Summary
本文代表一种有用的体外测定,以评估肿瘤细胞的调节介质吸引巨噬细胞的能力。
Abstract
肿瘤相关巨噬细胞(TAM)占不同类型癌症肿瘤质量中很大比例的细胞。胶质母细胞瘤(GBM),一种恶性脑肿瘤,没有治愈,有高达一半的肿瘤质量TAM。根据细胞中特定基因的激活,TAM 可以是亲肿瘤或抗肿瘤的。肿瘤的基因突变,通过调节细胞因子表达,可以影响TAM在肿瘤微环境中的招募。在这里,我们描述了一个基于定量细胞的测定,以评估肿瘤细胞中调节介质的巨噬细胞招募。此测定使用人类巨噬细胞系 MV-4-11 来研究胶质细胞瘤的调节介质对宏噬细胞的吸引力,从而实现高重现性和低变异性。通过这种测定生成的数据有助于更好地了解肿瘤与肿瘤微环境之间的相互作用。类似的测定可用于评估肿瘤细胞与其他免疫细胞(包括T细胞和自然杀伤细胞(NK)细胞之间的相互作用。
Introduction
巨噬细胞是具有高型磷型和功能异质性1的免疫细胞。它们在宿主防御系统、组织修复、发育和肿瘤进展1中起着重要的作用。在实体肿瘤的微环境中,TAM是巨噬细胞。某些TAM可以通过抑制T细胞介导细胞毒性活性,调节肿瘤微环境(TME),促进血管生成、入侵和转移2,3,4,促进肿瘤生长。5.TAM是 TME 中最丰富的细胞类型之一,在多种类型的实体肿瘤6中,TAM 的数量通常与较差的患者存活率相关。肿瘤细胞的不同遗传特征影响其招募巨噬细胞的能力。在GBM,一个侵略性脑肿瘤,没有治愈,巨噬细胞可以代表肿瘤质量的一半7。表皮生长因子受体(EGFR)及其截断突变EGFRvIII的共增增在GBM中经常观察到,赋予肿瘤生长优势8。与表达EGFR或EGFRvIII的细胞相比,共同表达EGFR和EGFRvIII的细胞吸引更多的巨噬细胞。
化学因子是小细胞因子家族,在TME6、9中调节免疫成分方面起着重要作用。人类细胞表达超过50个细胞因子10。肿瘤中的免疫渗透主要通过细胞因子和细胞因子受体11之间的相互作用来实现。每种类型的免疫细胞表达不同的化学素受体/化学素,并可以招募的细胞分泌特定的化学素/化学素受体12。癌细胞可以增加某些化学素的表达,以招募免疫细胞,如TAM,调节性T细胞和骨髓衍生抑制细胞(MDSc)6。抑制肿瘤分泌的特定化学体是抑制免疫细胞渗入肿瘤质量的有希望的途径。
在这里,我们描述了一个方案,允许体外评估肿瘤-巨噬细胞相互作用,使用来自含有化学素和巨噬细胞系的肿瘤细胞的条件介质。
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Protocol
1. 中等准备
-
无血清干细胞培养基的制备
- 解冻50x B27补充剂、表皮生长因子(EGF,20 μg/mL,10 mM醋酸中,含0.1%BSA),以及成纤维细胞生长因子(FGF,20μg/mL,10 mM醋酸,0.1%BSA)。
- 加入500 μL的EGF(最终浓度20纳克/mL),500 μL的FGF(最终浓度20纳克/mL),10 mL的50x B27至500 mL的Dulbeco的改性鹰中等/营养混合物F-12(DMEM/F12)和5 mL的100x青霉素/链球菌。倒置瓶4-6次混合,过滤消毒通过500 mL 0.1 μm过滤杯。标记瓶子,在4°C下储存。
注:该介质在 4°C 下可使用长达一个月。
- 准备 MV-4-11 培养基:将 50 mL 的胎儿牛血清 (FBS) 添加到 500 mL 的 Iscove 改性 Dulbeco 培养基 (IMDM)。倒置瓶4-6次混合,过滤消毒通过500 mL 0.1 μm过滤杯。标记瓶子,在4°C下储存。
注:该介质在 4°C 下可使用长达一个月。 - 准备肿瘤细胞维持介质:将50mL的FBS添加到500mL的Dulbecco的改性鹰培养基(DMEM)。倒置瓶4-6次混合,过滤消毒通过500 mL 0.1 μm过滤杯。标记瓶子,在4°C下储存。
注:该介质在 4°C 下可使用长达一个月。
2. 细胞制备
第1天:
- 解冻肿瘤细胞
- 在37°C水浴中加热肿瘤细胞维持介质(如步骤1.3所述)20分钟。
- 从液氮罐中获取冷冻的 U87、U87:EGFR、U87:EGFRvIII 和 U87:EGFR_EGFRvIII 电池。在37°C水浴处将细胞解冻2分钟。
注意:从液氮罐中取细胞时要小心。根据需要戴上带热保护和安全护目镜的手套。 - 用70%乙醇喷洒组织培养罩表面,并用纸巾擦去表面70%的乙醇。
- 用70%乙醇喷洒含有细胞的低温小瓶和中瓶,用纸巾擦掉表面70%的乙醇,并放入组织培养罩。
- 移液器5 mL肿瘤细胞维持介质放入15 mL无菌离心管。反转含有肿瘤细胞的管4-6次混合。将所有细胞移入15mL离心管中。反转离心管4-6次混合。
- 在4°C下以200 x g将细胞离心5分钟。吸气上清液。
- 用10 mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞。在4°C下以200 x g将细胞离心5分钟。吸气上清液。
- 在肿瘤细胞维持培养基的12 mL中重新悬浮细胞(如步骤1.3所述)。上下移液3-5次混合。将细胞转移到T75细胞培养瓶中。
- 在37°C培养箱中用5%的CO2生长细胞。将肿瘤细胞维持介质放回4°C冰箱。
第2天:
- 检查显微镜下的细胞。如果需要,更改介质。细胞应在培养的单层中生长。
第3天:
- 解冻 MV-4-11 细胞
- 在 37°C 水浴中预热 MV-4-11 培养基(如步骤 1.2 中所述)20 分钟。
注:MV-4-11可以更改为原食道或其他巨噬细胞系,具体取决于具体研究的需要。 - 从液氮罐中取下冷冻的MV-4-11细胞。在37°C水浴中解冻细胞2分钟。
警告:从液氮罐中取取细胞时要小心。根据需要戴上带热保护和安全护目镜的手套。 - 用70%乙醇喷洒组织培养罩表面,并用纸巾擦去表面70%的乙醇。
- 用70%乙醇喷洒含有细胞的低温小瓶和中瓶,用纸巾擦掉表面70%的乙醇,并放入组织培养罩。
- 将MV-4-11培养基的移液器5 mL(如步骤1.2中所述)放入15 mL无菌离心管中。反转含有肿瘤细胞的管4-6次混合。将所有细胞移入15mL离心管中。反转离心管4-6次混合。
- 在4°C下以200 x g将细胞离心5分钟。吸气上清液。
- 将细胞洗净在10 mL的PBS中,并在200 x g下在4°C下将细胞离心5分钟。吸气上清液。
- 在 12 mL 的 MV-4-11 培养基培养基中重新悬浮细胞(如步骤 1.2 中所述)。轻轻上下移液3-5次混合。将细胞转移到T75细胞培养瓶中。
- 在37°C培养箱中用5%的CO2生长细胞。
- 在 37°C 水浴中预热 MV-4-11 培养基(如步骤 1.2 中所述)20 分钟。
- 分裂肿瘤细胞
- 在37°C水浴中加热无血清干细胞培养基(如步骤1.1所述)20分钟。
- 用70%乙醇喷洒组织培养罩表面,并用纸巾擦去表面70%的乙醇。从冰箱中拿出细胞分离溶液。用70%乙醇喷洒介质和细胞分离溶液瓶,用纸巾擦掉表面70%的乙醇,并将其放入组织培养罩。
注:不要预加热丙蔗酶细胞分离溶液。 - 将肿瘤细胞培养从培养箱转移到组织培养罩。吸气介质,将2 mL的细胞分离溶液加入烧瓶。
注:在这里,在添加丙蔗酶之前与 PBS 进行 Rinsing。 - 将烧瓶放在发动机罩中。检查肿瘤细胞是否每分钟四舍五入。一旦肿瘤细胞四舍五入,轻轻敲击烧瓶的一侧,以帮助细胞从烧瓶中分离出来。
- 移液器8mL的无血清干细胞培养基进入烧瓶,上下3次混合,并将细胞转移到15mL无菌离心管中。在4°C下以200 x g将细胞离心5分钟。吸气上清液。
- 在 10 mL 的 PBS 中清洗细胞。上下移液3-5次混合。在4°C下以200 x g将细胞离心5分钟。吸气上清液。
注:此步骤是可选的。 - 在10 mL的无血清干细胞培养基中重新悬浮细胞(如步骤1.1所述)。上下移液3-5次混合。取取10μL的细胞,并与10μL的试青溶液混合。将10μL的混合物移液到计数幻灯片中,使用自动细胞计数器量化活细胞数。
- 使用无血清干细胞培养基(如步骤 1.1 所述),将细胞密度调整到 2.5 x 105细胞/mL,并将细胞的种子 2 mL 种子放入 6 孔细胞培养板的每个孔中。对于每种类型的细胞,种子3井(三联体样品)。同时,仅制备6孔2mL无血清干细胞培养基(无细胞)。
注:这些样本将用作负对照组,2) 用于根据细胞数调整条件介质体积。 - 将 6 孔板放入 37°C 的培养箱中,其中 5% CO2。让细胞生长24小时。
3. 体外巨噬菌体吸引力测定
- 准备调节介质
- 在37°C水浴中加热肿瘤细胞维持介质(如步骤1.3所述)20分钟。
- 用70%乙醇喷洒组织培养罩表面,并用纸巾擦去表面70%的乙醇。从冰箱中拿出细胞分离溶液。用70%乙醇喷洒介质瓶和细胞分离溶液,用纸巾擦掉表面70%的乙醇,并放入组织培养罩。
- 从培养箱中拿出6孔板。小心地将调节的介质移入 15 mL 无菌离心管中。把管子放在冰上。将介质中的"介质"很好地放入单独的15 mL无菌离心管中。
注:在此步骤之前,请确保在显微镜下检查细胞是否附着。否则,可以在步骤 2.4.8 中使用涂层板,以允许更好的连接或将浮动单元包括在计数步骤中。 - 将0.5 mL的细胞分离溶液加入6孔板的每个孔中。检查肿瘤细胞是否每分钟四舍五入。一旦肿瘤细胞四舍五入,轻轻敲击板的一侧,以帮助细胞分离。
- 移液器2.5 mL的肿瘤细胞维持介质进入井中,上下移液3次混合并转移细胞进入15mL无菌离心管。取取10μL的细胞,并与10μL的试青溶液混合。将混合物的移液器10μL移入计数幻灯片,并使用自动细胞计数器量化活细胞的数量。
- 使用无血清干细胞培养基(37°C孵育过夜)根据细胞号调整调节介质的体积。例如,如果 Well A 的活细胞数是细胞数最少的井的 3 倍,则稀释其调节介质 1:3。此步骤用于控制由细胞增殖率引起的差异。
注:使用37°C孵育过夜的无血清干细胞培养基,是为了在37°C长时间暴露下控制介质中可能的变化。 - 通过 0.45 μm 过滤器过滤调节介质。将调节介质放在冰上。
注:此步骤可去除调节介质中的细胞和细胞碎片。
- MV-4-11细胞的制备
- 在 37°C 水浴中加热 IMDM 介质(不含 FBS)20 分钟。
- 用70%乙醇喷洒组织培养罩表面,并用纸巾擦去表面70%的乙醇。用70%乙醇喷洒中瓶,用纸巾擦掉表面70%的乙醇,并放入组织培养罩。
- 将MV-4-11细胞的烧瓶放入组织培养罩。将10 mL的细胞移液器放入15 mL无菌离心管中。取10μL的细胞,与10μL的试青溶液混合。将混合物的移液器10μL移入计数幻灯片,并使用自动细胞计数器量化活细胞的数量。在4°C下以200 x g将细胞离心5分钟。吸气上清液。
- 用10 mL的PBS清洗细胞,在200 x g下将细胞离心5分钟,在4°C下。吸气上清液。
- 在IMDM培养基(不含FBS)中重新悬浮细胞,最终细胞密度为1x106细胞/mL。
注:可以调整此处使用的巨噬细胞的细胞数。
- 特兰斯韦尔·阿塞
注:对于此步骤,请使用细胞迁移测定试剂盒或购买试剂并单独插入。对于 MV-4-11 细胞,选择具有 5 μm 孔径的 Transwell 刀片。要检测巨噬细胞迁移,直接量化下腔室中的巨噬细胞数量或使用色度/荧光测量方法。在这里,我们演示了使用色度测定法的测定方法。- 将 24 孔板、刀片和试剂带到室温。
- 将上述制备的250 μL MV-4-11细胞加入每个插入。
- 仅向24孔板的下腔室添加400μL的调节介质/介质(在37°C下过夜孵育,这些样品为负对照)。对于每个肿瘤线或对照,使用三联样品。避免刀片和调节介质之间的气泡。气泡会抑制巨噬细胞迁移到井底。
- 在 37°C 培养箱中孵育板,5% CO 2,4 小时。
注:可以调整孵育时间。在显微镜下可以看到迁移到下腔的细胞。 - 轻轻轻触同一井内壁上的插入,然后丢弃刀片。由于MV-4-11细胞在悬浮液中生长,这里不需要细胞分离溶液或胰蛋白酶治疗。
- 轻轻移液井中的细胞上下3次混合。将225 μL细胞悬浮液转移到黑壁96孔板,适合荧光测量。
- 用 4x 莱沙缓冲液稀释 CyQuant 染料 1:75。涡旋短暂,并旋转解决方案。在 96 孔板的每个孔中加入 75 μL 溶液。在室温下孵育15分钟。
- 使用带荧光板读片器的 480/520 nm 滤光片读取荧光。
- 通过减去空白并归化控制肿瘤细胞系来分析数据。
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Representative Results
结果通常通过条形图显示(如图 1所示)。具有 480/520 值的样本表明,有条件的介质具有高容量来招募巨噬细胞。根据实验需要,可以包括额外的控制。例如,可以使用中和抗体来治疗条件介质,以废除巨噬菌体化疗,并执行相同的测定。也可以向调节介质添加额外的化学素(即 CCL2),作为正控制。
图1:来自U87细胞的调节介质与表达控制载体的U87细胞(EGFR/EGFRvIII)相比,与表达对照载体的U87细胞(EGFR/EGFRvIII)相比,吸引更多的巨噬细胞。这个数字已由An等人修改。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在此协议中,有几个关键步骤:1) 选择 Transwell 插入件。对于 MV-4-11 细胞系,5 μm Transwell 插入件工作良好。但是,对于其他细胞系(如常用的单细胞细胞系 THP-1),不同的孔径可能效果更好。2) 随着不同的细胞系以不同的速度生长,根据细胞数调整调节介质的体积非常重要。为此,在相同的实验条件下孵育的无细胞介质可用于稀释条件介质。3) FBS含有细胞因子。在上腔中使用无血清培养基对MV-4-11细胞进行种子测试非常重要。如果此处使用 FBS,则有时无法观察到细胞迁移。
研究人员可以修改此测定不同的应用。例如,其他肿瘤细胞,无论是原发性患者衍生的异种移植培养,或小鼠细胞可以替代上述例子中使用的脑肿瘤细胞系。根据具体需要,由患者或小鼠的原发性巨噬细胞或单核细胞替代巨噬细胞细胞系。重要的一点是,研究人员需要从同一物种中选择细胞,以确保获得最佳结果。虽然巨噬菌体化学通路高度保守,但不同物种之间结构蛋白序列的变化可能会增加一层并发症,从而解释实验结果。
在癌症免疫学13,14中,TAM越来越受到人们的关注。肿瘤的不同基因变化如何影响肿瘤微环境中的TAM和其他免疫细胞的招募,还有待进一步研究。通过改变Transwell插入物的孔径,这种测定可用于研究肿瘤与其他免疫细胞(如T细胞和NK细胞)之间的相互作用。使用Transwell测定来评估肿瘤免疫相互作用的一个优点是,很容易证明特定的肿瘤基因/突变如何影响特定类型的免疫细胞的招募。此外,这种测定很容易放大到全基因组屏幕。这种测定为研究人员研究肿瘤-免疫细胞相互作用提供了更多的可能性。此外,此测定可用于研究肿瘤细胞的调节介质如何影响巨噬细胞/其他免疫细胞的转录特征。
所有检测都有其局限性。对于这个测定,条件培养基是从体外培养的肿瘤细胞。这里分泌的化学刺激物可能与体内生长的肿瘤分泌的不同。此外,巨噬细胞系不同于肿瘤渗透巨噬细胞,后者更表象和转录多样化。因此,有必要使用其他体外和体内方法进一步确认体外发现。
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Disclosures
威廉·威斯是斯特姆辛治疗学的联合创始人。安振义没有透露任何信息。
Acknowledgments
资助支持:Z. An得到了亚历克斯柠檬水站基金会、美国脑肿瘤协会、NIH T32CA108462和突破性生物医学研究计划的支持,该计划由桑德勒基金会提供部分资助。W. Weiss 得到 NIH 授权 R01CA221969、R01NS091620、P50CA097257、U01CA217864、P30CA82103的支持;塞缪尔·瓦克斯曼癌症研究基金会;和伊芙琳和玛蒂·安德森的主席
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 μm filtration cup | Thermo fisher | 566-0010 | |
| 0.45 μm filter unit | Millipore | SLHA033SS | |
| 10 mL serological pipettes | Olympus plastics | 12-104 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Olympus plastics | 28-103 | |
| 1 mL pipette tip | ART molecular bioproducts | 2779-RI | |
| 2 mL aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 24-well plate | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 4x lysis buffer | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 5 μm Transwell insert | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| CyQuant Dye | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| FGF | Peprotech | 100-18B | |
| IMDM | Gibco | 12440-053 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypan blue | Biorad | 1450021 |
References
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