Summary
تمثل هذه المقالة الاختبار المفيد في المختبر لتقييم قدرة المتوسطة المشروطة من الخلايا السرطانية لجذب الضامة.
Abstract
تمثل الضامة المرتبطة بالورم (TAMs) نسبة كبيرة من الخلايا في كتلة الورم لأنواع مختلفة من السرطانات. الورم الأرومي الدبقي (GBM)، ورم خبيث في الدماغ مع عدم وجود علاج، لديه ما يصل إلى نصف TAMs كتلة الورم. يمكن أن تكون TAMs موالية للورم أو مضادة للورم، اعتماداً على تنشيط جينات محددة في الخلايا. الطفرات الوراثية في الأورام، من خلال تنظيم التعبير السيتوكين، يمكن أن تؤثر على توظيف TAMs إلى البيئة الدقيقة الورم. هنا، ونحن نصف دراسة كمية على أساس الخلية لتقييم توظيف الضامة من قبل وسيلة مكيفة من الخلايا السرطانية. يستخدم هذا التقييم خط الخلايا الضامة البشرية MV-4-11 لدراسة جاذبية الضامة بواسطة الوسيط المشروط من الورم الأرومي الدبقي، مما يسمح باستنساخ عالية وتقلب منخفض. البيانات التي تم إنشاؤها مع هذا الفحص يمكن أن تسهم في فهم أفضل للتفاعل بين الورم والبيئة الدقيقة الورم. ويمكن استخدام فحص مماثل لتقييم التفاعل بين الخلايا السرطانية والخلايا المناعية الأخرى، بما في ذلك الخلايا T والخلايا القاتلة الطبيعية (NK).
Introduction
الضامة هي خلايا مناعية مع الفينوتيبيك عالية وغير متجانسة وظيفية1. أنها تلعب أدوارا هامة في أنظمة الدفاع المضيف, إصلاح الأنسجة, التنمية وتطور الورم1. TAMs هي الضامة في البيئة الدقيقة للأورام الصلبة. يمكن لبعض TAMs تعزيز نمو الورم من خلال تثبيط T الخلية بوساطة النشاط السامة للخلايا، تحوير البيئة الدقيقة الورم (TME)، وتعزيز تكوين الأوعية الدموية، والغزو والانبثاث2،3،4، 5.TAMs هي من بين أنواع الخلايا الأكثر وفرة في TME وعدد أكبر من TAMs يرتبط عموما مع أسوأ بقاء المريض في العديد من أنواع الأورام الصلبة6. التواقيع الوراثية المتميزة للخلايا السرطانية تؤثر على قدرتها على تجنيد الضامة. في GBM، ورم الدماغ العدوانية مع عدم وجود علاج، الضامة يمكن أن تمثل ما يصل إلى نصف كتلة الورم7. التضخيم المشترك لمستقبلات عامل نمو البشرة(EGFR)وكهربة متحولة EGFRvIII كثيرا ما لوحظ في GBM، الذي يمنح مزايا نمو الورم8. الخلايا المشتركة التعبير EGFR وEGFRvIII جذب المزيد من الضامة مقارنة مع الخلايا التي تعبر عن EGFR أو EGFRvIII singly7.
Chemokines هي عائلة من السيتوكينات الصغيرة التي تلعب أدوارا هامة في تنظيم تكوين المناعة في TME6،9. الخلايا البشرية تعبر عن أكثر من 50 السيتوكينات10. ويتحقق التسلل المناعي في الأورام إلى حد كبير عن طريق التفاعل بين السيتوكينات ومستقبلات السيتوكين11. كل نوع من الخلايا المناعية يعبر عن مستقبلات chemokine متميزة / chemokines ويمكن تجنيدها من قبل الخلايا التي تفرز مستقبلات chemokines محددة / chemokine12. الخلايا السرطانية يمكن أن تزيد من التعبير عن بعض chemokines لتجنيد الخلايا المناعية مثل TAMs، والخلايا T التنظيمية والخلايا المثبطة المشتقة من اليميلويد (MDSCs)6. الحصار من chemokine محددة تفرزها الأورام يمكن أن يكون وسيلة واعدة في تثبيط تسلل الخلايا المناعية إلى كتلة الورم.
هنا، ونحن نصف بروتوكول يسمح في المختبر تقييم التفاعل بين الورم والضامة، وذلك باستخدام وسائل الإعلام مشروطة من الخلايا السرطانية التي تحتوي على chemokines وخطوط الخلايا الضامة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد متوسط
-
إعداد مصل خالية من الخلايا الجذعية المتوسطة
- ذوبان الملحق B27 50X, عامل نمو البشرة (EGF, 20 ميكروغرام /مل في حمض الخليك 10 مل مع 0.1% BSA), وعامل نمو الخلايا الليفية (FGF, 20 ميكروغرام/مل في حمض الخليك 10 مل مع 0.1% BSA).
- إضافة 500 ميكرولتر من EGF (التركيز النهائي 20 نانوغرام/مل)، 500 ميكرولتر من FGF (التركيز النهائي 20 نانوغرام/مل)، 10 مل من 50x B27 إلى 500 مل من خليط دولبكو المعدل النسر المتوسط/المغذي F-12 (DMEM/F12) و 5 مل من 100 x البنسلين/العقدية (القلم/العقدية). عكس زجاجة 4-6 مرات لخلط، تصفية تعقيم من خلال 500 مل 0.1 ميكروغرام كأس الترشيح. وضع علامة على الزجاجة وتخزينها في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: المتوسطة جيدة للاستخدام لمدة تصل إلى شهر في 4 درجة مئوية.
- إعداد MV-4-11 وسط الثقافة: إضافة 50 مل من المصل البقري الجنيني (FBS) إلى 500 مل من وسيط دولبكو المعدلة في إيزكوف (IMDM). عكس زجاجة 4-6 مرات لخلط، تصفية تعقيم من خلال 500 مل 0.1 ميكروغرام كأس الترشيح. وضع علامة على الزجاجة وتخزينها في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: المتوسطة جيدة للاستخدام لمدة تصل إلى شهر في 4 درجة مئوية. - إعداد وسيلة صيانة الخلايا السرطانية: إضافة 50 مل من FBS إلى 500 مل من دولبكو تعديل النسر المتوسط (DMEM). عكس زجاجة 4-6 مرات لخلط، تصفية تعقيم من خلال 500 مل 0.1 ميكروغرام كأس الترشيح. وضع علامة على الزجاجة وتخزينها في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: المتوسطة جيدة للاستخدام لمدة تصل إلى شهر في 4 درجة مئوية.
2. إعداد الخلايا
اليوم الأول:
- ذوبان الخلايا السرطانية
- احماء وسيلة صيانة الخلايا السرطانية (كما هو موضح في الخطوة 1.3) عند حمام مائي بزاوية 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- خذ الخلايا المجمدة U87، U87: EGFR، U87: EGFRvIII و U87: EGFR + EGFRvIII الخلايا من خزان النيتروجين السائل. إذابة الخلايا في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
تحذير: كن حذرا عند أخذ الخلايا من خزان النيتروجين السائل. ارتداء قفازات مع الحماية الحرارية ونظارات السلامة حسب الحاجة. - رش سطح غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة مع الإيثانول 70٪ ومسح 70٪ الإيثانول على السطح مع المناشف الورقية.
- رش قارورة المبردة التي تحتوي على الخلايا وزجاجة متوسطة مع الإيثانول 70٪، ومسح الإيثانول 70٪ على السطح مع المناشف الورقية، وجلبها إلى غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة.
- ماصة 5 مل من وسيلة صيانة الخلايا السرطانية في أنبوب الطرد المركزي المعقم 15 مل. عكس الأنبوب الذي يحتوي على خلايا الورم 4-6 مرات للخلط. ماصة جميع الخلايا في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. عكس أنبوب الطرد المركزي 4-6 مرات لخلط.
- طرد مركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. يستنشق الخارق.
- غسل الخلايا مع 10 مل من الفوسفات المخزنة المالحة المخزنة (PBS). طرد مركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. يستنشق الخارق.
- إعادة تعليق الخلايا في 12 مل من وسيط صيانة الخلايا السرطانية (كما هو موضح في الخطوة 1.3). ماصة صعودا وهبوطا 3-5 مرات لخلط. نقل الخلايا إلى قارورة ثقافة الخلية T75.
- تنمو الخلايا في حاضنة 37 درجةمئوية مع 5٪ CO 2. وضع صيانة الخلايا السرطانية المتوسطة مرة أخرى إلى الثلاجة 4 درجة مئوية.
اليوم الثاني:
- تحقق من الخلايا تحت المجهر. تغيير الوسط إذا لزم الأمر. يجب أن تنمو الخلايا في طبقة أحادية في الثقافة.
اليوم الثالث:
- ذوبان الخلايا MV-4-11
- الاحماء المتوسطة ثقافة MV-4-11 (كما هو موضح في الخطوة 1.2) في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: MV-4-11 يمكن تغييرها إلى الضامة الأولية أو خطوط الخلايا الضامة الأخرى، اعتمادا على الحاجة إلى دراسة محددة. - خذ الخلايا المجمدة MV-4-11 من خزان النيتروجين السائل. إذابة الخلايا في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
تحذير: كن حذرا عند أخذ الخلايا من خزان النيتروجين السائل. ارتداء قفازات مع الحماية الحرارية ونظارات السلامة حسب الحاجة. - رش سطح غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة مع الإيثانول 70٪ ومسح 70٪ الإيثانول على السطح مع المناشف الورقية.
- رش قارورة المبردة التي تحتوي على الخلايا وزجاجة متوسطة مع الإيثانول 70٪، ومسح الإيثانول 70٪ على السطح مع المناشف الورقية، وجلبها إلى غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة.
- ماصة 5 مل من MV-4-11 ثقافة المتوسطة (كما هو موضح في الخطوة 1.2) في أنبوب الطرد المركزي المعقم 15 مل. عكس الأنبوب الذي يحتوي على خلايا الورم 4-6 مرات للخلط. ماصة جميع الخلايا في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. عكس أنبوب الطرد المركزي 4-6 مرات لخلط.
- طرد مركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. يستنشق الخارق.
- غسل الخلايا في 10 مل من PBS والطرد المركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. يستنشق الخارق.
- إعادة تعليق الخلايا في 12 مل من MV-4-11 ثقافة المتوسطة (كما هو موضح في الخطوة 1.2). ماصة بلطف صعودا وهبوطا 3-5 مرات لخلط. نقل الخلايا إلى قارورة ثقافة الخلية T75.
- تنمو الخلايا في حاضنة 37 درجةمئوية مع 5٪ CO 2.
- الاحماء المتوسطة ثقافة MV-4-11 (كما هو موضح في الخطوة 1.2) في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- تقسيم الخلايا السرطانية
- احماء وسط الخلايا الجذعية الخالية من المصل (كما هو موضح في الخطوة 1.1) عند حمام مائي بزاوية 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- رش سطح غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة مع الإيثانول 70٪ ومسح 70٪ الإيثانول على السطح مع المناشف الورقية. خذ حل مفرزة الخلية من الثلاجة. رش زجاجات الحل مفرزة المتوسطة والخلية مع الإيثانول 70٪، ومسح الإيثانول 70٪ على السطح مع المناشف الورقية وجلبها إلى غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة.
ملاحظة: لا تُسخّن قبل التسخين حل مفرزة الخلايا الأيوتازية. - نقل ثقافة الخلايا السرطانية من الحاضنة إلى غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة. يستنشق المتوسط، إضافة 2 مل من حل مفرزة الخلية في قارورة.
ملاحظة: الإنزلاب مع PBS قبل إضافة accutase هو اختياري هنا. - وضع قارورة في غطاء محرك السيارة. تحقق مما إذا كانت الخلايا السرطانية تُجمع كل دقيقة. بمجرد أن تُجمع الخلايا السرطانية، انقر برفق على جانب القارورة لمساعدة الخلايا على الانفصال عن القارورة.
- ماصة 8 مل من مصل خالية من الخلايا الجذعية المتوسطة في قارورة، ماصة صعودا وهبوطا 3 مرات لخلط، ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي معقمة 15 مل. طرد مركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. يستنشق الخارق.
- غسل الخلايا في 10 مل من PBS. ماصة صعودا وهبوطا 3-5 مرات لخلط. طرد مركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. يستنشق الخارق.
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية. - إعادة تعليق الخلايا في 10 مل من مصل خالية من الخلايا الجذعية المتوسطة (كما هو موضح في الخطوة 1.1). ماصة صعودا وهبوطا 3-5 مرات لخلط. خذ 10 ميكرولتر من الخلايا واخلطها مع 10 ميكرولتر من حل تريبان الأزرق. ماصة 10 ميكرولتر من الخليط في الشريحة العد، كمية رقم الخلية الحية باستخدام عداد الخلية التلقائي.
- ضبط كثافة الخلية إلى 2.5 × 105 خلايا / مل مع مصل خالية من الخلايا الجذعية المتوسطة (كما هو موضح في الخطوة 1.1)، والبذور 2 مل من الخلايا في كل بئر من لوحة 6-جيدا خلية الثقافة. لكل نوع من الخلايا، البذور 3 الآبار (عينة ثلاثية). في الوقت نفسه، إعداد 6 آبار مع 2 مل من مصل خالية من الخلايا الجذعية المتوسطة فقط (لا خلايا).
ملاحظة: سيتم استخدام هذه العينات: 1) كضوابط سلبية و 2) لضبط حجم متوسط مشروط استناداً إلى أرقام الخلايا. - وضع لوحات 6-جيدا في حاضنة 37 درجةمئوية مع 5٪ CO 2. السماح للخلايا أن تنمو لمدة 24 ساعة.
3. في المختبر الضامة الجذب الاختباري
- إعداد وسائل الإعلام المشروطة
- احماء وسيلة صيانة الخلايا السرطانية (كما هو موضح في الخطوة 1.3) عند حمام مائي بزاوية 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- رش سطح غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة مع الإيثانول 70٪ ومسح 70٪ الإيثانول على السطح مع المناشف الورقية. خذ حل مفرزة الخلية من الثلاجة. رش زجاجات المتوسطة والخلية حل مفرزة مع الإيثانول 70٪، ومسح الإيثانول 70٪ على السطح مع المناشف الورقية وجلبها إلى غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة.
- أخرج الأطباق ذات الـ 6 آبار من الحاضنة ماصة بعناية وسائل الإعلام مكيفة في أنابيب الطرد المركزي المعقمة 15 مل. ضع الأنابيب على الثلج ماصة وسائل الإعلام في "وسائل الإعلام فقط" جيدا في أنبوب منفصل 15 مل جهاز طرد مركزي معقم.
ملاحظة: قبل هذه الخطوة، تأكد من التحقق تحت المجهر لمعرفة ما إذا كانت الخلايا تعلق. إذا لم يكن الأمر كذلك، يمكن للمرء استخدام لوحات مغلفة في الخطوة 2.4.8 للسماح مرفق أفضل أو تضمين الخلايا العائمة في خطوة العد. - إضافة 0.5 مل من حل مفرزة الخلية في كل بئر من لوحة 6-جيدا. تحقق مما إذا كانت الخلايا السرطانية تُجمع كل دقيقة. بمجرد أن تُجمع الخلايا السرطانية، انقر برفق على جانب اللوحة لمساعدة الخلايا على الانفصال.
- ماصة 2.5 مل من وسيلة صيانة الخلايا السرطانية في البئر، ماصة صعودا وهبوطا 3 مرات لخلط ونقل الخلايا في أنبوب الطرد المركزي معقمة 15 مل. خذ 10 ميكرولتر من الخلايا واخلطها مع 10 ميكرولتر من حل تريبان الأزرق. ماصة 10 ميكرولتر من الخليط في الشريحة العد وتحديد عدد الخلايا الحية باستخدام عداد الخلية التلقائي.
- ضبط حجم وسائل الإعلام مكيفة وفقا لرقم الخلية باستخدام مصل الخلية الجذعية الحرة المتوسطة (37 درجة مئوية الحضانة بين عشية وضحاها). على سبيل المثال، إذا كان جيدا A 3x العديد من الخلايا الحية وكذلك مع أقل عدد من الخلايا، تمييع وسائل الإعلام مكيفة 1:3. يتم استخدام هذه الخطوة للتحكم في الفرق الناجم عن معدل انتشار الخلايا.
ملاحظة: السبب في استخدام مصل الخلية الجذعية الحرة المتوسطة مع 37 درجة مئوية الحضانة بين عشية وضحاها هو السيطرة على التغيير المحتمل في وسائل الإعلام مع التعرض لفترات طويلة 37 درجة مئوية. - تصفية الوسائط المكيفة من خلال مرشحات 0.45 ميكرومتر. ضع وسائل الإعلام المكيفة على الجليد.
ملاحظة: هذه الخطوة إزالة الخلايا والحطام الخلية في الوسائط المكيفة.
- إعداد خلايا MV-4-11
- الاحماء المتوسطة IMDM (دون FBS) في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- رش سطح غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة مع الإيثانول 70٪ ومسح 70٪ الإيثانول على السطح مع المناشف الورقية. رش زجاجة متوسطة مع الإيثانول 70٪، ومسح 70٪ الإيثانول على السطح مع المناشف الورقية وجلبها إلى غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة.
- خذ قارورة من الخلايا MV-4-11 في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة. ماصة 10 مل من الخلايا في أنبوب الطرد المركزي المعقم 15 مل. تناول 10 ميكرولتر من الخلايا واخلطها مع 10 ميكرولتر من حل تريبان الأزرق. ماصة 10 ميكرولتر من الخليط في الشريحة العد وتحديد عدد الخلايا الحية باستخدام عداد الخلية التلقائي. طرد مركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 5دقائق في 4 درجة مئوية. يستنشق الخارق.
- غسل الخلايا مع 10 مل من PBS والطرد المركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. يستنشق الخارق.
- إعادة تعليق الخلايا في IMDM المتوسطة (بدون FBS) لكثافة الخلية النهائية من 1x106 خلايا / مل.
ملاحظة: يمكن تعديل عدد خلايا الضامة المستخدمة هنا.
- ترانسويل التقوله
ملاحظة: لهذه الخطوة، استخدم مجموعة اختبار ترحيل الخلايا أو شراء الكواشف وإدراج بشكل منفصل. للخلايا MV-4-11، اختر إدراج Transwell مع حجم المسام 5 ميكرومتر. للكشف عن ترحيل الضامة، قم بالتحديد المباشر لعدد الضامة في الغرفة السفلية أو استخدم أساليب قياس اللون/الفلورمتري. هنا، نقوم بشرح التبيّن باستخدام طريقة قياس اللون.- جلب لوحة 24 جيدا، وإدراج الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 250 درجة مئوية من الخلايا MV-4-11 المعدة أعلاه في كل إدراج.
- إضافة 400 درجة مئوية من المتوسطة / المتوسطة مكيفة فقط (مع الحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وهذه العينات بمثابة السيطرة السلبية) إلى الغرف السفلى من لوحة 24 جيدا. لكل خط ورم أو عنصر تحكم، استخدم عينات ثلاثية. تجنب فقاعات بين إدراج ووسيط مشروط. فقاعات سوف تمنع الضامة من الهجرة إلى الآبار السفلية.
- احتضان لوحات في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 4 ساعة.
ملاحظة: يمكن تعديل وقت الحضانة. يمكن رؤية الخلايا التي تهاجر إلى الغرف السفلية تحت المجهر. - انقر برفق على إدراج على الجدار الداخلي لنفس البئر وتجاهل إدراج. كما MV-4-11 الخلايا تنمو في تعليق, لا حاجة إلى حل مفرزة الخلية أو علاج التربسين هنا.
- ماصة بلطف الخلايا في الآبار صعودا وهبوطا 3 مرات لخلط. نقل 225 درجة مئوية من تعليق الخلية إلى لوحة ذات جدران سوداء 96 جيدا مناسبة لقياس الفلورسنت.
- تمييع صبغة CyQuant 1:75 مع 4X lysis العازلة. دوامة لفترة وجيزة وتدور أسفل الحل. إضافة 75 درجة مئوية من الحل لكل بئر من لوحة 96 جيدا. حضانة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- قراءة الفلورة باستخدام مرشح 480/520 نانومتر مجموعة مع قارئ لوحة الفلورة.
- تحليل البيانات عن طريق طرح فارغة والتطبيع إلى خط خلية الورم التحكم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وعادة ما تظهر النتائج من خلال الرسوم البيانية الشريطية (مثال موضح في الشكل1). تشير العينات ذات القيم العالية 480/520 إلى أن الوسائط المكيفة لديها قدرة عالية على توظيف الضامة. واعتمادا على الحاجة التجريبية، يمكن إدراج ضوابط إضافية. على سبيل المثال، يمكن للمرء استخدام الأجسام المضادة تحييد لعلاج وسائل الإعلام مشروطة لإلغاء chemotaxis الضامة، وأداء نفس الفحص. يمكن للمرء أيضا إضافة chemokines إضافية (أي CCL2) إلى وسائل الإعلام مكيفة، والتي تعمل كسيطرة إيجابية.
الشكل 1: وسائل الإعلام المشروطة من خلايا U87 التي تشترك في التعبير عن EGFR وEGFRvIII تجذب المزيد من الضامة من خلايا U87 التي تعبر عن ناقلات التحكم، أو EGFR/EGFRvIII ingingly. وقد تم تعديل هذا الرقم من An و آخرون7. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، هناك عدة خطوات رئيسية: 1) تحديد إدراج Transwell. لMV-4-11 خط الخلية، 5 ميكرومتر Transwell إدراج العمل بشكل جيد. ومع ذلك، بالنسبة لخطوط الخلايا الأخرى مثل خط الخلايا الأحادية الشائعة الاستخدام THP-1، قد يعمل حجم مسام مختلف بشكل أفضل. 2) كما تنمو خطوط الخلايا المختلفة بسرعات مختلفة، من المهم ضبط حجم وسائل الإعلام مكيفة وفقا لأرقام الخلايا. ولهذا الغرض، يمكن استخدام وسائط الإعلام الخالية من الخلايا الحاضنة في ظل نفس الظروف التجريبية لتخفيف وسائل الإعلام المشروطة. 3) FBS يحتوي على السيتوكينات. من المهم استخدام المصل خالية من المتوسطة لبذور MV-4-11 الخلايا في الغرفة العليا. إذا تم استخدام FBS هنا، في بعض الأحيان لا يمكن ملاحظة ترحيل الخلايا.
يمكن للباحثين تعديل هذا الفحص لتطبيقات مختلفة. على سبيل المثال، يمكن لخلايا الورم الأخرى، إما ثقافة xenograft المشتقة من المريض، أو خلايا الماوس استبدال خط خلية ورم الدماغ المستخدم في المثال المذكور أعلاه. يمكن استبدال خط الخلايا الضامة بالضامة الأولية أو الخلايا الأحادية من المرضى أو الفئران اعتمادا على الحاجة المحددة. نقطة هامة واحدة هي أن الباحثين بحاجة إلى اختيار الخلايا من نفس النوع لضمان أفضل نتيجة. على الرغم من أن مسار الأدوية الكيميائية الضامة يتم الحفاظ عليها بشكل كبير، فإن اختلاف تسلسل البروتين من الهيكل بين الأنواع المختلفة قد يضيف طبقات من المضاعفات لتفسير النتائج التجريبية.
TAMs تجذب المزيد من الاهتمام بشكل متزايد في علم المناعة السرطان13،14. كيف تؤثر التغيرات الوراثية المختلفة في الأورام على توظيف TAMs والخلايا المناعية الأخرى في البيئة الدقيقة الورم لا يزال ينتظر المزيد من الدراسات. عن طريق تغيير أحجام المسام من إدراج Transwell، يمكن استخدام هذا الفحص لدراسة التفاعل بين الورم والخلايا المناعية الأخرى مثل الخلايا T وخلايا NK. إحدى مزايا استخدام تحليل ترانسويل لتقييم التفاعل بين الورم والمناعة هو أنه من السهل إثبات كيف تؤثر الطفرات/الطفرات المحددة على توظيف نوع معين من الخلايا المناعية. وعلاوة على ذلك، من السهل توسيع نطاق هذا الفحص بالنسبة للشاشات على نطاق الجينوم. هذا التبيّن يفتح إمكانيات إضافية للباحثين لدراسة تفاعلات الخلايا المناعية الورمية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا الفحص لدراسة كيفية تأثير الوسائط المشروطة من الخلايا السرطانية على ملف النسخ من الضامة/الخلايا المناعية الأخرى.
كل الاختبارات لها حدودها. لهذا الاختبار، فإن الوسط المشروط هو من الخلايا السرطانية المستزرعة في المختبر. الـ(شيوكينا) المعفيين هنا قد يكون مختلفاً عن تلك التي تفرزها الأورام المزروعة في الجسم الحي بالإضافة إلى ذلك، يختلف خط الخلايا الضامة عن الورم المتسلل إلى الضامة، والتي هي أكثر فينوليا ومتنوعة بشكل نسخي. ولذلك، من الضروري تأكيد المزيد من النتائج في المختبر باستخدام أساليب أخرى في المختبر وفي الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليام أ. فايس هو أحد مؤسسي StemSynergy Therapeutics. زيني يَنُسبُ لا شيءَ للكشف عنه.
Acknowledgments
دعم المنح: Z. تلقى الدعم من مؤسسة أليكس موقف عصير الليمون، الجمعية الأمريكية لأورام الدماغ، المعاهد القومية للصحة T32CA108462 وبرنامج للبحوث الطبية الحيوية اختراق، والتي يتم تمويلها جزئيا من قبل مؤسسة ساندلر. W. Weiss كان مدعوما من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103; مؤسسة صموئيل ج. واكسمان لبحوث السرطان؛ وإيفيلين وماتي أندرسون كرسي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 μm filtration cup | Thermo fisher | 566-0010 | |
| 0.45 μm filter unit | Millipore | SLHA033SS | |
| 10 mL serological pipettes | Olympus plastics | 12-104 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Olympus plastics | 28-103 | |
| 1 mL pipette tip | ART molecular bioproducts | 2779-RI | |
| 2 mL aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 24-well plate | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 4x lysis buffer | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 5 μm Transwell insert | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| CyQuant Dye | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| FGF | Peprotech | 100-18B | |
| IMDM | Gibco | 12440-053 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypan blue | Biorad | 1450021 |
References
- Liu, Y., Cao, X. The origin and function of tumor-associated macrophages. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 1-4 (2015).
- Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, (2014).
- Coussens, L. M., Zitvogel, L., Palucka, A. K. Neutralizing tumor-promoting chronic inflammation: a magic bullet. Science. 339 (6117), 286-291 (2013).
- Tsukamoto, H., et al. Combined Blockade of IL6 and PD-1/PD-L1 Signaling Abrogates Mutual Regulation of Their Immunosuppressive Effects in the Tumor Microenvironment. Cancer Research. 78 (17), 5011-5022 (2018).
- Borgoni, S., et al. Depletion of tumor-associated macrophages switches the epigenetic profile of pancreatic cancer infiltrating T cells and restores their anti-tumor phenotype. Oncoimmunology. 7 (2), e1393596 (2018).
- Argyle, D., Kitamura, T. Targeting Macrophage-Recruiting Chemokines as a Novel Therapeutic Strategy to Prevent the Progression of Solid Tumors. Frontiers in Immunology. 9, 2629 (2018).
- An, Z., et al. EGFR cooperates with EGFRvIII to recruit macrophages in glioblastoma. Cancer Research. , (2018).
- Fan, Q. W., et al. EGFR phosphorylates tumor-derived EGFRvIII driving STAT3/5 and progression in glioblastoma. Cancer Cell. 24 (4), 438-449 (2013).
- Jacquelot, N., Duong, C. P. M., Belz, G. T., Zitvogel, L. Targeting Chemokines and Chemokine Receptors in Melanoma and Other Cancers. Frontiers in Immunology. 9, 2480 (2018).
- Arimont, M., et al. Structural Analysis of Chemokine Receptor-Ligand Interactions. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (12), 4735-4779 (2017).
- Turner, M. D., Nedjai, B., Hurst, T., Pennington, D. J. Cytokines and chemokines: At the crossroads of cell signalling and inflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (11), 2563-2582 (2014).
- Sokol, C. L., Luster, A. D. The chemokine system in innate immunity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (5), (2015).
- Pathria, P., Louis, T. L., Varner, J. A. Targeting Tumor-Associated Macrophages in Cancer. Trends in Immunology. 40 (4), 310-327 (2019).
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 399-416 (2017).
