы должны быть мелко обработаны, подобно живым клеткам, чтобы получить более высокое качество SEM изображений. Процедуры фиксации и сушки важны для обеспечения визуализации более мелких неповрежденных пузырьков, поддерживающих значения выше 20 кВ в вакуумных условиях. Рисунок 2 A,B отображает наноразмерные пузырьки, совместимые с процедурой экструзии. Визуализация пузырьков в диапазоне от 51-396 нм возможна при надлежащей подготовке образца после этой процедуры. Шаги включают фиксацию, сушку путем увеличения концентрации этанола, и химическое обезвоживание, чтобы избежать образования агрегатов и разрыв пузырьков, вызванных вакуумным и электронным лучом. С другой стороны, на рисунке 2C,D показаны липосомы пузырьки, высушенные при комнатной температуре и не подвергшиеся описанному здесь лечению, что означает, что они были подготовлены неадекватно. В результате неадекватной процедуры образуются гигантские пузырьки даже после экструзии через мембрану размера поры 0,2 мкм. Разорванные пузырьки также наблюдаются в обеих панелях в результате повреждения вакуумного и электронного луча.
Нанолипосомы пузырьки были изучены в качестве инкапсуляции и доставки системы гидрофобных молекул, в том числе ресвератрол (3,5,4′-trihydroxystilbene), биоактивное соединение против колоректальных раковых клеток. Процедура инкапсуляции может преодолеть плохую растворимость липофильных соединений в дополнение к обеспечению биосовместимости, биоразлагаемости, неиммуногенности и нетоксичности характеристик, присущих липосоме нанокапсул25. Адаптация протокола должна приниматься во внимание в зависимости от маршрута и цели администрирования, таких, как разработка новых липосомформул для устного администрирования.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарны COPPE/UFRJ, Лаборатории электронной микроскопии и лаборатории характеристик многопользовательских материалов; д-ру Адальберто Вьера, д-ру Дженнифер Лоу и Рафаэль Линдозу, профессора Федерального университета в Рио-де- д-ру Александру Гедесу Торресу и Даниэлю Перроне, профессорам Федерального университета в Рио-де- профессору Роланду Бодмайеру и д-ру Андрею Дашевскому из Университета Фрейе в Берлине, которые помогали с ресурсами, предоставляли новые методологии и руководили ACNTF в течение 6-месячного стипендий Erasmus в Германии; д-ру Россане Тире и Алине Фернандес, профессором и техником Федерального университета в Рио-де- Блума Гюнтер и Таисса Родригес, профессор и техник федерального университета в Рио-де- д-р Рейчел Энн Хаузер Дэвис, исследователь в Фандао Освальдо Крус, для повествования. Это исследование было частично профинансировано Корденаньо де Аперфейсоаменто де Пессоаль де Невель-Верховный, Бразилия (КАПЕС) – Финансовый кодекс 001 (грант No 1627392; 1811605); По Фандао Карлос Шагас Филью де Ампаро и Пескиса-ду-Эстадо-де-Рио-де- Е-26/202.815/2018; Е-26/202.815/2018; Е-26/203.039/2015 и Е-26/202.860/2016); Конселхо Насьональ де Десенволвименто Чиентифико электронной Tecnol’gico (cnPq) (грант No 406601/2018-6), и Financiadora де Эстудиос е Projetos (FINEP).
Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich Co | A4418 | |
Analitycal Ballance Mettler H10Tw | Mettler Inc. | 417870 | |
Beckman DU-640 Spectrophotometer | Beckman Coulter | 8043-30-1090 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Co | 5470 | |
BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump | Thermo Fischer Scientific | 05-001-022PM | |
CHEMS (cholesterylhemisuccinate) | Sigma-Aldrich Co | C6512 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich Co | 48520-U | CAUTION |
Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) | Sigma-Aldrich Co | 209198 | |
Coverslips (13mm diameter) | Thermo Scientific Nunc | EW-01839-00 | |
DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) | Lipoid GMBH | 565600.1 | |
Ethanol Absolute | Sigma-Aldrich Co | 32205 | |
Folin -Ciocalteu phenol reagent | Sigma-Aldrich Co | F9252 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich Co | G5882 | |
HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3375 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich Co | 440191 | CAUTION |
JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope | JEOL LTD | ||
Mini Extruder 7 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Lipoid GMBH | 588200.1 | |
Optima L-90k Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
Phosphate Buffer | Sigma-Aldrich Co | P3619 | |
Poli-L-lysine | Sigma-Aldrich Co | P8920 | |
Potassium L-tartrate monobasic | Sigma-Aldrich Co | 243531 | |
Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich Co | S7795 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co | S7653 | |
Sodium Deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich Co | D6750 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich Co | L3771 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich Co | S8045 | |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich Co | RES20908-A7 | |
TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope | Tescan | #657874 | |
Trichloroacetic Acid (TCA) | Sigma-Aldrich Co | 91230 | |
Zetasizer Nano ZSP | Malvern Panalytical LTD | ||
Ultrasonic cleaning bath model 2510 | Branson |