Bu çalışmada nanopartikül karakterizasyonu takip nanoliposome hazırlık için ince lipid film yöntemi kullanılarak klasik hidrasyon açıklanır. A 47 kDa-hidrofilik ve küresel protein, tarin, başarıyla istikrarı artırmak için bir strateji olarak kapsüllenir, hızlı açıklık önlemek, ve kontrollü salınımı teşvik. Bu yöntem hidrofobik moleküllerkapsülasyonuna adapte edilebilir.
Lipozom nanokapsüller ilaç, kozmetik ve gıda endüstrilerinde birçok amaç için uygulanmıştır. Lipozomların özellikleri biyouyumluluk, biyobozunurluk, immünojenite dışı, toksisite olmayan ve hem hidrofilik hem de hidrofobik bileşikleri tuzağa düşürme yeteneğini içerir. Organik bir çözücüde ince lipid filmlerinin klasik hidrasyonu, nanoliposomes’te bir bitki lektini olan tarini kapsüllemek için bir teknik olarak burada uygulanır. Nanoliposome boyutu, stabilite, tuzak verimliliği ve morfolojik karakterizasyon ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Nanoliposomesomes kullanılarak hazırlanır 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-fosfoetanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosfoetanolamine-N-[amino(polietilen glikol)-2000] (amonyum tuzu; DSPE-MPEG 2000) ve kolesterylhemisuccinate (CHEMS) ana bileşenleri olarak. Lipidler ilk sonra bir gecede bağlı ve inkübasyon protein içeren amonyum sülfat çözeltisi rehydrated ince bir lipid film elde etmek için kloroform içinde çözülür. Daha sonra, sonication ve ekstrüzyon teknikleri nanoboyutlu unilamellar veziküller oluşturmak için uygulanır. Nanoveziküllerin büyüklüğü ve polidispersitinin indeksi dinamik ışık saçılımı ile belirlenirken, nanovezikül morfolojisi taramalı elektron mikroskobu ile değerlendirilir. Tuzak verimliliği, kapsülsüz protein miktarının başlangıçta yüklenen proteinin orijinal miktarına oranı ile belirlenir. Homojen lipozomlar ortalama büyüklüğü 155 nm ve polidispersitin indeks değeri 0.168 ile elde edilir. %83’lük yüksek tuzak verimi elde edilir.
Verimli uyuşturucu dağıtım sistemlerini araştıran çalışmaların sayısı son yıllarda artmıştır. Ancak, hızlı açıklık, kötü biyodağıtım ve fizyolojik pH çözünürlük ve yetersiz hücresel alım gibi sınırlamalar hala aşılması gerekir. Nanosistemlerin kullanımı kanser terapötik son ilerleme olarak ortaya çıkmıştır, sağlıklı hücrelerde toksisiteyi en aza indirirken kanserli hücrelerin içinde ilaçların hücre içi konsantrasyonunu artırmak için uygulanan. Ayrıca, farklı bir malzeme yelpazesinden elde edilen nano partiküller (yani, polimerler, dendrimerlar, lipozomlar, virüsler, karbon nanotüpler ve demir oksit ve altın gibi metaller) şu anda antikanser etkilerini artırmak ve sistemik azaltmak için uygulanmaktadır. toksisite1. Özellikle lipozom nanokapsüller ilaç, kozmetik ve gıda endüstrilerinde birçok amaç için uygulanmıştır. Son yıllarda, vitaminler, enzimler ve bitkisel özler gibi çeşitli nutraceutical ürünler lipozom teknolojisikullanılarakformüle edilmiştir 2.
Lipozomlar bir veya daha fazla konsantrik lipid iki kat larından oluşan küresel veziküllerdir. Fosfolipidlerin kutup başları, sulu ortamla temas halinde, membranların dış ve iç yüzeylerinde yer alır. Buna karşılık, yağ asidi zincirleri membranların hidrofobik çekirdekformu ve su korunur 5. Onları çekici ilaç dağıtım sistemleri yapmak lipozomların bazı özellikleri biyouyumluluk dahil, biyobozunurluk, non-immünojenite, non-toksisite, ve yeteneği hem hidrofilik ve hidrofobik bileşikler ikapan6.
Lipozomlar ajitasyon, sonication, ekstrüzyon, lyophilization, dondurma ve eritme gibi çeşitli süreçler adımları kullanılarak hazırlanabilir. Klasik yöntemler arasında ters faz buharlaşması, solvent enjeksiyonu ve deterjan diyalizi sayılabilir. En çok uygulanan yöntem ince lipid film hidrasyon, ayrıca Bangham yöntemi olarak bilinen, veziküler-lipid formları elde etmek için kullanılan7,8,9,10,11. Lamellarite (fosfolipid çift katmanlı sayısı) ve partikül boyutu lipozomları karakterize etmek için kullanılan klasik parametrelerdir 1) unilamellar veziküller (ULV), benzersiz fosfolipid çift katmanlı oluşan ve aşağıdaki gibi boyutu değişen: i) küçük unilamellar veziküller (SUV’ lar, ~0.02-0.20 μm), ii) büyük unilamellar veziküller (LUVs, ~0.2-1.0 μm) ve iii) dev unilamellar veziküller (GUVs, >1 μm); veya 2) multilamellar veziküller (MLVs, >0.1 μm)3,12. Vezikül boyutu terapötik kullanım için düşünürken önemli bir parametredir, kanser tedavisinde olduğu gibi, hangi boyutlarda <200 nm endotel bariyerini geçmek ve tümöral dokulara ulaşmak için nanoveziküller izin vermek için idealdir4.
Burada, ince bir lipid film tekniği7 klasik hidrasyon aşağıdaki kapsülleme prosedürü tarin kullanılarak tarif edilince, bir bitki lektin hidrofilik globüler protein olarak karakterize13,14,15 . Nanoboyutlu veziküller ana teknikte sonication ve ekstrüzyon adımları dahil edilerek üretilmektedir, yüksek tuzak verimliliği ile kararlı lipozomal nanoveziküller sonuçlanan16.
Burada açıklanan protokol Correa ve ark.16 tarafından tarin kapsüllemek için test edildi, Colocasia esculenta22 saf bir immünomodülatör ve antitümöral lektin . Metodoloji, terapötik uygulamalar için uygun boyutta istikrarlı nanoliposomes üretimi için izin, başarılı sonuçlar verdi. Formülasyon fizyolojik koşullar altında farklı pH düzeylerinde kontrollü salınım sunar. Ayrıca insan glioblastoma U-87 MG ve meme kanseri MDA-MB-231 hücre hatları ve fareler kemik iliği hücrelerinin stimülasyonu inhibisyonu gibi tarin farmakolojik özellikleri, potentiates. Lipozomal preparat sağlıklı fare hücrelerinde toksik etki göstermedi16.
Klasik yöntem, ilk Bangham ve ark.7tarafından açıklanan, büyük multilamellar lipozom veziküller üretimi için izin verir, boyut ve şekil heterojen. Bu yöntemin adaptasyonları, bu çalışmada bildirildiği gibi, 0,2 μm polikarbonat membran üzerinden sonication ve ekstrüzyon gibi ek adımlar dahil edilerek başarıyla uygulanır. Bu nanometre aralığında boyutu ile ilgili daha homojen bir dağılım üretimi sağlar16,23,24. Bu nedenle, başarılı sonuçlar elde etmek için, burada açıklanan kapsülleme protokolü ve lipozomal formülasyon kesinlikle takip edilmelidir.
Nanoliposome bileşimi dikkatle dope, MPEG 2000-DSPE ve CHEMS ile iki katmanlı membran oluşumunu sağlamak için seçilmiştir ana bileşenleri olarak. Bu doğal hayvan zarı çift katmanlı bileşenleri ve ikincisi nanoliposome mimarisine akışkanlık verebilir, insanlarda biyoaktif bileşik teslim için geniş uygulama sağlanması.
Nanolipozom pegiletion lipozom yapı istikrarı nı garanti etmek için gereklidir. PEG’in yokluğu boyut genişlemesine, yüksek polidispersitlik indeksi ve düşük tuzak verimliliğine yol açar. Ana lipozom bileşeni olarak DOPE ile optimal sonuçlar elde edilebilir. Ancak, bu yüksek maliyetli fosfolipid olduğunu. Nanoliposome üretiminin finansal maliyetleri DOPE gibi diğer benzer lipidler ile DOPE değiştirerek elde edilebilir (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin). CHEMS doğal olarak hayvan hücre zarlarında bulunan bir kolesterol molekülüdür, formülasyon dışında olmamalıdır, lipid iki katmanlı akışkanlık ve dövülebilirlik sağlamak için önemlidir beri16.
Kapsülleme protokolünün diğer yönleri de uyarlanabilir. Lipozomal bileşenleri eritmek için kullanılan kloroform kolayca boyut ortalaması, homojenlik ve tuzak verimliliği üzerinde hiçbir etkisi ile metanol ile değiştirilebilir. Ancak, bazı protein sızıntısı depolama 4 °C16altında oluşabilir. Tarin içeren amonyum sülfat çözeltisi ile bir gecede kuluçka adımı zorunlu değildir; ancak, rahatlık için nanoliposomal biyofiziksel özellikleri, kapsülleme veya stabilite verimliliği kayıpları, correa ve ark.16tarafından gösterildiği gibi hiçbir zarar ile yapılabilir. Ekstrüzyon adımı oda sıcaklığında gerçekleştirilir ve 0,1 m’lik gözenek boyutunda bir membran kullanılırsa şırıngalar arasındaki akış hızını azaltabilir.
Bu sorunun üstesinden gelmek için, 0,2 m gözenek boyutunda membran kullanımı veya ekstrüder tutucunun lipid geçiş sıcaklığının üzerinde ısıtılması göz önünde bulundurulmalıdır. Analist inaktive edilebilir lipidler veya protein zarar ve biyolojik aktivite kaybetmek için dikkatli olmalıdır. Alternatif olarak, lipozomal preparat, protein moleküler ağırlığına göre bir kesme membran ı kullanılarak ultrasantrifüj yerine HBS’ye karşı diyalize salınabilir. Nanoliposomes ultracentrifugation sonra askıya alınan tampon kimyasal doğa seçimi doğrudan sonraki uygulama ile ilgilidir. Bu çalışmanın perspektifleri in vivo ve in vitro tahlilleri içerdiğinden, HEPES tamponlu tuzlu lunda süspansiyon, fizyolojik koşullara yakın bir pH aralığı ve sitotoksik etki sağlamak için yeterli ydi.
Lipozomlar ince, canlı hücrelere benzer, daha kaliteli SEM görüntüleri elde etmek için tedavi edilmelidir. Vakum koşullarında 20 kV’dan yüksek değerleri destekleyen daha küçük bozulmamış veziküllerin görüntülenmesi için fiksasyon ve kurutma prosedürleri önemlidir. Şekil 2 A,B ekstrüzyon prosedürü ile uyumlu nanoboyutlu veziküller görüntüler. Bu işlem den sonra yeterli numune hazırlama yapılırsa 51-396 nm arasında değişen veziküllerin görüntülenmesi mümkündür. Adımlar fiksasyon dahil, etanol konsantrasyonları artırarak kurutma, ve kimyasal dehidratasyon agregalar ve vakum ve elektron ışını neden yırtılmış veziküllerin oluşumunu önlemek için. Öte yandan Şekil 2C,D’ de oda sıcaklığında kurutulmuş ve burada açıklanan herhangi bir tedaviye tabi tutulmayan lipozom veziküller gösterilmektedir, bu da yetersiz hazırlandıkları anlamına gelir. Yetersiz prosedürün bir sonucu olarak, 0,2 μm gözenek boyutunda bir membran ile ekstrüzyon sonra bile dev veziküller oluşur. Vakum ve elektron ışını hasarı sonucu her iki panelde de yırtık veziküller görülür.
Nanoliposome veziküller resveratrol dahil hidrofobik moleküller için bir kapsülleme ve dağıtım sistemi olarak araştırılmıştır (3,5,-trihidroksistilbene), kolorektal kanser hücrelerine karşı biyoaktif bir bileşik. Kapsülleme prosedürü biyouyumluluk, biyobozunurluk, immünojenite olmayan ve lipozom nanokapsüller 25 doğasında olmayan toksisite özellikleri sağlamanın yanısıra lipophilic bileşiklerin kötü çözünürlük üstesinden gelebilir . Protokol uyarlamaları, sözlü yönetim için yeni lipozom formülasyonlarının geliştirilmesi gibi yönetim güzergahına ve amacına bağlı olarak dikkate alınmalıdır.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar COPPE / UFRJ, Elektronik Mikroskopi Laboratuvarı ve Çok Kullanıcılı Malzeme Karakterizasyon Laboratuvarı tesisleri müteşekkir; Dr Adalberto Vieyra, Dr Jennifer Lowe ve Rafael Lindoso, Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brezilya, ultracentrifuge kullanımı için profesörler; Dr Alexandre Guedes Torres ve Daniel Perrone, Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brezilya, döner evaporatör kullanımı için profesörler için; Kaynaklara yardımcı olan, yeni metodolojiler sağlayan ve Almanya’da 6 aylık Erasmus+ bursu sırasında ACNTF’yi denetleyen Berlin’deki Freie Universität’tan Profesör Roland Bodmeier ve Dr. Andriy Dashevskiy’e; Dr Rossana Thiré ve Aline Fernandes, Profesör ve Teknisyen Universidade Federal rio de Janeiro, UFRJ, Brezilya, Zetasizer Malvern kullanımı için; Bluma Guenther ve Taissa Rodrigues, Profesör ve Teknisyen Universidade Federal rio de Janeiro, UFRJ, Brezilya, SEM kullanımı için; Dr Rachel Ann Hauser Davis, Fundação Oswaldo Cruz araştırmacı, anlatım için. Bu çalışma kısmen Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, Brasil (CAPES) – Finans Kodu 001 (hibe No. 1627392; 1811605); Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (hibe No. E-26/202.815/2018; E-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 ve E-26/202.860/2016); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (hibe No. 406601/2018-6) ve Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) tarafından.
Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich Co | A4418 | |
Analitycal Ballance Mettler H10Tw | Mettler Inc. | 417870 | |
Beckman DU-640 Spectrophotometer | Beckman Coulter | 8043-30-1090 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Co | 5470 | |
BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump | Thermo Fischer Scientific | 05-001-022PM | |
CHEMS (cholesterylhemisuccinate) | Sigma-Aldrich Co | C6512 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich Co | 48520-U | CAUTION |
Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) | Sigma-Aldrich Co | 209198 | |
Coverslips (13mm diameter) | Thermo Scientific Nunc | EW-01839-00 | |
DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) | Lipoid GMBH | 565600.1 | |
Ethanol Absolute | Sigma-Aldrich Co | 32205 | |
Folin -Ciocalteu phenol reagent | Sigma-Aldrich Co | F9252 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich Co | G5882 | |
HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3375 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich Co | 440191 | CAUTION |
JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope | JEOL LTD | ||
Mini Extruder 7 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Lipoid GMBH | 588200.1 | |
Optima L-90k Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
Phosphate Buffer | Sigma-Aldrich Co | P3619 | |
Poli-L-lysine | Sigma-Aldrich Co | P8920 | |
Potassium L-tartrate monobasic | Sigma-Aldrich Co | 243531 | |
Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich Co | S7795 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co | S7653 | |
Sodium Deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich Co | D6750 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich Co | L3771 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich Co | S8045 | |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich Co | RES20908-A7 | |
TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope | Tescan | #657874 | |
Trichloroacetic Acid (TCA) | Sigma-Aldrich Co | 91230 | |
Zetasizer Nano ZSP | Malvern Panalytical LTD | ||
Ultrasonic cleaning bath model 2510 | Branson |