Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

شبكات خلايا القلب المستمدة من iPSC البشرية على صفائف متعدد الأقطاب الكهربائية الصغيرة للتسجيلات المحتملة للعمل المتكرر

Published: July 15, 2019 doi: 10.3791/59906
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2,3
1Aurora Research Institute, Advocate Aurora Health Care, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering and Applied Science, University of Wisconsin-Milwaukee, 3Department of Medicine-Cardiovascular, School of Medicine, Johns Hopkins University
* These authors contributed equally

Summary

تحتوي هذه المقالة على مجموعة من البروتوكولات لتطوير الخلايا الجذعية المستمدة من الخلايا الجذعية (hiPSC-CM) الشبكات المستزرعة على لوحات MEA متعددة الآبار لقلب غشاء الخلية للعمل القياسات المحتملة. يتم الحصول على تسجيلات عالية الإنتاجية من نفس مواقع الخلايا مرارا وتكرارا على مدى أيام.

Abstract

فحص سلامة القلب ذو أهمية قصوى لاكتشاف المخدرات والعلاج. ولذلك، هناك حاجة ماسة إلى تطوير نهج جديدة عالية الإنتاجية الكهربائية الفسيولوجية لمستحضرات خلايا القلب المستمدة من hiPSC (hiPSC-CM) لاختبار المخدرات بكفاءة. على الرغم من أن صفائف متعددة الأقطاب (MEAs) تستخدم في كثير من الأحيان للقياسات الميدانية المحتملة للخلايا المنفعلة، فإن منشوراً صدر مؤخراً عن جوشي - موخيرجي وزملاؤه وصف وصدق على تطبيقه لتسجيلات إمكانية اتخاذ الإجراءات المتكررة (AP) من نفس إعداد hiPSC-CM على مدى أيام. والهدف هنا هو توفير أساليب مفصلة خطوة بخطوة لبذر CMs وقياس أشكال الموجات AP عن طريق الكهربائي بدقة عالية ودقة زمنية من 1 μs. ويعالج هذا النهج عدم وجود منهجية سهلة الاستخدام للوصول داخل الخلايا إلى قياسات AP عالية الإنتاجية لإجراء تحقيقات كهربائية فسيولوجية موثوقة. وتناقش سير العمل التفصيلي وطرق طلاء hiPSC-CMs على لوحات الشرق الأوسط والإدارة متعددة الآبار مع التركيز على الخطوات الحاسمة حيثما كان ذلك مناسباً. بالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن سيناريو MATLAB مصمم خصيصًا للمعالجة السريعة للبيانات واستخراجها وتحليلها لإجراء تحقيق شامل في تحليل الموجي لتحديد الاختلافات الدقيقة في المورفولوجيا لمختلف معلمات مدة AP المتورطة في عدم انتظام ضربات القلب والسمية القلبية.

Introduction

خلايا القلب المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى (hiPSC-CMs) هي المعيارالذهبي لعدد متزايد من المختبرات 1،2،3،4،5،6 ،7،8،9،10. ضرب الأجسام الجنينية11،12،13 وأحادية الطبقة3،7،10،11،12، 13،14،15،16،17 التمايز هي الطرق المفضلة لإنتاج خلايا القلب ومجموعة متعددة الأقطاب (الشرق الأوسط ورابطة الشرق الأوسط والأوسط) أصبحت طريقة مشتركة لمراقبة الديناميكا الكهربائية لهذه الشبكات18،19،20. في حين أن المعلمات التي يمكن استخراجها من الإمكانات الميدانية (FPs) مثل معدل الضرب، والسعة، والمدة وفترات RR هي استجابات كهرولوجية أساسية من الضرب تلقائيا أحادية الطبقات18،21، 22،23، وإمكانات العمل (AP) مكونات الكامنة وراء هذه الإشارات FP خارج الخلية من الصعب استقراء24. لدينا منشور حديث عن اكتشاف تطبيق الجوانب الالتجارية عبر علم الجوانب القصيرة المصدر لقياسات AP المتكررة المباشرة يوفر دليلا على منهجية للمقومات AP مثالية داخل الخلايا مع تحليل الموجي واسعة النطاق في مختلف مراحل إعادة الاستقطاب عبر متعددة دفعات من شبكات خلايا القلب المستمدة hiPSC3. في الدراسة أظهرنا أن تسليم النبضات الكهربائي إلى شبكات خلايا القلب المشتقة من hiPSC تمكن الوصول داخل الخلايا لتسجيلات AP. هذه التسجيلات AP عابرة تعتمد على التعافي المحتملةعبر الغشاء لوحظ من خلال موقع الإصابة 3،25،26. وأظهرت الأشكال الموجية المسجلة عن طريق الشرق الأوسط والإدارة والتصحيح المشبك في دراستنا مورفولوجياس AP مماثلة وبالتالي التحقق من موثوقية النهج3.

وقد ذكرت بعض المختبرات قياس APs من مختلف الخلايا الكهربائية باستخدام الجوانب المنخفضة الصنع حسب الطلب18،21،26،27،28،29، 30، ولكن لم يتم تقييم موثوقية استخدام الجوانب الجوانب الجوانب الحياتية المتعددة السنوات لقياسات AP متسقة ومتكررة. حاليا، ويقتصر الذهب القياسية التصحيح المشبكتقنية التسجيلات الطرفية 7،31 في حين أن، القياسات AP المستندة إلى الشرق الأوسط والشرق الأوسط وذلك العابرة، وبالتالي يمكن إجراؤها عدة مرات على نفس الخلية. كما نبين أنه يمكن للمرء أن يسجل بسهولة إشارات AP عالية الجودة في نطاق ميليفولت تتطلب الحد الأدنى من التصفية. ولذلك يمكن للباحثين أن يجروا دراسات لا حادة فحسب بل ومزمنة أيضا في المستحضرات نفسها باستخدام الجوانب البيئية المتعددة الجوانب. نظرا ً للتركيز المتزايد على التنبؤ باضطراب نظم القلب والسمية القلبية المرتبطة بالمخدرات24و32و33و34و35، دمج قياس AP وستعزز النُهُج تقييمات سلامة المخدرات وفعاليتها.

هنا، نقدم بروتوكولات ل1) ما قبل الطلاء من hiPSC-CMs حفظها بالتبريد للنضج، 2) فصل والطلاء من hiPSC-CMs على الاتفاقيات المتعددة الجوانب المنخفضة والمتوسطة، 3) تسجيل الملوثات التي يمكن ترتيبها ونقاط العمل من شبكات hiPSC-CM، 4) تجزئة واستخراج البيانات للتحليل، و 5) استعادة الصفائف لإعادة استخداممتعددة. وقد تم تحسين كل خطوة إلى أقصى حد مع التركيز على الخطوات الحاسمة حيثما كان ذلك مناسبا. تتم مناقشة متطلبات مرفق الخلية لضمان الضرب أحاديالطبقة المتزامنة وشرح إجراءات استعادة MEA متعددة الآبار للدراسات الكهرولوجية المتكررة. وأخيراً، يتم تقديم واجهة المستخدم الرسومية المخصصة التي تم تطويرها في المختبر لاستخراج إشارة AP، وضمان الجودة، وسير عمل التجزئة لتحديد وتحليل معلمات AP.

Protocol

1 - إعداد الحلول والمواد (انظر جدول المواد)

  1. 6-جيدا الأنسجة الثقافة لوحة طبقة طبقة طلاء
    1. إذابة الركيزة طلاء على الجليد أو في 4 درجة مئوية.
    2. إعداد 1:100 طلاء الركيزة تخفيف في الباردة DMEM / F12 المتوسطة. خلط الحل عن طريق الأنابيب بطيئة.
    3. نقل 2 مل من حل الركيزة طلاء (الخطوة 1.1.2) لكل بئر من لوحة ثقافة الأنسجة 6 جيدا.
    4. على الفور وضع لوحة زراعة الأنسجة المغلفة في حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 7 ساعة على الأقل واستخدامها في غضون 7 أيام.
  2. [هبك-كم] ثقافة وسط
    1. إضافة 10 مل من الوسائط CM الملحق ذاب في 4 درجة مئوية إلى 500 مل من قاعدة CM المتوسطة. يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
    2. Aliquot المطلوبة كمية من وسائل الإعلام لهذا اليوم وجلب إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
  3. hiPSC-CM ذوبان المتوسطة: إعداد الطازجة عن طريق خلط hiPSC-CM الثقافة المتوسطة (الخطوة 1.2) مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS). جلب وسائل الإعلام إلى درجة حرارة الغرفة قبل ذوبان أجهزة الصراف الآلي للتعليق.
  4. فيبرونيكتين 1 ملغ / مل حل الأوراق المالية: Aliquot 200 € L في أنابيب ميكروفوج معقمة 1.5 مل وتخزينها في 4 درجة مئوية للاستخدام في وقت لاحق. إعداد حل العمل من تركيز 50 ميكروغرام / مل حديثا على الجليد.
  5. حل تنظيف تالمتعدد: الجمع بين 0.5 غرام من المنظفات الأنزيمية مع 50 مل من الماء المقطر المزدوج المعقمة (ddH2O). دوامة لخلط المحتويات. تصفية وتخزين في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.

2- الطلاء المسبق للمحلول بالتبريد hiPSC-CM من أجل النضج (الشكل 1)

ملاحظة: يهدف هذا القسم إلى ذوبان وزراعة hiPSC-CMs التي تم تمييزها باستخدام طريقة أحادية الطبقة خالية من المغذية3و16 وحفظها بالتبريد في النيتروجين السائل 10 أيام بعد التمايز في 1-2 مليون خلية /قارورة. يتم طلاء الخلايا من قارورة واحدة في بئرين المغلفة الركيزة من لوحة ثقافة الأنسجة 6 جيدا. خلايا القلب تميل إلى تسوية في الجزء السفلي من الأنبوب خلط لطيف جدا في وقت الطلاء المسبق مهم لتحقيق كثافة الخلايا حتى عبر الآبار.

  1. Aliquot 2 مل من FBS لكل قارورة من hiPSC-CMs يجري إذابة في أنبوب مخروطي 15 مل وجلب إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. ذوبان قارورة من hiPSC-CMs المحفوظة بالتبريد عن طريق وضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية ودوامة بلطف حتى ذوبان لمدة لا تزيد عن 3 دقائق.
  3. نقل محتويات القارورة على الفور إلى الأنبوب الذي يحتوي على FBS (انظر الخطوة 2.1)، مزيج من قبل دوامة والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
  4. يستنشق supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من hiPSC-CM ذوبان المتوسطة (انظر الخطوة 1.3) لكل قارورة ذابت. استخدام ماصة نقل لإعادة تعليق بيليه عن طريق trituration لطيف. تقييم صلاحية الخلية.
  5. إضافة إضافية 3 مل من ذوبان المتوسطة لكل قارورة من hiPSC-CM ذاب في الخطوة 2.4 وتعليق بلطف باستخدام ماصة نقل لمزيد من تفكك الخلايا.
  6. صرف 2 مل من تعليق الخلية بلطف في كل بئر من لوحات 6-well المغلفة الركيزة (انظر الخطوة 1.1). مكان في حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  7. يستعاض عن هاسي-سي إم الطازجة المتوسطة بعد 24 ساعة و 3 مرات أسبوعيا بعد ذلك لمدة 20 يوما.
    ملاحظة: يجب أن تلتزم الخلايا بطلاء الركيزة بنسبة 24 ساعة وتضرب تلقائيا ً عند 48 ساعة بعد الطلاء (انظر الفيديو 1 والفيديو 2).

3. Multiwell الشرق الأوسط والأوسط وذلك التعقيم لوحة والطلاء (الشكل 2 والشكل 3)

ملاحظة: البروتوكول الموصوف هنا هو لإعداد لوحات MEA 24-well مع 12 الأقطاب الصغيرة المغلفة PEDOT الذهب على الزجاج لطلاء hiPSC-CM. تجنب لمس الجزء السفلي من لوحة لأن هذا قد يضر الأقطاب الكهربائية.

  1. قبل يومين من طلاء الخلايا، أضف 0.5 مل من متوسط ثقافة hiPSC-CM (انظر الخطوة 1.2) إلى كل بئر وتنفيذ تسجيل أساسي للتحقق من نسبة الإشارة إلى الضوضاء للتحقق من جودة الجوانب البيئية البيئية البحرية.
  2. يستنشق وسائل الإعلام، شطف مع معقمة ddH2O وتعقيم تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية داخل غطاء محرك السيارة تدفق laminar بين عشية وضحاها.
  3. في اليوم السابق لطلاء الخلايا، إضافة 0.1 مل من FBS إلى كل بئر لعلاج المائية من الأسطح الشرق الأوسط والأوسط والزراعة. الحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. هذه الخطوة ضرورية لإرفاق الخلية.
  4. يستنشق FBS وشطف مع 0.5 مل من ddH معقمة2س لكل بئر. كرر مرة أخرى.
  5. اترك اللوحة لتجف في غطاء تدفق اللامينار بين عشية وضحاها.
  6. إعداد تخفيف العمل من 50 ميكروغرام / مل فيبرونيكتين في الباردة DMEM / F12 المتوسطة من المخزون (انظر الخطوة 1.4). الحفاظ على الحل على الجليد.
  7. ماصة 5 ميكرولتر من تخفيف فيبرونكتين العمل (انظر 3.6) وصرف بعناية قطرات إلى مركز كل بئر لتغطية جميع الأقطاب 12. من المهم العمل بسرعة عبر الآبار الـ 24 لمنع القطرات من التجفيف.
  8. على الفور وضع لوحة الشرق الأوسط والمياه متعددة الآبار المغلفة فيبرونيكتين على سطح مرتفع داخل غرفة ترطيب تحتوي على ddH2O معقمة لتغطية سطح الطبق بأكمله. وضع الغرفة مع لوحة MEA multiwell لمدة 3 ح في حاضنة ثقافة الخلية.
    ملاحظة: وضع 24 لوحة MEA جيدا في غرفة ترطيب أمر بالغ الأهمية لمنع قطرات الفيبرونكتين من الجفاف خلال فترة الحضانة.

4. hiPSC-CM التفكك والطلاء على لوحة MeA Multiwell (الشكل 3)

ملاحظة: بدء هذه الخطوة حوالي 1 ساعة قبل اكتمال حضانة فيبرونكتين الشرق الأوسط والشرق الأوسط. تأكد من أن حل تفكك الخلية عند 37 درجة مئوية ومتوسطة ذوبان iPSC-CM في درجة حرارة الغرفة. وقد تم تحسين أساليب التفكك لمدة 30 يوما بعد تمييز hiPSC-CMs المستزرعة على لوحات 6-well المغلفة الركيزة (انظر الخطوة 2) للحصول على حوالي 90٪ من CMs قابلة للحياة لطلاء الشرق الأوسط والأوسط وذلك. وينبغي الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء في حين تتثاءب لمنع موت الخلايا.

  1. يستنشق وسط الثقافة من كل بئر من طبق زراعة الأنسجة 6-well مع ثقافة hiPSC-CM بعد 30 يوم ًا (انظر الخطوة 2.7) واغسل هـذا الطبق بـ 2 مل من D-PBS المعقمة لكل بئر.
  2. إضافة 1 مل من حل تفكك الخلية قبل تسخينها (انظر جدولالمواد) لكل بئر وحضانة لمدة 4 دقائق في 37 درجة مئوية. استخدام ماصة نقل لtriturate بلطف لتخفيف الخلايا للانفصال. إذا كانت معظم الخلايا لا تزال ملتزمة، وحضانة لمدة 3 دقائق أخرى في 37 درجة مئوية وtriturate مرة أخرى. هذا الحضانة إضافية ينبغي أن تساعد على استرداد الخلية القصوى. لا تحضن لأكثر من 7 دقائق لأن هذا قد يؤدي إلى انخفاض قدرة الخلية على البقاء.
  3. باستخدام ماصة نقل، تجمع جميع الخلايا المنفصلة في أنبوب مخروطي يحتوي على hiPSC-CM ذوبان المتوسطة (انظر الخطوة 1.3). من المستحسن تعليق الخلايا في ما لا يقل عن ضعف حجم وسائل الإعلام (2 مل لكل بئر يجري حصادها) لمنع نشاط حل تفكك الخلية.
  4. الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
  5. يستنشق الحل بعناية كما يتم إرفاق بيليه فضفاضة على السطح وإعادة تعليق في 0.1 مل من hiPSC-CM ذوبان المتوسطة. استخدام ماصة نقل لإعادة تعليق بيليه عدة مرات عن طريق trituration لطيف.
  6. Aliquot 2 ميكرولتر من الخلايا المنفصلة والمخففة مع 18 ميكرولتر من وسائل الإعلام في أنبوب ميكروفوج 1.5 مل. إضافة 20 درجة مئوية من الأزرق تريبان ومزيج لحساب الخلايا وتقييم الجدوى.
  7. ضبط كثافة الخلية إلى 6000 خلية / ميكرولتر عن طريق إضافة الحجم المناسب من hiPSC-CM ذوبان المتوسطة. تعليق بيليه عن طريق نفض الغبار لطيف عدة مرات. وhiPSC-CMs بسهولة فصل من الأسطح الزجاجية وخاصة عندما مطلي في كثافات عالية. لقد قمنا بتحسين كثافة البذر وظروف الطلاء لتحقيق 15 يوما من التسجيلات الكهربائية.
  8. عندما تكون جاهزة، وجلب لوحة MEA multiwell في غطاء محرك السيارة تدفق laminar لبذر الخلايا. من المهم جداً تنفيذ الخطوتين التاليتين بشكل جيد لمنع الفيبرونكتين من التجفيف.
    1. قم بإزالة قطرات الفيبرونكتين بعناية باستخدام ماصة P10 دون لمس الأقطاب الكهربائية.
    2. الاستغناء على الفور قطرات خلية 5 ميكرولتر (30،000 خلية) إلى وسط بئر لوحة الشرق الأوسط والمياه تغطي جميع الأقطاب 12. كرر الخطوة حتى يتم طلاء جميع الآبار الـ 24. ينصح بالخلط المتقطع لتعليق الخلايا عن طريق النقر.
  9. ضع لوحة MEA متعددة الآبار مرة أخرى في غرفة الترطيب المغطاة بشكل فضفاض والعودة إلى حاضنة زراعة الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% CO2 لمدة 3 ساعة لتعلق الخلايا.
  10. إضافة بعناية 200 درجة مئوية من hiPSC-CM ذوبان المتوسطة إلى كل بئر دون إزعاج الخلايا باستخدام ماصة P200. إضافة وسائل الإعلام إسقاط إلى جانب البئر.
  11. ضع لوحة MEA متعددة الآبار مرة أخرى في حاضنة ثقافة الخلية.
  12. استبدال مع ارتفاع جديد hiPSC-CM وسط الثقافة في 24 ساعة آخر الطلاء. يمكن ملاحظة الضرب التلقائي لخلايا القلب في هذه المرحلة (انظر الفيديو 3).
  13. تغيير وسائل الإعلام كل يومين حتى نهاية التجارب.

5. hiPSC-CM الكهربائي واقتناء إشارة (الأشكال 4 - 6)

ملاحظة: هذا البروتوكول هو للتسجيل المتزامن لإشارات القطب عالية الإنتاجية (12 موقعا لكل من الآبار 24). يتم استخدام نظام MEA متعدد الآبار 24 جيدا مع برنامج الاستحواذ (انظر جدول المواد). يتم إجراء جميع تسجيلات الشرق الأوسط والأوسط والأوسط والأوسط والأوسط وذلك عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

  1. قم بتشغيل لوحة الواجهة وبادر إلى تشغيل برنامج الاكتساب. السماح بوقت كاف لmultiwell الشرق الأوسط والأوسط والأوسط والأوسط وذلك في درجة حرارة 37 درجة مئوية (انظر السهم رقم 1 في الشكل4).
  2. إدراج لوحة MEA multiwell من الخطوة 4 في المرحلة الأمامية MEA multiwell عن طريق وضعه مغطاة على منصة التسجيل وانقر فوق الزر إدراج (انظر السهم رقم 2 في الشكل 4). السماح لدرجة الحرارة لتحقيق الاستقرار قبل بدء التسجيلات.
  3. ضبط إعدادات الاكتساب والكهرباء
    1. انقر على أيقونة تعريف التدفق التجريبي (انظر السهم رقم 3 في الشكل 4)وحدد وقت التسجيل إلى دقيقتين أو حسب الرغبة.
    2. انقر على رمز إعداد الحصول على البيانات (انظر السهم رقم 4 في الشكل 4)وتعيين معدل أخذ العينات إلى 20 كيلوهرتز، وعامل تصفية عالي التمرير إلى 0.1 هرتز وعامل تصفية تمرير منخفض إلى 3500 هرتز.
    3. انقر على أيقونة إعدادات التحفيز (انظر الشكل5). ضمن علامة التبويب تعريف التحفيز، قم بتعريف التحفيز على أنه نبضات الجهد المتناظرة biphasic من 1 مل فولت و 1 مللي ثانية و1 هرتز. ضمن علامة التبويب أقطاب التحفيز، حدد مواقع الكهربة من خلال تسليط الضوء على جميع الأقطاب الكهربائية ذات الصلة.
  4. انقر فوق الزر استكشاف لتصور الإشارات في جميع الآبار. تحقق من جودة الإشارة وظروف الحالة الثابتة. تدوين الملاحظات على الأقطاب الكهربائية مع إشارات FP في نطاق mV. انقر فوق نفس الزر لإيقاف الاستكشاف. ولم تسجل أية بيانات حتى هذه النقطة.
  5. بدء التسجيل عن طريق النقر على زر الذهاب! سوف تظهر الأقطاب الكهربائية في كل بئر إشاراتFP في نافذة البيانات الخام (الشكل 6). بعد 30 s من التسجيل، انقر على زر تحفيز والسماح الكهربائي أن يحدث على المواقع المحددة لمدة 30 s. ثم، انقر على نفس الزر لوقف التحفيز ومواصلة التسجيل ل60 ثانية المتبقية.
    ملاحظة: يمكن تشغيل الملف المسجل مرة أخرى عن طريق التبديل إلى "وضع Replayer" في القائمة المنسدلة 'تطبيق'.

6. متعددة الآبار الشرق الأوسط والأوسط والمياه تنظيف لوحة لإعادة استخدامها

  1. بعد التجارب النهائية، وتنظيف جميع الآبار في لوحة multiwell عن طريق aspirating جميع محتويات وسائل الإعلام من كل بئر وتجنب بعناية لمس سطح القطب الكهربائي.
  2. إضافة 1 مل من ddH معقمة2س لكل بئر. يستنشق ويتكرر مرة واحدة.
  3. إضافة 0.3 مل من حل التنظيف متعدد الآبار (انظر الخطوة 1.5) لكل بئر. حضانة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لطرد الخلايا والحطام.
  4. في صباح اليوم التالي، يستنشق الحل ويشطف بـ 1 مل من ddH المعقمة2O. الحضانة لمدة 5 - 7 دقائق واستنشاق. كرر 5 مرات.
  5. إضافة 0.5 مل من ddH معقمة2س لكل بئر. تسجيل خط الأساس للوحة multiwell تنظيفها للتحقق منجودة الجوانب البيئية المتعددة السنوات التي تم تنظيفها (الشكل 7).
  6. يُحفظ عند 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزاً للاستخدام.

7. تحويل ملف البيانات وتصديره

ملاحظة: سيتم إنشاء أربعة ملفات بيانات لكل تسجيل: ملفات MWR وMWC وMWD وMWS. باستخدام برنامج المحول، يمكن تحويل ملف MWD إلى ملف H5 للتحليل اللاحق باستخدام البرنامج النصي المخصص (راجع الملف التكميلي 1).

  1. بدء برنامج المحول (راجع جدولالمواد).
  2. حدد تعيين مسار الإدخال من القائمة ملف. حدد مجلدًا يحتوي على ملفات بيانات ذات أهمية.
  3. حدد تعيين مسار الإخراج من القائمة ملف. حدد المجلد حيث يتم حفظ الملفات المحولة.
  4. تسليط الضوء على ملف وزارة شؤون المرأة من الفائدة.
  5. انقر فوق الزر تصدير إلى HDF5.

8- تجزئة البيانات وتحليلها (الأشكال 8-10)

ملاحظة: يتم استخدام البرامج المخصصة المستندة إلى Matlab لقطعة واستخراج معلمات بيانات FP و AP مختلفة. يتوفر البرنامج عند الطلب.

  1. تشغيل رمز تحليل الموجي باستخدام Matlab (راجع الشكل 8 لعرض إطار واجهة المستخدم الرسومية الرئيسي).
  2. انقر على ملف وحدد عملية .h5.
  3. ابحث عن الملف mwd.h5 الذي تم إنشاؤه وفقًا للخطوة 7 أعلاه.
  4. انقر فوق الزر حفظ الدليل لتغيير موقع التخزين لملفات الإخراج.
  5. إنشاء قائمة انتظار معالجة إشارة عن طريق تحديد قطب / تركيبات جيدة من الفائدة ومن ثم النقر على زر قائمة الانتظار. كرر هذه الخطوة لإلحاق المزيد من تركيبات الأقطاب الكهربائية/الآبار التي سيتم معالجتها إلى قائمة الانتظار.
  6. تحرير قائمة الانتظار عن طريق النقر مباشرة على اسم ميد / ميد التركيز إذا تم التعامل مع الخلايا مع المخدرات (الشكل8).
  7. بمجرد انتهاء قائمة الانتظار، انقر فوق الزر تهيئة أشكال الطول. وسيبدأ ذلك المعالجة الأولية التي يتم فيها تحديد الإشارات واستخراجها للتجزئة.
  8. انقر على زر التكبير وحدد مجال العمل المحتمل ة للاهتمام مع المؤشر (الشكل 9).
  9. انقر فوق الزر الاحتفاظ ومراجعة اللوحات. يتم الكشف عن القمم (الأحمر 'x') وأحواض (الدوائر الصفراء) لكل الموجي ويتم فرض إمكانات العمل تطبيع. انقر فوق الزر الاحتفاظ والانتقال إلى التتبع التالي في قائمة الانتظار (الشكل 10).
  10. كرر الخطوات 8.8-8.9 لبقية إشارات القطب/الجمع بين الآبار في قائمة الانتظار.
    ملاحظة: سيتم إنشاء ملف .csv مع معلمات APD المقاسة لكل الموجي. يتم أيضاً حفظ ملف .mat لكل ملف .h5 للسماح بمعالجة إضافية للبيانات المجزأة.

Representative Results

إن قدرة وكثافة الطلاء في نظام hiPSC-CMs بعد ذوبانه أمر بالغ الأهمية لثقافة الشرق الأوسط وبيئة الشرق الأوسط والزراعة متعددة الآبار. الطلاء المسبق من 1-2 مليون hiPSC-CMs/ قارورة في بئرين من لوحة زراعة الأنسجة 6 جيدا مع 50٪ أو أكثر من البقاء سوف تنتج ثقافة طبقة واحدة صحية مع الضرب التلقائي في 48 ح. سوء صلاحية CMs سيؤدي إلى الثقافات مع نسبة عالية من السكان غير الخلية. هذه الطبقات الأحادية عندما ينفصل لطلاء MEA multiwell عموما إنتاج نتائج غير متناسقة وإشارات نوعية سيئة، وبالتالي ينبغي التخلص منها. ويبين الشكل 1 أمثلة على الثقافات المثلى مقابل الثقافات غير المثلى في مجال الطلاء بمرحلة ما بعد الـ 48 ساعة. ذوبان CMs على لوحات ثقافة الأنسجة المغلفة الركيزة بدلا من مباشرة على الوسائط البحريةالمتعددة، ويسمح لاستعادة الخلايا والنضج 3. لا ينصح بالطلاء المباشر للأجهزة المدمجة المحفوظة بالتبريد على الصفيف لأنها أسفرت عن نتائج غير متناسقة.

بالإضافة إلى نوعية CMs منفصلة، مرفق الخلية على MEA multiwell يعتمد إلى حد كبير على كثافة الخلايا وتقنية طلاء الفيبرونكتين. حجم قطرات فيبرونيكتين أمر بالغ الأهمية كما أن CMs سوف تتوافق مع حدود المنطقة المغلفة فيبرونيكتين. لهذا السبب، يتم الاستغناء عن 5 ميكرولتر فقط من محلول الفيبرونكتين مباشرة على منطقة صفيف القطب الكهربائي. لضمان عدم تفريق القطرة، يجب أن يكون سطح البئر جافًا تمامًا في وقت الطلاء. يظهر الشكل 2 تخطيط لوحة الشرق الأوسط والمياه متعددة الآبار مع مخططات المعالجة المسبقة خطوة بخطوة للإعداد الأمثل. بالإضافة إلى ذلك، لمنع الفيبرونكتين من تجفيف لوحات الشرق الأوسط والمياه متعددة يجب أن توضع داخل غرفة ترطيب خلال فترة الحضانة تستمر لا تزيد عن 3 ح (انظر الخطوة 3.8). بمجرد اكتمال فترة الحضانة، من المهم إزالة قطرات الفيبرونكتين من كل بئر قبل الطلاء CM وبعد ذلك فقط المضي قدما إلى الطلاء جيدا المقبل. العمل بسرعة وبعناية الاستغناء عن CMs هو المفتاح لارتباط الخلية الناجحة.

يتم فصل الثقافات hiPSC-CM في 30 يوما بعد التمايز لطلاء MEA multiwell باستخدام طريقة تفكك الخلايا الأنزيمية (انظر الخطوة 4). سوف ترفق CMs إلى الأسطح الماالشرقى المغلفة فيبرونيكتين بنسبة 3 ح وطبقة أحاديةتغطي صفائف سوف تكون مرئية بعد 24 ساعة بعد الطلاء (الشكل 3). سيتم ملاحظة الضرب المتزامن للطبقة الأحادية في 24-48 h. سوف يؤثر تشتت قطرات الخلية على كثافة الثقافة أو حتى يؤدي إلى التجفيف وموت الخلايا. وضع الخلية دقيقة مباشرة على مجموعة من الأهمية القصوى، وبالتالي يجب أن تمارس هذه التقنية لطلاء الأمثل. التصاق الخلية إلى القطب المرجعي سوف تعوق إنتاج إشارة كهربائية. راجع الشكل 3 للاطلاع على صور موضع CM الأمثل، والثقافة بعد 24 ساعة.

تخضع CMs المستزرعة على الشركات الصغيرة والمتوسطة متعددة الآبار لفحص الجودة للنشاط الكهربائي في 48 ساعة بعد الطلاء. عادة، يزيد سعة إشارة FP من نطاق ميكروفولت إلى mV في حوالي 4 أيام3. إذا كان 50٪ من الأقطاب الكهربائية داخل شبكة و 70٪ من إجمالي الشبكات لا تنتج إشارات FP، ثم الشبكة أو الثقافة هي دون الأمثل وينبغي تجاهلها. تتم معالجة الثقافات التي تمر بفحص الجودة فقط لتحليل FP وAP. ويبين الشكل 6 أمثلة على إشارات تنظيم الأسرة الجيدة وغير المستوفية للمعايير.

يمكن الحصول على تسجيلات AP بوساطة الكهرباء عدة مرات من الثقافات 48 ح بعد الشرق الأوسط والمساواة بين الوكالات. باستخدام الكهربائي، حصلنا على الوصول داخل الخلايا إلى APs عالية الدقة قياسية من شبكات متعددة مشتقة من خلايا القلب hiPSC. تم تسليم نبضات الجهد المنخفض (1 V، 1 مللي ثانية، 1 هرتز) لمدة 30 ثانية لتحويل عابر وقابل للعكس من FP إلى AP. يسمح الكهربة بالوصول الناجح داخل الخلايا لقياس AP في حوالي 75% من الأقطاب الكهربائية. يتم تسجيل الإشارات الكهربائية لمدة 2 دقيقة التي تشمل 30 s قبل الكهربائي، 30 s خلال و 1 دقيقة بعد الكهربائي. يتم تقييم قطار من 10 s AP waveforms 10 ثانية بعد الكهربائي في جميع المواقع لجودة الإشارة وتحليلها. يتم تجاهل أي أثر لا يتوافق مع إشارة AP النقية. للتحقيق في ما إذا كانت السعة AP ترتبط إشارة FP نحن الكهربائي جميع المواقع 288 لتسجيل الموجي في وقت واحد. وترد إشارات FP وAP التمثيلية المسجلة من نفس موقع الخلية من قطبين مختلفين في الشكل 11A. لاحظنا أي ارتباط بين السعة FP والسعة AP ما بعد electroporation سجلت من نفس موقع الخلية. بالإضافة إلى ذلك، لم يكن للعمليات الكهربائية المتعددة لموقع الخلية نفسه في 0 و24 و48 و72 و96 ساعة أي تأثير كبير على شكل AP مع مرور الوقت (الشكل11B).

وبالنظر إلى طبيعة النظام العالية الإنتاجية، فإن التقنية اليدوية لاستخراج البارامترات ذات الأهمية وقياسها كمياً مثل الفاصل الزمني للRR، والتردد الفوري، والمدة المحتملة للإجراء التفاضلي، غير فعالة وتستغرق وقتاً طويلاً. يتم استخدام سيناريو MATLAB مصمم خصيصًا متاح لمجتمع الأبحاث عند الطلب لإجراء قياسات الموجي بدقة 1 ميكروثانية. يتم وضع نقاط زمنية الكهربائي مع الإشارة المستخرجة لتحديد 10 ق من AP بعد الكهربائي لإجراء استخراج إشارة،وضمان الجودة، وسير العمل التجزئة (الشكل 8، الشكل9، الشكل 10).واجهة المستخدم يسمح لاختيار الجزء المطلوب باستخدام مؤشرات الكهربائي الإفراط كدليل. تتم معالجة الموجي المجزأ بواسطة الإجراءات الفرعية لمزيد من التعرف على الأشكال الموجية AP الفردية. ويتم ذلك من خلال الكشف عن الذروة، حيث يتم تحديد أعلى وأدنى الجهد لكل دورة. بمجرد اكتمال هذه العملية، يتم تطبيع السعة، ويتم إزاحة متجهات الوقت المرتبطة لتعريف صفر الوقت عند قيمة الذروة 1. واستُخدم استيفاء نقاط التقاطع على طول الدورات الفردية لتحديد قياسات الـ APD. وبالتالي، يسمح سير العمل الجزئي الجزئي لتجزئة شكل موجة AP بتحليل البيانات بكفاءة لمختلف معلمات APD عبر دفعات متعددة من الثقافات في فترة قصيرة من الزمن. ويجري حالياً المزيد من التشغيل الآلي لمعايير الإدماج والاستبعاد للملوثات المضادة للوظائف والبيانات الكلى من أجل تحليل البيانات في الوقت الحقيقي.

ميزة كبيرة من لوحة الشرق الأوسط والشرق الأوسط والأوسط المتعدد هو أنه يمكن إعادة استخدامها عدة مرات. وتتيح هذه الاستعادة إجراء دراسات كهربائية فسيولوجية متكررة لجمع البيانات على نحو فعال من حيث التكلفة ومتسق. تظهر تسجيلات APs من نفس الصفيف بعد 6 عمليات استعادة في الشكل 12. نسبة الإشارة إلى الضوضاء متشابهة عبر عمليات إعادة الاستخدام المتعددة. ولإثبات موثوقية الصفيف للدراسات الكهرولوجية المتكررة، يتم تجميع ما مجموعه 3815 من الأشكال الموجية لـ AP من ثلاث دفعات استعادة ويتم استخراج بيانات مدة AP لدراسة قابلية تكرار النتائج. يتم عرض قطع توزيع لشكل موجة فرديAPD30، APD80، التثليث (APD80- APD30) وتقصير الكسر ((APD80- APD 30)/(APD80)) (الشكل 13).

Figure 1
الشكل 1: الطلاء المسبق لـ hiPSC-CM المحفوظ ة بالتبريد من أجل النضج. (أ) معالجة الخلايا لطلاء ما قبل 1 قارورة من 10 أيام بعد التمايز بالتبريد حفظها hiPSC-CMs. (B) صور تباين المرحلة من الثقافات hiPSC ناجحة (يسار) وغير ناجحة (يمين). شريط مقياس: 275 درجة مئوية. راجع الفيديو 1 والفيديو 2 للحصول على أمثلة ثقافية ناجحة لمدة 14 و24 يومًا بعد التمايز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إعداد وتحضير لوحة Multiwell MEA. (أ) مخططات لوحة Multiwell MEA: يتكون اللوحة من 24 بئرًا (من A1 إلى D6) تحتوي كل منها على 12 صفائف أقطاب كهربائية دقيقة و4 أقطاب مرجعية محيطية. قطر القطب الكهربائي: 30 درجة مئوية / بين القطب المسافة: 300 درجة مئوية. (ب) التعقيم والعلاج المائي الخطوات التي يتعين إجراؤها قبل الطلاء hiPSC-CM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: فصال هPSC-CM والطلاء على لوحة MeA Multiwell. (أ) مخططات من خطوات الطلاء hiPSC-CM الشرق الأوسط والأوسط والأوسط لكل بئر. (ب) صورة مجهرية توضح موضع قطرات الخلية الصحيح الذي يغطي جميع الأقطاب الكهربائية الـ 12 دون أن ينتشر إلى الأقطاب المرجعية الأربعة. (C) مرحلة تباين الصور المجهرية من مثالية (يسار) ودون الأمثل (يمين) hiPSC-CM البلات على الشرق الأوسط والإدارة في 24 ساعة بعد الطلاء. شريط مقياس = 275 ميكرومتر. راجع الفيديو 3 للحصول على مثال طلاء MEA ناجح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: برنامج اقتناء شاشة متعددة الآبار. تشير الأسهم إلى موقع الميزات والوظائف الرئيسية المشار إليها في النص: تسمح لوحة التحكم في درجة الحرارة (1) بمراقبة درجة الحرارة في الوقت الحقيقي طوال التجربة. إدراج / إخراج (2) زر الانخراط والإفراج عن لوحة MEA Multiwell. تعريف وظيفة التدفق التجريبي (3) يسمح للمستخدم بتعيين مدة التسجيل. تسمح وظيفة إعداد الحصول على البيانات (4) للمستخدم بتعيين معدل أخذ العينات وإعدادات عامل تصفية الاكتساب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مرحبا ً الكهرباء واكتساب الإشارات . تسمح علامة التبويب تعريف التحفيز للمستخدم بتحديد معلمات نبض الكهربائي. تسمح علامة التبويب أقطاب التحفيز للمستخدم بتحديد أقطاب الكهربائي. يمكن اختيار أي مزيج من الأقطاب الكهربائية 288. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التحقق من جودة المجالات الحياتية المتعددة الجوانب بالنسبة للنشاط الكهربائي. Multiwell- برنامج الحصول علىالشاشة التي تظهر نوافذ البيانات الخام مع أمثلة تمثيلية من الأمثل (أ) ودون مستوى (B) إشارات FP. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: إشارات FP وAP من الصفيف الجديد والمستعاد. خطوات التنظيف الأنزيميفي Multiwell MEA (A). تظهر إشارة خط الأساس للصفيف الجديد الحدالأدنى من الإشارة إلى نسبة الضوضاء (B) وإشارات FP تظهر النشاط الكهربائي للشبكة (C). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: تجزئة البيانات وتحليلها. عرض النافذة الرئيسية لواجهة المستخدم الرسومية لتحليل الموجي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: تجزئة البيانات وتحليلها. قم بتهيئة الزر Waveforms لتحديد واستخراج أشكال الموجات AP للتجزئة وبدء المعالجة الأولية عن طريق التكبير وتحديد منطقة الاهتمام المحتملة للإجراء. الدوائر الحمراء هي مؤشرات الكهربائي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10: تجزئة البيانات وتحليلها. يتم الكشف عن القمم (الأحمر 'x') وأحواض (الدوائر الصفراء) لكل الموجي ويتم فرض APs تطبيع لفحص جودة الموجي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 11
الشكل 11: اعتماد AP السعة على إشارة FP لتسجيلات متعددة من نفس موقع الخلية. السعة FP في نطاقاتμV (A، أعلى لوحة اليسار) أو نطاقات mV (A، أعلى لوحة اليمين) المسجلة من اثنين من الأقطاب الكهربائية المستقلة تنتج السعة AP في نطاق mV (A، أسفل اليسار واليسار لوحات) تظهر أي ارتباط بين السعة FP و ما بعد الكهرباء AP السعة. يتم فرض أشكال موجة AP الطبيعية لكل تسجيل كما هو موضح لكل تسجيل. أنتجت الموجات الكهربائية متعددة من نفس موقع الخلية في 0 إلى 96 ح عاليةالجودة AP يسمح تتبع الديناميكا الكهربائية غشاء (B). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 12
الشكل 12: تسجيلات AP بعد ست عمليات ترميم. يتم عرض أشكال الموجة AP المسجلة في وقت واحد 10 ثانية بعد الكهربائي عبر 12 أقطاب من نفس البئر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 13
الشكل 13: مخططات معلمة APD من عمليات ترميم متعددة. توزيع قطع الأراضي لشكل موجةالفردية APD30 (A)، APD80 (B)، التثليث (APD80-APD30)(C) وتقصير كسور ((APD80-APD30)/(APD80)) يتمعرض (D). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملفات تكميلية. أشرطة الفيديو 1-3. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

على مر السنين، تم تحديد تطبيق الجوانب الحياتية البحرية المحدودة على إجراء قياسات FP للخلايا المنفعلة لدراسة خصائصها الكهرولوجية36،37،38،39. وقد ذكرت مجموعات قليلة فقط آثار AP من الخلايا الكهربائية باستخدام التكنولوجيا المخصصة MEA القائم18،29،30. غير أن هذه النهج لم يتم التحقيق فيها فيما يُجرى تسجيلها المتكرر من نفس الأعمال التحضيرية. قمنا بتطوير منهجية مبتكرة ودقيقة لدراسة برامج العمل من نفس موقع الخليةعلى مدى أيام في شبكات hiPSC-CM متعددة في وقت واحد 3. في دراستنا المنشورة، تم استخدام منصة MEA متعددة الآبار الصغيرة من الذهب الصغير لتوليد مكتبات شكل موجي AP من دفعات متعددة من الثقافات hiPSC-CM بدقة عالية وبدقة زمنية تبلغ 1 μs. يشرح البروتوكول الموضح هنا البذر من hiPSC-CMs على مجموعة من أجل التطوير الفعال لشبكات CM المتزامنة لتسجيلات AP عالية الإنتاجية. العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي: 1) إنتاج دفعات متعددة عالية النقاء من أجهزة الصراف الآلي التي تسيطر عليها الجودة للخدمات المصرفية للحفظ بالتبريد، 2) أجهزة التخزين CMs ما بعد الذوبان قابلة للحياة للغاية لطلاء ما قبل والنضج، 3) علاج لوحة الشرق الأوسط والمياه متعددة الآبار لCM البذر، 4) التفكك الثقافي hiPSC-CM في 30 يوما بعد التمايز لطلاء الشرق الأوسط والإدارة، و 5) استعادة القطاعات البحرية المتعددة الأطراف لإعادة استخدام متعددة.

من المهم ملاحظة أن التباين من دفعة إلى دفعة في تمييز hiPSC قد يؤثر على النتائج التجريبية. تم تحسين طريقة أحادية الطبقة من التمايز في المنزل لإنتاج خلايا القلب عالية في المئة3،40. تحليل FACS من MLC2V وعلامات TNNT2 من ثقافاتنا تظهر ≥ 90٪ البطيني مثل النمط الظاهري3. يتم حفظ هذه الثقافات التي تسيطر عليها الجودة بالتبريد للدراسات التجريبية. نهج التمايز الحالي تسفر عن مزيج غير متجانس من الخلايا العقدية والأذينية والبطينية3و16و17و41. ولذلك، فإن الاستراتيجيات المستخدمة لإثراء السكان من النوع الفرعي CM يمكن أن تزيد من تحسين خصوصية الثقافات. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام نُهج هندسة الأنسجة لتعزيز نضجها. ويمكن بسهولة تنفيذ الأساليب المقترحة هنا لمصادر CM الأخرى.

وكانت الموجات AP المسجلة باستخدام الشرق الأوسط والأوسط وذلك من خلال تسجيل من شبكات خلايا القلب عن طريق رسم الخرائط البصرية42،43، وأكسيد المعادن التكميلية المستندة إلى أشباه الموصلات MEA18،21، ومحاكاة AP باستخدام تسجيلات FP20. لمعالجة آلية قياسات AP عن طريق الشرق الأوسط والأوسط وذلك في جميع المجالات أظهرت أن واجهة الكهربائي الكهربائي تحاكي تقنية الأقطاب الدقيقة الزجاجية الحادة الراسخة. ومع ذلك، لا يمكن تحديد إمكانات غشاء يستريح وقيم السعة الحقيقية في دراستنا بالنظر إلى أن واجهة الكهربائي الكهربائي في أنظمة الشرق الأوسط والأوسط ومنطقة الشرق الأوسط والأوسط ومنطقة الشرق الأوسط والأوسط ومنطقة الشرق الأوسط والأوسط ومنطقة البحر تقنيه. نهجنا يشارك قيود مماثلة لرسم الخرائط البصرية عندما يتعلق الأمر سعة AP.

وقد فتحت التلاوة المتعددة الوسائط المتعددة القائمة على نظام الأغذية الأوسط ومنطقة الشرق الأوسط والأوسط للأدوية المفتوحة هنا إمكانيات جديدة لتقييم سلامة المخدرات. على الرغم من عفوية، هذه الطبقات الأحادية hiPSC-CM فاز بمعدلات ثابتة. تحليل معلمات APD عبر شبكات متعددة توفر نظرة ثاقبة على عدم التجانس الكهربائية (الشكل13). ومع ذلك، يجب أن تتضمن التحليلات الشاملة لرد الممتلكات APD الفترات الانبساطيالسابقة. وعلاوة على ذلك، فإن الطول الموجي عالي الجودة AP المسجل من نفس موقع الخلية أكثر من 96 ساعة (الشكل11B)هو أول تقرير لتتبع الديناميكا الكهربائية الغشاء مع مرور الوقت والتي ستكون ذات قيمة في التنمية وفي المرض.

ويمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا لتحديد بارامترات AP كمياً لتوليد منحنيات الاستجابة للجرعة لاختبار المركبات. وكما ذكر مؤخراإدواردز وآخرون3، يتم رسم استجابة جرعة من إفراز، isoproterenol و E 4031 لAPD في مراحل إعادة الاستقطاب المختلفة. وأظهرت الدراسة المنشورة دقة وموثوقية النهج لتحديد التغيرات الدقيقة المعتمدة على الجرعة في أشكال الموجات AP في الوقت الحقيقي. ويمكن بسهولة توسيع هذه التقنية للمركبات الأخرى أو مكتبات الجزيئات الصغيرة لفهم مختلف الاستجابات الكهرولوجية.

النهج القائم على الشرق الأوسط وة الشرق الأوسط والأوسط لقياسات AP المعروضة في هذه الدراسة سيكون من مصلحة ليس فقط لعلماء الفيزيولوجيا الكهربائية ولكن أيضا لعلماء الأحياء الخلية والنماذج في سيليكو. وعلاوة على ذلك، فإن تسجيلات FP/AP من نفس موقع الخلية على hiPSC-CMs ستمكن الباحثين من إنشاء مكتبات بيانات كهربائية حيوية من مجموعة واسعة من الشبكات الخلوية المنفعلة في غضون فترة قصيرة من الزمن. وسيكون توافر هذه الموارد ذا قيمة بالنسبة لاكتشافات الأدوية ونمذجة الأمراض.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

اي

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase Sigma Aldrich A6964-100ML cell dissociation solution
Acquisition software Multichannel Systems Multiwell-Screen v 1.9.2.0
B27 Supplement ThermoFisher 17504-044 CM media supplement
Converter software Multichannel Systems MultiChannel DataManager
DMEM/F12 ThermoFisher 11330-032
D-PBS ThermoFisher 14190-250
FBS Fisher Scientific SH3007103HI
Fibronectin Sigma Aldrich F1141-5MG
Geltrex ThermoFisher A1413202 coating substrate
Interface board Multichannel Systems MCS-IFB 3.0 Multiboot Interface Board
Multiwell MEA Plate Multichannel Systems 24W300/30G-288
RPMI 1640 ThermoFisher 11875-093 CM base medium
Terg-a-zyme Sigma Aldrich Z273287-1EA enzymatic detergent
Transfer pipettes, individually wrapped Fisher Scientific 1371148
Trypan Blue Sigma Aldrich T8154-100ML
Ultrapure sterile water ThermoFisher 10977-023
6-well tissue-culture treated plates Fisher Scientific 08-772-1B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dambrot, C., Passier, R., Atsma, D., Mummery, C. L. Cardiomyocyte differentiation of pluripotent stem cells and their use as cardiac disease models. Biochemical Journal. 434 (1), 25-35 (2011).
  2. Dunn, K. K., Palecek, S. P. Engineering Scalable Manufacturing of High-Quality Stem Cell-Derived Cardiomyocytes for Cardiac Tissue Repair. Frontiers in medicine. 5, (2018).
  3. Edwards, S. L., et al. A Multiwell Cardiac muGMEA Platform for Action Potential Recordings from Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
  4. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
  5. Huebsch, N., et al. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Scientific Reports. 6, 24726 (2016).
  6. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  7. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
  8. Sharma, A., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess drug cardiotoxicity. Nature Protocols. , (2018).
  9. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
  10. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  11. Burridge, P. W., Holmstrom, A., Wu, J. C. Chemically Defined Culture and Cardiomyocyte Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Human Genetics. 87, (2015).
  12. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  13. Burridge, P. W., Zambidis, E. T. Highly efficient directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes. Methods in Molecular Biology. , 149-161 (2013).
  14. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
  15. Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
  16. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), (2014).
  17. Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
  18. Jans, D., et al. Action potential-based MEA platform for in vitro screening of drug-induced cardiotoxicity using human iPSCs and rat neonatal myocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 87, 48-52 (2017).
  19. Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical Trials in a Dish. Trends in Pharmacological Science. 38 (1), 4-7 (2017).
  20. Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (4), 1135-1141 (2018).
  21. Braeken, D., et al. Open-cell recording of action potentials using active electrode arrays. Lab Chip. 12 (21), 4397-4402 (2012).
  22. Otsuji, T. G., et al. Progressive maturation in contracting cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: Qualitative effects on electrophysiological responses to drugs. Stem Cell Research. 4 (3), 201-213 (2010).
  23. Shinozawa, T., Imahashi, K., Sawada, H., Furukawa, H., Takami, K. Determination of appropriate stage of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug screening and pharmacological evaluation in vitro. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1192-1203 (2012).
  24. Raphel, F., et al. Identification of Ion Currents Components Generating Field Potential Recorded in MEA From hiPSC-CM. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 65 (6), 1311-1319 (2018).
  25. Hai, A., Spira, M. E. On-chip electroporation, membrane repair dynamics and transient in-cell recordings by arrays of gold mushroom-shaped microelectrodes. Lab Chip. 12 (16), 2865-2873 (2012).
  26. Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
  27. Cohen, A., Shappir, J., Yitzchaik, S., Spira, M. E. Reversible transition of extracellular field potential recordings to intracellular recordings of action potentials generated by neurons grown on transistors. Biosensors and Bioelectronics. 23 (6), 811-819 (2008).
  28. Ojovan, S. M., et al. A feasibility study of multi-site,intracellular recordings from mammalian neurons by extracellular gold mushroom-shaped microelectrodes. Scientific Reports. 5, 14100 (2015).
  29. Shmoel, N., et al. Multisite electrophysiological recordings by self-assembled loose-patch-like junctions between cultured hippocampal neurons and mushroom-shaped microelectrodes. Scientific Reports. 6, 27110 (2016).
  30. Lin, Z. C., Xie, C., Osakada, Y., Cui, Y., Cui, B. Iridium oxide nanotube electrodes for sensitive and prolonged intracellular measurement of action potentials. Nature Communications. 5, 3206 (2014).
  31. Stett, A., Burkhardt, C., Weber, U., van Stiphout, P., Knott, T. CYTOCENTERING: a novel technique enabling automated cell-by-cell patch clamping with the CYTOPATCH chip. Receptors Channels. 9 (1), 59-66 (2003).
  32. Kanda, Y., Yamazaki, D., Osada, T., Yoshinaga, T., Sawada, K. Development of torsadogenic risk assessment using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Japan iPS Cardiac Safety Assessment (JiCSA) update. Journal of Pharmacological Sciences. 138 (4), 233-239 (2018).
  33. Yang, X., Papoian, T. Moving beyond the comprehensive in vitro proarrhythmia assay: Use of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess contractile effects associated with drug-induced structural cardiotoxicity. Journal of Applied Toxicology. 38 (9), 1166-1176 (2018).
  34. Sala, L., Bellin, M., Mummery, C. L. Integrating cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in safety pharmacology: has the time come. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3749-3765 (2017).
  35. Zlochiver, V., Edwards, S., Joshi-Mukherjee, R. Longitudinal Cardiotoxic Effect of Doxorubicin in a Multicellular Cardiac Model. Biophysical Journal. 116 (3), (2019).
  36. Del Alamo, J. C., et al. High throughput physiological screening of iPSC-derived cardiomyocytes for drug development. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1717-1727 (2016).
  37. Clements, M. Multielectrode Array (MEA) Assay for Profiling Electrophysiological Drug Effects in Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Current Protocols in Toxicology. 68, 21-22 (2016).
  38. Navarrete, E. G., et al. Screening drug-induced arrhythmia [corrected] using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and low-impedance microelectrode arrays. Circulation. 128 (11 Suppl 1), S3-S13 (2013).
  39. Harris, K., et al. Comparison of electrophysiological data from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to functional preclinical safety assays. Toxicological Sciences. 134 (2), 412-426 (2013).
  40. Zlochiver, V., Edwards, S. L., Joshi-Mukherjee, R. Longitudinal Cardiotoxic Effect of Doxorubicin in a Multicellular Cardiac Model. Biophysical Journal. 116 (3), (2019).
  41. Waas, M., et al. Are These Cardiomyocytes? Protocol Development Reveals Impact of Sample Preparation on the Accuracy of Identifying Cardiomyocytes by Flow Cytometry. Stem Cell Reports. , (2019).
  42. Gorospe, G., et al. Automated grouping of action potentials of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 61 (9), 2389-2395 (2014).
  43. Zhu, W., Varga, Z., Silva, J. R. Molecular motions that shape the cardiac action potential: Insights from voltage clamp fluorometry. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 120 (1-3), 3-17 (2016).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 149، خلايا القلب المشتقة من iPSC، صفيف متعدد الأقطاب الكهربائية، إمكانات العمل، الإمكانات الميدانية، الفيزيولوجيا الكهربائية القلبية، الكهربائي، فحص الأدوية
شبكات خلايا القلب المستمدة من iPSC البشرية على صفائف متعدد الأقطاب الكهربائية الصغيرة للتسجيلات المحتملة للعمل المتكرر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zlochiver, V., Kroboth, S. L., Beal, … More

Zlochiver, V., Kroboth, S. L., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings. J. Vis. Exp. (149), e59906, doi:10.3791/59906 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter