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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

In Vitro-Assay zur Untersuchung der Tumor-Makrophage-Interaktion

Published: August 1, 2019 doi: 10.3791/59907
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Department of Neurology, University of California, San Francisco, 2Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center, University of California, San Francisco, 3Departments of Pediatrics and Neurological Surgery, University of California, San Francisco

Summary

Dieser Artikel stellt einen nützlichen In-vitro-Assay dar, um die Fähigkeit des konditionierten Mediums aus Tumorzellen zu bewerten, Makrophagen anzuziehen.

Abstract

Tumorassoziierte Makrophagen (TAMs) machen einen großen Prozentsatz der Zellen in der Tumormasse für verschiedene Krebsarten aus. Glioblastom (GBM), ein bösartiger Hirntumor ohne Heilung, hat bis zu die Hälfte der Tumormasse TAMs. TAMs können pro-tumoral oder anti-tumoral sein, abhängig von der Aktivierung bestimmter Gene in den Zellen. Genetische Mutationen in den Tumoren können durch die Regulierung der Zytokinexpression die Rekrutierung von TAMs in die Tumormikroumgebung beeinflussen. Hier beschreiben wir einen quantitativen zellbasierten Assay zur Beurteilung der Makrophagenrekrutierung durch das konditionierte Medium aus den Tumorzellen. Dieser Test verwendet die menschliche Makrophagen-Zelllinie MV-4-11, um die Makrophagen-Anziehung durch das konditionierte Medium aus dem Glioblastom zu untersuchen, was eine hohe Reproduzierbarkeit und geringe Variabilität ermöglicht. Die mit diesem Test generierten Daten können zu einem besseren Verständnis der Wechselwirkung zwischen dem Tumor und der Tumormikroumgebung beitragen. Ähnliche Assay kann verwendet werden, um Interaktion zwischen den Tumorzellen und anderen Immunzellen zu bewerten, einschließlich T-Zellen und natürliche Killerzellen (NK) Zellen.

Introduction

Makrophagen sind Immunzellen mit hoher phäkotypischer und funktioneller Heterogenität1. Sie spielen eine wichtige Rolle in den Wirtsabwehrsystemen, Gewebereparatur, Entwicklung und Tumorprogression1. TAMs sind Makrophagen in der Mikroumgebung von soliden Tumoren. Bestimmte TAMs können das Tumorwachstum fördern, indem sie t zellvermittelte zytotoxische Aktivität hemmen, die Tumormikroumgebung (TME) modulieren, Angiogenese, Invasion und Metastasierung fördern2,3,4, 5. TAMs gehören zu den häufigsten Zelltypen in der TME und eine höhere Anzahl von TAMs korreliert in der Regel mit schlechteren Patientenüberleben in vielen Arten von soliden Tumoren6. Die ausgeprägten genetischen Signaturen der Tumorzellen beeinflussen ihre Fähigkeit, Makrophagen zu rekrutieren. In GBM, einem aggressiven Hirntumor ohne Heilung, können Makrophagen bis zu der Hälfte der Tumormasse7ausmachen. Die Ko-Amplifikation des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) und seiner Abschneidemutung EGFRvIII wird häufig bei GBM beobachtet, was Tumorwachstumsvorteile8verleiht. Zellen, die EGFR und EGFRvIII mitexzieren, ziehen mehr Makrophagen an als Zellen, die EGFR oder EGFRvIII singly7exzieren.

Chemokine sind eine Familie von kleinen Zytokinen, die eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Immunzusammensetzung in der TME6,9spielen. Menschliche Zellen exprimieren mehr als 50 Zytokine10. Die Immuninfiltration in den Tumoren wird weitgehend durch die Wechselwirkung zwischen Zytokinen und Zytokinrezeptoren11realisiert. Jede Art von Immunzellen drückt unterschiedliche Chemokinrezeptoren/Chemokine aus und kann von Zellen rekrutiert werden, die bestimmte Chemokine/Chemokin-Rezeptoren sezernieren12. Krebszellen können die Expression bestimmter Chemokine erhöhen, um Immunzellen wie TAMs, regulatorische T-Zellen und myeloiden-abgeleiteten Suppressorzellen (MDSCs) zu rekrutieren6. Die Blockade von spezifischem Chemokin, das von den Tumoren sezerniert wird, kann ein vielversprechender Weg sein, um die Infiltration von Immunzellen in die Tumormasse zu hemmen.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das eine In-vitro-Evaluierung der Tumor-Makrophagen-Interaktion ermöglicht, indem konditionierte Medien aus den Tumorzellen verwendet werden, die Chemokine und Makrophagenzelllinien enthalten.

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Protocol

1. Mittlere Vorbereitung

  1. Vorbereitung des serumfreien Stammzellmediums
    1. Die 50x B27-Ergänzung, den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF, 20 g/ml in 10 mM Essigsäure mit 0,1% BSA) und den Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF, 20 g/ml in 10 mM Essigsäure mit 0,1% BSA) auftauen.
    2. Fügen Sie 500 l EGF (Endkonzentration 20 ng/ml), 500 l FGF (Endkonzentration 20 ng/ml), 10 ml 50x B27 bis 500 ml Dulbeccos modifizierte Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) und 5 ml mit 100x Penicillin/Streptomycin (Penrep/Strep). Invertieren Sie die Flasche 4-6 mal zu mischen, Filter sterilisieren durch eine 500 ml 0,1 m Filtrationsbecher. Die Flasche markieren und bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Das Medium ist gut für bis zu einem Monat bei 4 °C zu verwenden.
  2. Vorbereiten des Kulturmediums MV-4-11: 50 ml fetales Rinderserum (FBS) zu 500 ml von Iscovees modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) hinzufügen. Invertieren Sie die Flasche 4-6 mal zu mischen, Filter sterilisieren durch eine 500 ml 0,1 m Filtrationsbecher. Die Flasche markieren und bei 4 °C lagern.
    HINWEIS: Das Medium ist gut für bis zu einem Monat bei 4 °C zu verwenden.
  3. Vorbereiten des Tumorzellerhaltungsmediums: Fügen Sie 50 ml FBS zu 500 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) hinzu. Invertieren Sie die Flasche 4-6 mal zu mischen, Filter sterilisieren durch eine 500 ml 0,1 m Filtrationsbecher. Die Flasche markieren und bei 4 °C lagern.
    HINWEIS: Das Medium ist gut für bis zu einem Monat bei 4 °C zu verwenden.

2. Zellvorbereitung

Tag 1:

  1. Auftauen von Tumorzellen
  2. Erwärmen Sie das Tumorzellerhaltungsmedium (wie in Schritt 1.3 beschrieben) in einem 37 °C Wasserbad für 20 min.
  3. Nehmen Sie die gefrorenen Zellen U87, U87:EGFR, U87:EGFRvIII und U87:EGFR+EGFRvIII aus dem flüssigen Stickstofftank. Die Zellen im 37 °C-Wasserbad 2 min auftauen.
    VORSICHT: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Zellen aus dem flüssigen Stickstofftank nehmen. Tragen Sie bei Bedarf Handschuhe mit Wärmeschutz und Schutzbrille.
  4. Sprühen Sie die Gewebekultur-Kapuzenoberfläche mit 70% Ethanol und wischen Sie 70% Ethanol auf der Oberfläche mit Papiertüchern ab.
  5. Sprühen Sie die kryogenen Durchstechflaschen mit Zellen und die mittlere Flasche mit 70% Ethanol, wischen Sie 70% Ethanol an der Oberfläche mit Papiertüchern ab und bringen Sie sie in die Gewebekulturhaube.
  6. Pipette 5 ml Tumorzellerhaltungsmedium in ein 15 ml steriles Zentrifugenrohr. Invertieren Sie die Röhre mit Tumorzellen 4-6 mal zu mischen. Alle Zellen in das 15 ml Zentrifugenrohr pipette. Invertieren Sie das Zentrifugenrohr 4-6 mal zu mischen.
  7. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.
  8. Waschen Sie die Zellen mit 10 ml Phosphatgepufferter Saline (PBS). Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.
  9. Resuspendieren Sie die Zellen in 12 ml Tumorzell-Erhaltungsmedium (wie in Schritt 1.3 beschrieben). Pipette nach oben und unten 3-5 mal zu mischen. Übertragen Sie die Zellen in einen T75-Zellkulturkolben.
  10. Wachsen Sie die Zellen in einem 37 °C Inkubator mit 5%CO2. Stellen Sie das Tumorzellenpflegemedium wieder in den 4 °C-Kühlschrank.

Tag 2:

  1. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Ändern Sie das Medium bei Bedarf. Zellen sollten in einer Monolayer in kultur wachsen.

Tag 3:

  1. Auftauen von MV-4-11-Zellen
    1. Erwärmen Sie das Kulturmedium MV-4-11 (wie in Schritt 1.2 beschrieben) in einem 37 °C-Wasserbad für 20 min.
      HINWEIS: MV-4-11 kann je nach Bedarf der spezifischen Studie in primäre Makrophagen oder andere Makrophagenzellenlinien geändert werden.
    2. Nehmen Sie die gefrorenen MV-4-11-Zellen aus dem flüssigen Stickstofftank. Die Zellen in einem 37 °C-Wasserbad 2 min auftauen.
      ACHTUNG: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Zellen aus dem flüssigen Stickstofftank nehmen. Tragen Sie bei Bedarf Handschuhe mit Wärmeschutz und Schutzbrille.
    3. Sprühen Sie die Gewebekultur-Kapuzenoberfläche mit 70% Ethanol und wischen Sie 70% Ethanol auf der Oberfläche mit Papiertüchern ab.
    4. Sprühen Sie die kryogenen Durchstechflaschen mit Zellen und die mittlere Flasche mit 70% Ethanol, wischen Sie 70% Ethanol an der Oberfläche mit Papiertüchern ab und bringen Sie sie in die Gewebekulturhaube.
    5. Pipette 5 ml MV-4-11 Kulturmedium (wie in Schritt 1.2 beschrieben) in ein 15 ml steriles Zentrifugenrohr. Invertieren Sie die Röhre mit Tumorzellen 4-6 mal zu mischen. Alle Zellen in das 15 ml Zentrifugenrohr pipette. Invertieren Sie das Zentrifugenrohr 4-6 mal zu mischen.
    6. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.
    7. Waschen Sie die Zellen in 10 ml PBS und zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.
    8. Unterbrechen Sie die Zellen in 12 ml des MV-4-11-Kulturmediums (wie in Schritt 1.2 beschrieben). Sanft Pipette nach oben und unten 3-5 mal zu mischen. Übertragen Sie die Zellen in einen T75-Zellkulturkolben.
    9. Wachsen Sie die Zellen in einem 37 °C Inkubator mit 5%CO2.
  2. Spaltung von Tumorzellen
    1. Erwärmen Sie das serumfreie Stammzellmedium (wie in Schritt 1.1 beschrieben) in einem 37 °C-Wasserbad 20 min.
    2. Sprühen Sie die Gewebekultur-Kapuzenoberfläche mit 70% Ethanol und wischen Sie 70% Ethanol auf der Oberfläche mit Papiertüchern ab. Nehmen Sie die Lösung der Zellablösung aus dem Kühlschrank. Sprühen Sie die Flaschen der Mittel- und Zellablösung mit 70% Ethanol, wischen Sie 70% Ethanol an der Oberfläche mit Papiertüchern ab und bringen Sie sie in die Gewebekulturhaube.
      HINWEIS: Die Lösung der Accutase-Zellablösung nicht vorerwärmen.
    3. Übertragen Sie die Tumorzellkultur aus dem Inkubator in die Gewebekulturhaube. Aspirieren Sie das Medium, fügen Sie 2 ml Zellablösung in den Kolben.
      HINWEIS: Das Spülen mit PBS vor dem Hinzufügen von Accutase ist hier optional.
    4. Stellen Sie den Kolben in die Kapuze. Prüfen Sie, ob sich die Tumorzellen jede Minute aufrunden. Sobald sich die Tumorzellen aufrunden, tippen Sie vorsichtig auf die Seite des Kolbens, um den Zellen zu helfen, sich vom Kolben zu lösen.
    5. 8 ml serumfreies Stammzellmedium in den Kolben, Pipette 3 Mal nach oben und unten zum Mischen und übertragen die Zellen in ein 15 ml steriles Zentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.
    6. Waschen Sie die Zellen in 10 ml PBS. Pipette nach oben und unten 3-5 mal zu mischen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist optional.
    7. Setzen Sie die Zellen in 10 ml serumfreiem Stammzellmedium (wie in Schritt 1.1 beschrieben) wieder aus. Pipette nach oben und unten 3-5 mal zu mischen. Nehmen Sie 10 l der Zellen und mischen Sie sie mit 10 l Trypan Blue-Lösung. Pipette 10 l des Gemischs in den Zählschlitten, quantifizieren lebende Zellzahl mit einem automatischen Zellzähler.
    8. Stellen Sie die Zelldichte auf 2,5 x 105 Zellen/ml mit serumfreiem Stammzellmedium (wie in Schritt 1.1 beschrieben) und 2 ml der Zellen in jeden Brunnen einer 6-Well-Zellkulturplatte ein. Für jede Zellart 3 Brunnen (dreifache Probe). Zur gleichen Zeit, bereiten Sie 6 Brunnen mit 2 ml serumfreies Stammzellmedium nur (keine Zellen).
      HINWEIS: Diese Proben werden verwendet: 1) als Negativkontrollen und 2) zur Anpassung des konditionierten mittleren Volumens auf der Grundlage von Zellenzahlen.
    9. Legen Sie die 6-Well-Platten in einen 37°C-Inkubator mit 5% CO2 . Lassen Sie die Zellen für 24 h wachsen.

3. In Vitro Makrophagen Attraktion Assay

  1. Aufbereitung konditionierter Medien
    1. Erwärmen Sie das Tumorzellerhaltungsmedium (wie in Schritt 1.3 beschrieben) in einem 37 °C Wasserbad für 20 min.
    2. Sprühen Sie die Gewebekultur-Kapuzenoberfläche mit 70% Ethanol und wischen Sie 70% Ethanol auf der Oberfläche mit Papiertüchern ab. Nehmen Sie die Lösung der Zellablösung aus dem Kühlschrank. Sprühen Sie die Flaschen des Mediums und die Zellablösung mit 70% Ethanol, wischen Sie 70% Ethanol an der Oberfläche mit Papiertüchern ab und bringen Sie sie in die Gewebekulturhaube.
    3. Nehmen Sie die 6-Well-Platten aus dem Inkubator. Das konditionierte Medium sorgfältig in 15 ml sterile Zentrifugenrohre zerlegen. Die Rohre auf Eis legen. Pipette die Medien in den "Medien nur" gut in eine separate 15 ml sterile Zentrifuge Rohr.
      HINWEIS: Überprüfen Sie vor diesem Schritt unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen anheften. Ist dies nicht der Fall, kann man beschichtete Platten in Schritt 2.4.8 verwenden, um eine bessere Befestigung zu ermöglichen oder die schwimmenden Zellen in den Zählschritt einzubeziehen.
    4. Fügen Sie 0,5 ml Zellablösung in jeden Brunnen der 6-Well-Platte ein. Prüfen Sie, ob sich die Tumorzellen jede Minute aufrunden. Sobald sich die Tumorzellen aufrunden, tippen Sie vorsichtig auf die Seite der Platte, um die Zellen zu lösen.
    5. Pipette 2,5 ml Tumorzellerhaltungsmedium in den Brunnen, Pipette 3 Mal nach oben und unten, um die Zellen zu mischen und in ein 15 ml steriles Zentrifugenrohr zu übertragen. Nehmen Sie 10 l der Zellen und mischen Sie sie mit 10 l Trypan Blue-Lösung. Pipette 10 l des Gemischs in den Zählschlitten und quantifizieren die Anzahl der lebenden Zellen mit einem automatischen Zellzähler.
    6. Passen Sie die Lautstärke des konditionierten Mediums anhand der Zellzahl mit dem serumfreien Stammzellmedium (37 °C Inkubation über Nacht) an die Zellenzahl an. Wenn Well A beispielsweise 3x so viele lebende Zellen hat wie der Brunnen mit der geringsten Anzahl von Zellen, verdünnen Sie seine konditionierten Medien 1:3. Dieser Schritt wird verwendet, um die Durchproliferationsrate der Zelle verursachten Unterschiede zu steuern.
      HINWEIS: Der Grund für die Verwendung eines serumfreien Stammzellmediums mit 37 °C Inkubation über Nacht ist die Kontrolle der möglichen Medienveränderung bei längerer 37 °C-Exposition.
    7. Filtern Sie das konditionierte Medium durch 0,45 m Filter. Setzen Sie die konditionierten Medien auf Eis.
      HINWEIS: Dieser Schritt entfernt Zellen und Zellablagerungen in den konditionierten Medien.
  2. Herstellung von MV-4-11-Zellen
    1. Erwärmen Sie das IMDM-Medium (ohne FBS) in einem 37 °C-Wasserbad für 20 min.
    2. Sprühen Sie die Gewebekultur-Kapuzenoberfläche mit 70% Ethanol und wischen Sie 70% Ethanol auf der Oberfläche mit Papiertüchern ab. Sprühen Sie die mittlere Flasche mit 70% Ethanol, wischen Sie 70% Ethanol an der Oberfläche mit Papiertüchern ab und bringen Sie sie in die Gewebekulturhaube.
    3. Nehmen Sie den Kolben der MV-4-11-Zellen in die Gewebekulturhaube. Pipette 10 ml Zellen in ein 15 ml steriles Zentrifugenrohr. Nehmen Sie 10 l Zellen und mischen Sie sie mit 10 l Trypan Blue-Lösung. Pipette 10 l des Gemischs in den Zählschlitten und quantifizieren die Anzahl der lebenden Zellen mit einem automatischen Zellzähler. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.
    4. Waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS und zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.
    5. Setzen Sie die Zellen in IMDM-Medium (ohne FBS) für eine endgültige Zelldichte von 1x106 Zellen/ml aus.
      HINWEIS: Die Zellenanzahl der hier verwendeten Makrophagen kann angepasst werden.
  3. Transwell-Assay
    HINWEIS: Verwenden Sie für diesen Schritt ein Zellmigrations-Assay-Kit oder kaufen Sie die Reagenzien und legen Sie sie separat ein. Wählen Sie für MV-4-11-Zellen Transwell-Einsätze mit einer Porengröße von 5 m. Um die Makrophagenmigration zu erkennen, quantifizieren Sie direkt die Anzahl der Makrophagen in der unteren Kammer oder verwenden Sie kolorimetrische/fluorimetrische Methoden. Hier zeigen wir den Test mit der kolorimetrischen Methode.
    1. Bringen Sie die 24-Well-Platte, den Einsatz und die Reagenzien auf Raumtemperatur.
    2. Fügen Sie 250 L MV-4-11-Zellen, die oben zubereitet werden, in jeden Einsatz ein.
    3. Fügen Sie 400 l nur konditioniertes Medium/Medium (bei Nachtinkubation bei 37 °C, diese Proben dienen als Negativkontrolle) zu den unteren Kammern der 24-Well-Platte hinzu. Verwenden Sie für jede Tumorlinie oder -kontrolle dreifache Proben. Vermeiden Sie Blasen zwischen dem Einsatz und dem konditionierten Medium. Blasen hemmen Makrophagen daran, in die unteren Brunnen zu wandern.
    4. Inkubieren Sie die Platten in einem 37 °C Inkubator mit 5%CO2 für 4 h.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit kann eingestellt werden. Zellen, die in die unteren Kammern wandern, können unter dem Mikroskop gesehen werden.
    5. Tippen Sie vorsichtig auf den Einsatz an der Innenwand desselben Brunnens und entsorgen Sie den Einsatz. Da MV-4-11-Zellen in Suspension wachsen, ist hier keine Zellablösung oder Trypsin-Behandlung erforderlich.
    6. Die Zellen in den Brunnen 3 Mal vorsichtig pipette, um sie zu mischen. Übertragen Sie 225 l Zellsuspension auf eine schwarzwandige 96-Well-Platte, die für die Fluoreszenzmessung geeignet ist.
    7. Den CyQuant Farbstoff 1:75 mit 4x Lysepuffer verdünnen. Wirbel kurz und drehen Sie die Lösung. Fügen Sie jedem Bohrgut der 96-Well-Platte 75 l Lösung hinzu. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    8. Fluoreszenz mit dem 480/520 nm Filterset mit einem Fluoreszenzplattenleser lesen.
    9. Analysieren Sie Daten, indem Sie das Leerzeichen subtrahieren und sich auf die Kontrolltumorzelllinie normalisieren.

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Representative Results

Die Ergebnisse werden in der Regel über Balkendiagramme angezeigt (Beispiel in Abbildung 1). Stichproben mit hohen 480/520-Werten deuten darauf hin, dass die konditionierten Medien eine hohe Kapazität zur Rekrutierung von Makrophagen haben. Je nach experimentellem Bedarf können zusätzliche Kontrollen einbezogen werden. Zum Beispiel kann man neutralisierende Antikörper verwenden, um die konditionierten Medien zu behandeln, um die Makrophagen-Chemotaxis abzuschaffen, und den gleichen Test durchzuführen. Man kann auch zusätzliche Chemokine (d.h. CCL2) zu den konditionierten Medien hinzufügen, was als positive Kontrolle dient.

Figure 1
Abbildung 1: Konditionierte Medien aus U87-Zellen, die EGFR und EGFRvIII koexzieren, ziehen mehr Makrophagen an als U87-Zellen, die einen Kontrollvektor oder EGFR/EGFRvIII singly exezieren. Diese Zahl wurde von An, et al.7geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

In diesem Protokoll gibt es mehrere wichtige Schritte: 1) Auswahl der Transwell-Einfügung. Für die Zelllinie MV-4-11 funktionieren 5 m Transwell-Einsätze gut. Bei anderen Zelllinien, wie z. B. der häufig verwendeten Monozytenzelllinie THP-1, kann jedoch eine andere Porengröße besser funktionieren. 2) Da verschiedene Zelllinien mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten wachsen, ist es wichtig, die Lautstärke der konditionierten Medien an die Zellenzahlen anzupassen. Dazu können zellfreie Medien, die unter den gleichen experimentellen Bedingungen inkubiert werden, verwendet werden, um die konditionierten Medien zu verdünnen. 3) FBS enthält Zytokine. Es ist wichtig, serumfreies Medium zu verwenden, um MV-4-11-Zellen in der oberen Kammer auszusäen. Wenn hier FBS verwendet wird, kann manchmal die Zellmigration nicht beobachtet werden.

Forscher können diesen Test für verschiedene Anwendungen ändern. Beispielsweise können andere Tumorzellen, entweder primäre, vom Patienten abgeleitete Xenograft-Kultur oder Mauszellen, die im oben genannten Beispiel verwendete Hirntumorzelllinie ersetzen. Die Makrophagen-Zelllinie kann je nach Bedarf durch primäre Makrophagen oder Monozyten von Patienten oder Mäusen ersetzt werden. Ein wichtiger Punkt ist, dass die Forscher Zellen aus der gleichen Art auswählen müssen, um das beste Ergebnis zu gewährleisten. Obwohl der Makrophagen-Chemotaxis-Signalweg stark konserviert ist, kann die Variation der Proteinsequenz der Struktur zwischen verschiedenen Arten Komplikationsschichten hinzufügen, um experimentelle Ergebnisse zu interpretieren.

TAMs ziehen in der Krebsimmunologie immer mehr Aufmerksamkeit aufsich 13,14. Wie sich unterschiedliche genetische Veränderungen in den Tumoren auf die Rekrutierung von TAMs und anderen Immunzellen in der Tumormikroumgebung auswirken, werden noch untersucht. Durch die Änderung der Porengrößen der Transwell-Einsätze kann dieser Assay verwendet werden, um die Interaktion zwischen Tumor und anderen Immunzellen wie T-Zellen und NK-Zellen zu untersuchen. Ein Vorteil der Verwendung des Transwell-Assays zur Bewertung der Tumor-Immun-Interaktion ist, dass es leicht zu zeigen ist, wie bestimmte Onkogene/Mutationen die Rekrutierung einer bestimmten Art von Immunzellen beeinflussen. Darüber hinaus ist dieser Test für genomweite Bildschirme einfach zu skalieren. Dieser Test eröffnet Forschern zusätzliche Möglichkeiten, Tumor-Immunzell-Wechselwirkungen zu untersuchen. Zusätzlich kann dieser Assay verwendet werden, um zu untersuchen, wie die konditionierten Medien von Tumorzellen das Transkriptionsprofil der Makrophagen/anderer Immunzellen beeinflussen.

Alle Assays haben ihre Grenzen. Für diesen Test stammt das konditionierte Medium aus tumorzellen, die in vitro kultiviert werden. Die hier abgesonderten Chemokine könnten sich von denen unterscheiden, die von tumoren, die in vivo angebaut werden, abgesondert werden. Darüber hinaus unterscheidet sich die Makrophagen-Zelllinie von tumorinfiltrierenden Makrophagen, die eher phänotypisch und transkriptional vielfältig sind. Daher ist eine weitere Bestätigung der In-vitro-Befunde mit anderen In-vitro- und In-vivo-Methoden erforderlich.

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Disclosures

William A. Weiss ist Mitbegründer von StemSynergy Therapeutics. Zhenyi An hat nichts zu verraten.

Acknowledgments

Grant Support: Z. An received support from Alex es Lemonade Stand Foundation, American Brain Tumor Association, NIH T32CA108462 and Program for Breakthrough Biomedical Research, which is partially funded by the Sandler Foundation. W. Weiss wurde durch NIH-Stipendien R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103 unterstützt; Die Samuel G. Waxman Cancer Research Foundation; und den Stuhl Evelyn und Mattie Anderson.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 μm filtration cup Thermo fisher 566-0010
0.45 μm filter unit Millipore SLHA033SS
10 mL serological pipettes Olympus plastics 12-104
15 mL sterile centrifuge tubes Olympus plastics 28-103
1 mL pipette tip ART molecular bioproducts 2779-RI
2 mL aspirating pipet Falcon 357558
24-well plate Millipore ECM507 Part of ECM507, or can be purchased separately
4x lysis buffer Millipore ECM507 Part of ECM507, or can be purchased separately
5 μm Transwell insert Millipore ECM507 Part of ECM507, or can be purchased separately
75 cm2 flask Corning 430641U
Accutase Innovative cell technologies AT-104
B27 Gibco 12587-010
CyQuant Dye Millipore ECM507 Part of ECM507, or can be purchased separately
DMEM Gibco 11965-092
DMEM:F12 Gibco 10565-018
EGF Peprotech AF-100-15
FBS Gibco 26140
FGF Peprotech 100-18B
IMDM Gibco 12440-053
PBS Gibco 14190-144
Pen Strep Gibco 15140-122
Trypan blue Biorad 1450021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Krebsforschung Ausgabe 150 Makrophagen Tumor konditioniertes Medium Tumormikroumgebung Glioblastom der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor
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An, Z., Weiss, W. A. In Vitro Assay… More

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