Summary
Dit artikel is een nuttige in vitro assay om het vermogen van geconditioneerd medium van tumorcellen te evalueren om macrofagen aan te trekken.
Abstract
Tumor geassocieerde macrofagen (TAMs) rekening voor een groot percentage van de cellen in de tumor massa voor verschillende soorten kankers. Glioblastoma (GBM), een kwaadaardige hersentumor zonder genezing, heeft tot een halve tumor massa TAMs. TAMs kan Pro-tumoreel of anti-tumoreel zijn, afhankelijk van de activering van specifieke genen in de cellen. Genetische mutaties in de tumoren, door het reguleren van cytokine expressie, kan invloed hebben op de werving van TAMs aan de tumor micro omgeving. Hier beschrijven we een kwantitatieve cel-gebaseerde assay om macrofaag Recruitment te beoordelen door het geconditioneerde medium uit de tumorcellen. Deze test gebruikt de humane macrofaag cellijn MV-4-11 om macrofaag aantrekking te bestuderen door het geconditioneerde medium van glioblastoma, wat een hoge reproduceerbaarheid en een lage variabiliteit mogelijk maakt. Gegevens die met deze test worden gegenereerd, kunnen bijdragen tot een beter begrip van de interactie tussen de tumor en de tumor microomgeving. Vergelijkbare assay kan worden gebruikt voor het beoordelen van de interactie tussen de tumorcellen en andere immuuncellen, met inbegrip van T-cellen en Natural Killer (NK) cellen.
Introduction
Macrofagen zijn immuuncellen met hoge fenotypische en functionele heterogeniteit1. Ze spelen belangrijke rollen in de host Defense Systems, weefsel reparatie, ontwikkeling en tumorprogressie1. TAMs zijn macrofagen in de micro-omgeving van vaste tumoren. Bepaalde TAMS kan bevorderen tumorgroei door remming van T-cel gemedieerde cytotoxische activiteit, moduleren van de tumor micro Environment (TME), bevordering van angiogenese, invasie en metastase2,3,4, 5. TAMS behoren tot de meest overvloedige celtypen in de TME en een hoger aantal TAMS in het algemeen correleert met een slechtere overleving van de patiënt in vele soorten vaste tumoren6. De verschillende genetische handtekeningen van de tumorcellen beïnvloeden hun vermogen om macrofagen te rekruteren. In GBM, een agressieve hersentumor zonder genezing, macrofagen kunnen vertegenwoordigen tot een helft van de tumor massa7. Co-amplificatie van de epidermale groeifactor receptor (EGFR) en de afkapping Mutant egfrviii wordt vaak waargenomen in GBM, waardoor tumorgroei voordelen8. Cellen die gezamenlijk EGFR en EGFRvIII uitdrukken, trekken meer macrofagen aan dan cellen die EGFR of EGFRvIII afzonderlijk7uitdrukken.
Chemokines zijn een familie van kleine cytokinen die belangrijke rol spelen bij het reguleren van immune samenstelling in de TME6,9. Menselijke cellen Express meer dan 50 cytokines10. Immuun infiltratie in de tumoren wordt grotendeels gerealiseerd door de interactie tussen cytokines en cytokine receptoren11. Elk type immuuncellen spreekt uitgesproken Chemokine receptoren/chemokines en kan worden gerekruteerd door cellen die specifieke chemokines/Chemokine receptoren12afscheidende. Kankercellen kunnen de expressie van bepaalde chemokinen verhogen om immuuncellen te rekruteren, zoals TAMs, regulatoire T-cellen en myeloïde afgeleide suppressor cellen (MDSCs)6. Blokkade van specifieke Chemokine uitgescheiden door de tumoren kan een veelbelovende manier in remming van infiltratie van immune cellen in de tumor massa.
Hier, we beschrijven een protocol dat toelaat in vitro evaluatie van tumor-macrofaag interactie, met behulp van geconditioneerde media uit de tumorcellen met chemokines en macrofaag cellijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. middelgrote voorbereiding
-
Bereiding van het serum vrije stamcel medium
- Ontdooit het 50x B27 supplement, de epidermale groeifactor (EGF, 20 μg/mL in 10 mM azijnzuur met 0,1% BSA), en de fibroblast-groeifactor (FGF, 20 μg/mL in 10 mM azijnzuur met 0,1% BSA).
- Voeg 500 μL EFG (eindconcentratie 20 ng/mL), 500 μL FGF (eindconcentratie 20 ng/mL), 10 mL 50x B27 tot 500 mL van Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium/nutriënt mengsel F-12 (DMEM/F12) en 5 mL 100x Penicillaire/streptomycine (pen/STREP). Inverteer de fles 4-6 keer om te mengen, filter steriliseren door een 500 mL 0,1 μm filtratie beker. Markeer de fles en bewaar deze op 4 °C.
Opmerking: Het medium is goed te gebruiken voor maximaal een maand bij 4 °C.
- Bereid het MV-4-11 kweekmedium voor: Voeg 50 mL foetaal runderserum (FBS) toe aan 500 mL van het gemodificeerde Dulbecco's medium (IMDM) van Iscove. Inverteer de fles 4-6 keer om te mengen, filter steriliseren door een 500 mL 0,1 μm filtratie beker. Markeer de fles en bewaar deze op 4 °C.
Opmerking: Het medium is goed te gebruiken voor maximaal een maand bij 4 °C. - Bereid de tumor cel onderhouds medium: Voeg 50 mL FBS toe aan 500 mL van Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM). Inverteer de fles 4-6 keer om te mengen, filter steriliseren door een 500 mL 0,1 μm filtratie beker. Markeer de fles en bewaar deze op 4 °C.
Opmerking: Het medium is goed te gebruiken voor maximaal een maand bij 4 °C.
2. voorbereiding van de cel
Dag 1:
- Ontdooien van tumorcellen
- Verwarm de tumor Cell Maintenance medium (zoals beschreven in stap 1,3) bij een 37 °C waterbad gedurende 20 min.
- Neem de bevroren U87, U87: EGFR, U87: EGFRvIII en U87: EGFR + EGFRvIII cellen uit de vloeibare stikstof tank. De cellen in het waterbad van 37 °C ontdooien gedurende 2 minuten.
VOORZICHTIG: Wees voorzichtig bij het nemen van de cellen uit de vloeibare stikstof tank. Draag handschoenen met thermische bescherming en veiligheidsbril indien nodig. - Spray het oppervlak van de weefselkweek met 70% ethanol en veeg 70% ethanol op het oppervlak af met papieren handdoeken.
- Spray de cryogene flesjes met cellen en de medium fles met 70% ethanol, veeg de 70% ethanol op het oppervlak af met papieren handdoeken en breng ze in de weefselkweek kap.
- Pipetteer 5 mL tumorcel onderhouds medium in een steriele centrifugebuis van 15 mL. Inverteer de buis met tumorcellen 4-6 keer te mengen. Pipetteer alle cellen in de 15 mL centrifugebuis. Inverteer de centrifugebuis 4-6 keer om te mengen.
- Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Aspireren het supernatant.
- Was de cellen met 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Aspireren het supernatant.
- Rebreng de cellen in 12 mL van de tumor cel onderhouds medium (zoals beschreven in stap 1,3). Pipetteer op en neer 3-5 keer om te mengen. Breng de cellen over in een T75 celkweek kolf.
- Kweek de cellen in een incubator van 37 °C met 5% CO2. Zet het tumor cel onderhouds medium terug op de 4 °C koelkast.
Dag 2:
- Controleer de cellen onder de Microscoop. Wijzig indien nodig het medium. Cellen moeten groeien in een monolaag in cultuur.
Dag 3:
- Ontdooien van MV-4-11 cellen
- Verwarm het MV-4-11 kweekmedium (zoals beschreven in stap 1,2) in een water bad van 37 °C gedurende 20 minuten.
Opmerking: MV-4-11 kan worden veranderd in primaire macrofagen of andere macrofaag cellijnen, afhankelijk van de behoefte van de specifieke studie. - Neem de bevroren MV-4-11 cellen uit de vloeibare stikstof tank. Ontdooi de cellen gedurende 2 minuten bij een waterbad van 37 °C.
Let op: Wees voorzichtig bij het nemen van de cellen uit de vloeibare stikstof tank. Draag handschoenen met thermische bescherming en veiligheidsbril indien nodig. - Spray het oppervlak van de weefselkweek met 70% ethanol en veeg 70% ethanol op het oppervlak af met papieren handdoeken.
- Spray de cryogene flesjes met cellen en de medium fles met 70% ethanol, veeg de 70% ethanol op het oppervlak af met papieren handdoeken en breng ze in de weefselkweek kap.
- Pipetteer 5 mL MV-4-11 kweekmedium (zoals beschreven in stap 1,2) in een steriele centrifugebuis van 15 mL. Inverteer de buis met tumorcellen 4-6 keer te mengen. Pipetteer alle cellen in de 15 mL centrifugebuis. Inverteer de centrifugebuis 4-6 keer om te mengen.
- Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Aspireren het supernatant.
- Was de cellen in 10 mL PBS en centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Aspireren het supernatant.
- Respendeer de cellen in 12 mL MV-4-11 kweekmedium (zoals beschreven in stap 1,2). Pipetteer de 3-5 keer zachtjes om te mengen. Breng de cellen over in een T75 celkweek kolf.
- Kweek de cellen in een incubator van 37 °C met 5% CO2.
- Verwarm het MV-4-11 kweekmedium (zoals beschreven in stap 1,2) in een water bad van 37 °C gedurende 20 minuten.
- Splitsen van tumorcellen
- Verwarm het serum vrije stamcel medium (zoals beschreven in stap 1,1) gedurende 20 minuten bij een waterbad van 37 °C.
- Spray het oppervlak van de weefselkweek met 70% ethanol en veeg 70% ethanol op het oppervlak af met papieren handdoeken. Neem de cel loslating oplossing uit de koelkast. Spray de medium-en celdetacherings oplossing flessen met 70% ethanol, veeg 70% ethanol op het oppervlak af met papieren handdoeken en breng ze in de weefselkweek kap.
Opmerking: Niet vooraf opwarmen de accutase cel loslating oplossing. - Breng de tumor celcultuur over van de incubator in de weefselkweek kap. Aspirate het medium, voeg 2 mL van de cel loslating oplossing in de kolf.
Opmerking: Spoelen met PBS voor het toevoegen van accutase is hier optioneel. - Stel de kolf in de afzuigkap. Controleer of de tumorcellen rond elke minuut. Als de tumorcellen naar boven zijn afgerond, tikt u zachtjes op de zijkant van de kolf om de cellen uit de kolf te laten losmaken.
- Pipetteer 8 mL serumvrij stamcel medium in de kolf, Pipetteer 3 keer omhoog en omlaag om te mengen en breng de cellen over in een steriele centrifugebuis van 15 mL. Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Aspireren het supernatant.
- Was de cellen in 10 mL PBS. Pipetteer op en neer 3-5 keer om te mengen. Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Aspireren het supernatant.
Opmerking: Deze stap is optioneel. - Respendeer de cellen in 10 mL serumvrij stamcel medium (zoals beschreven in stap 1,1). Pipetteer op en neer 3-5 keer om te mengen. Neem 10 μL van de cellen en meng met 10 μL Trypaanse blauwe oplossing. Pipetteer 10 μL van het mengsel in de teldia en kwantificeer het aantal levende cellen met behulp van een automatische celteller.
- Stel de celdichtheid in op 2,5 x 105 cellen/ml met serumvrij stamcel medium (zoals beschreven in stap 1,1) en zaai 2 ml van de cellen in elk goed van een 6-well celcultuurplaat. Voor elk type cellen, zaad 3 putten (Triplicate monster). Bereid tegelijkertijd 6 putjes met 2 mL serumvrij stamcel medium alleen (geen cellen).
Opmerking: Deze voorbeelden worden gebruikt: 1) als negatieve controles en 2) voor het aanpassen van geconditioneerd gemiddeld volume op basis van celnummers. - Zet de 6-well platen in een incubator van 37 °C met 5% CO2. Laat de cellen groeien voor 24 h.
3. in vitro macrofaag attractie test
- Voorbereiding van geconditioneerde media
- Verwarm de tumor Cell Maintenance medium (zoals beschreven in stap 1,3) bij een 37 °C waterbad gedurende 20 min.
- Spray het oppervlak van de weefselkweek met 70% ethanol en veeg 70% ethanol op het oppervlak af met papieren handdoeken. Neem de cel loslating oplossing uit de koelkast. Spray de flessen van het medium en de cel loslating oplossing met 70% ethanol, veeg de 70% ethanol op het oppervlak af met papieren handdoeken en breng ze in de weefselkweek kap.
- Neem de 6-put-platen uit de incubator. Pipetteer de geconditioneerde media zorgvuldig in 15 mL steriele centrifugebuizen. Zet de buizen op ijs. Pipetteer de media in de "media only" goed in een aparte 15 mL steriele centrifugebuis.
Opmerking: Zorg er vóór deze stap voor dat u onder de Microscoop controleert om te zien of de cellen hechten. Als dat niet het is, kan men gecoate platen gebruiken bij stap 2.4.8 om een betere hechting toe te staan of de zwevende cellen in de telstap te nemen. - Voeg 0,5 mL cel loslating oplossing toe aan elke put van de 6-well plaat. Controleer of de tumorcellen rond elke minuut. Zodra de tumorcellen omhoog, tikt u zachtjes op de zijkant van de plaat om de cellen te helpen loskoppelen.
- Pipetteer 2,5 mL van het tumorcel onderhouds medium in de put, Pipetteer 3 keer op en neer om de cellen in een steriele centrifugebuis van 15 mL te mengen en over te brengen. Neem 10 μL van de cellen en meng met 10 μL Trypaanse blauwe oplossing. Pipetteer 10 μL van het mengsel in de teldia en kwantificeer het aantal levende cellen met behulp van een automatische celteller.
- Pas het volume van de geconditioneerde media aan op basis van het celnummer met behulp van het serum vrije stamcel medium ('s nachts 37 °C incubatie). Bijvoorbeeld, als goed A heeft 3x zoveel levende cellen als de put met het minste aantal cellen, Verdun de geconditioneerde Media 1:3. Deze stap wordt gebruikt om het verschil te beheersen dat wordt veroorzaakt door de celproliferatie.
Opmerking: De reden om het serum vrije stamcel medium te gebruiken met een incubatie van 37 °C 's nachts is om de mogelijke verandering in de media te beheersen met een langdurige blootstelling van 37 °C. - Filter de geconditioneerde media door middel van 0,45 μm filters. Zet de geconditioneerde media op ijs.
Opmerking: Deze stap verwijdert cellen en celresten in de geconditioneerde media.
- Bereiding van MV-4-11 cellen
- Warm het IMDM medium (zonder FBS) op bij een waterbad van 37 °C gedurende 20 minuten.
- Spray het oppervlak van de weefselkweek met 70% ethanol en veeg 70% ethanol op het oppervlak af met papieren handdoeken. Spray de medium fles met 70% ethanol, veeg de 70% ethanol op het oppervlak af met papieren handdoeken en breng ze in de weefselkweek kap.
- Neem de kolf van MV-4-11 cellen in de weefselkweek kap. Pipetteer 10 mL cellen in een steriele centrifugebuis van 15 mL. Neem 10 μL cellen en meng met 10 μL Trypaanse blauwe oplossing. Pipetteer 10 μL van het mengsel in de teldia en kwantificeer het aantal levende cellen met behulp van een automatische celteller. Centrifugeer de cellen op 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Aspireren het supernatant.
- Was de cellen met 10 mL PBS en centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Aspireren het supernatant.
- Respendeer de cellen in IMDM medium (zonder FBS) voor een uiteindelijke celdichtheid van 1x106 cellen/ml.
Opmerking: Het celaantal macrofagen dat hier wordt gebruikt, kan worden aangepast.
- Trans well assay
Opmerking: Gebruik voor deze stap een Celmigratie-assay kit of koop de reagentia en plaats deze afzonderlijk. Voor MV-4-11 cellen, kies trans well inserts met 5 μm poriegrootte. Om macrofaag migratie te detecteren, kwantificeer direct het aantal macrofagen in de onderste kamer of gebruik colorimetrische/fluorimetrische methoden. Hier demonstreren we de assay met behulp van de colorimetrische methode.- Breng de 24-put plaat, de INSERT en de reagentia op kamertemperatuur.
- Voeg aan elke wisselplaat 250 μL MV-4-11 cellen toe die hierboven zijn bereid.
- Voeg slechts 400 μL geconditioneerd medium/medium (met een nachtelijke incubatie bij 37 °C, deze monsters dienen als de negatieve controle) aan de onderste kamers van de 24-Well plaat. Voor elke tumor lijn of controle, gebruik drievoud monsters. Vermijd bellen tussen de wisselplaat en het geconditioneerde medium. Bubbels zal macrofagen remmen van de migratie naar de bodemputten.
- Incuberen de platen in een incubator van 37 °C met 5% CO2 voor 4 uur.
Opmerking: De incubatietijd kan worden aangepast. Cellen die naar de onderste kamers migreren, kunnen onder de Microscoop worden gezien. - Tik zachtjes op het insert op de binnenwand van dezelfde put en gooi de wisselplaat weg. Aangezien MV-4-11 cellen in suspensie groeien, is hier geen celdetacherings oplossing of trypsine-behandeling nodig.
- Pipetteer de cellen in de putjes voorzichtig 3 keer omhoog en omlaag om te mengen. Breng 225 μL celsuspensie over naar een zwart-ommuurde 96-goed plaat die geschikt is voor fluorescerende metingen.
- Verdun de CyQuant Dye 1:75 met 4x lysisbuffer. Vortex kort en draai de oplossing. Voeg 75 μL oplossing toe aan elk goed van de 96-goed plaat. Inincuberen 15 min bij kamertemperatuur.
- Lees fluorescentie met de 480/520 nm Filterset met fluorescentie plaat lezer.
- Analyseer gegevens door de blanco af te trekken en te normaliseren naar het besturingselement tumor cellijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultaten worden meestal getoond via staafdiagrammen (voorbeeld weergegeven in Figuur 1). Monsters met hoge 480/520-waarden geven aan dat de geconditioneerde media een hoge capaciteit hebben om macrofagen te werven. Afhankelijk van de experimentele behoefte kunnen extra bedieningselementen worden opgenomen. Zo kan men neutraliserende antilichamen gebruiken om de geconditioneerde media te behandelen om de macrofaag chemotaxis af te schaffen en dezelfde test uit te voeren. Men kan ook extra chemokines (d.w.z. CCL2) toevoegen aan de geconditioneerde media, die dient als een positieve controle.
Figuur 1: geconditioneerde media uit U87 cellen die samen de EGFR en EGFRvIII uitdrukken, trekken meer macrofagen aan dan U87 cellen die een controle vector uitdrukken, of EGFR/egfrviii afzonderlijk. Dit cijfer is gewijzigd van an, et al.7. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol zijn er verschillende belangrijke stappen: 1) selectie van de trans well insert. Voor de MV-4-11 cellijn werken 5 μm trans well inserts goed. Voor andere cellijnen zoals de veelgebruikte monocyt cellijn thp-1 kan een andere poriegrootte echter beter werken. 2) omdat verschillende cellijnen met verschillende snelheden groeien, is het belangrijk om het volume van de geconditioneerde media aan te passen aan de celaantallen. Hiertoe kunnen cellen vrije media die onder dezelfde experimentele omstandigheden worden geïnfiltreerd, worden gebruikt om de geconditioneerde media te verdunnen. 3) FBS bevat cytokines. Het is belangrijk om serumvrij medium te gebruiken voor zaad MV-4-11 cellen in de bovenste kamer. Als hier FBS wordt gebruikt, kan de Celmigratie soms niet worden waargenomen.
Onderzoekers kunnen deze test voor verschillende toepassingen aanpassen. Bijvoorbeeld, andere tumorcellen, ofwel primaire patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is cultuur, of muis cellen kunnen vervangen door de hersenen tumor cellijn gebruikt in het bovengenoemde voorbeeld. De macrofaag cellijn kan worden vervangen door primaire macrofagen of monocyten van patiënten of muizen, afhankelijk van de specifieke behoefte. Een belangrijk punt is dat de onderzoekers cellen uit dezelfde soort moeten selecteren om het beste resultaat te garanderen. Hoewel het macrofaag chemotaxis traject zeer gecontegeerd is, kan de variatie van de eiwitsequentie van de structuur tussen verschillende soorten complicaties toevoegen om experimentele resultaten te interpreteren.
TAMS trekt steeds meer aandacht in de immunologie van kanker13,14. Hoe verschillende genetische veranderingen in de tumoren invloed op de werving van TAMs en andere immuuncellen in de tumor micro omgeving nog wacht op verdere studies. Door het veranderen van porie maten van de Transwell inserts, kan deze test worden gebruikt om interactie tussen tumor en andere immuuncellen zoals T-cellen en NK-cellen te bestuderen. Een voordeel van het gebruik van de trans well assay om tumor-immune interactie te evalueren is dat het gemakkelijk is om aan te tonen hoe specifieke oncogenen/mutaties de werving van een bepaald type immuuncellen beïnvloeden. Bovendien is deze assay gemakkelijk op te schalen voor genoom-Wide schermen. Deze assay opent aanvullende mogelijkheden voor onderzoekers om tumor-immuuncelinteracties te bestuderen. Bovendien kan deze test worden gebruikt om te bestuderen hoe de geconditioneerde media uit tumorcellen het transcriptie Profiel van de macrofagen/andere immuuncellen beïnvloeden.
Alle assays hebben hun beperkingen. Voor deze test is het geconditioneerde medium afkomstig van tumorcellen die in vitro gekweekt zijn. De afgescheiden chemokines hier kunnen afwijken van die uitgescheiden door tumoren geteeld in vivo. Bovendien verschilt de macrofaag cellijn van tumor infiltrerende macrofagen, die meer fenotypisch en transcriptioneel divers zijn. Daarom is verdere bevestiging van de in vitro bevindingen met behulp van andere in vitro en in vivo methoden noodzakelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
William A. Weiss is medeoprichter van StemSynergy Therapeutics. Zhenyi an heeft niets te onthullen.
Acknowledgments
Subsidie ondersteuning: Z. an kreeg steun van Alex's Lemonade stand Foundation, American Brain Tumor Association, NIH T32CA108462 en programma voor baanbrekend biomedisch onderzoek, dat deels wordt gefinancierd door de Sandler Foundation. W. Weiss werd ondersteund door NIH grants R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103; de Stichting Samuel G. Waxman Cancer Research; en de Evelyn en Mattie Anderson stoel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 μm filtration cup | Thermo fisher | 566-0010 | |
| 0.45 μm filter unit | Millipore | SLHA033SS | |
| 10 mL serological pipettes | Olympus plastics | 12-104 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Olympus plastics | 28-103 | |
| 1 mL pipette tip | ART molecular bioproducts | 2779-RI | |
| 2 mL aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 24-well plate | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 4x lysis buffer | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 5 μm Transwell insert | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| CyQuant Dye | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| FGF | Peprotech | 100-18B | |
| IMDM | Gibco | 12440-053 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypan blue | Biorad | 1450021 |
References
- Liu, Y., Cao, X. The origin and function of tumor-associated macrophages. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 1-4 (2015).
- Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, (2014).
- Coussens, L. M., Zitvogel, L., Palucka, A. K. Neutralizing tumor-promoting chronic inflammation: a magic bullet. Science. 339 (6117), 286-291 (2013).
- Tsukamoto, H., et al. Combined Blockade of IL6 and PD-1/PD-L1 Signaling Abrogates Mutual Regulation of Their Immunosuppressive Effects in the Tumor Microenvironment. Cancer Research. 78 (17), 5011-5022 (2018).
- Borgoni, S., et al. Depletion of tumor-associated macrophages switches the epigenetic profile of pancreatic cancer infiltrating T cells and restores their anti-tumor phenotype. Oncoimmunology. 7 (2), e1393596 (2018).
- Argyle, D., Kitamura, T. Targeting Macrophage-Recruiting Chemokines as a Novel Therapeutic Strategy to Prevent the Progression of Solid Tumors. Frontiers in Immunology. 9, 2629 (2018).
- An, Z., et al. EGFR cooperates with EGFRvIII to recruit macrophages in glioblastoma. Cancer Research. , (2018).
- Fan, Q. W., et al. EGFR phosphorylates tumor-derived EGFRvIII driving STAT3/5 and progression in glioblastoma. Cancer Cell. 24 (4), 438-449 (2013).
- Jacquelot, N., Duong, C. P. M., Belz, G. T., Zitvogel, L. Targeting Chemokines and Chemokine Receptors in Melanoma and Other Cancers. Frontiers in Immunology. 9, 2480 (2018).
- Arimont, M., et al. Structural Analysis of Chemokine Receptor-Ligand Interactions. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (12), 4735-4779 (2017).
- Turner, M. D., Nedjai, B., Hurst, T., Pennington, D. J. Cytokines and chemokines: At the crossroads of cell signalling and inflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (11), 2563-2582 (2014).
- Sokol, C. L., Luster, A. D. The chemokine system in innate immunity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (5), (2015).
- Pathria, P., Louis, T. L., Varner, J. A. Targeting Tumor-Associated Macrophages in Cancer. Trends in Immunology. 40 (4), 310-327 (2019).
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 399-416 (2017).
