Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

בתוך שיטת חוץ גופית כדי ללמוד גידול-מקרופאג אינטראקציה

Published: August 1, 2019 doi: 10.3791/59907
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Department of Neurology, University of California, San Francisco, 2Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center, University of California, San Francisco, 3Departments of Pediatrics and Neurological Surgery, University of California, San Francisco

Summary

מאמר זה מייצג שימושי בתוך מבחנה כדי להעריך את היכולת של המדיום הממוזג מתאי הגידול כדי למשוך מקרופאגים.

Abstract

מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) חשבון עבור אחוז גדול של תאים במסת הגידול עבור סוגים שונים של סרטן. Gliנובלסטומה (GBM), גידול ממאיר במוח ללא תרופה, יש עד מחצית ממסת הגידול TAMs. TAMs יכול להיות pro-tumoral וסרי או אנטי-מוסרי, בהתאם להפעלת גנים ספציפיים בתאים. מוטציות גנטיות בגידולים, באמצעות ויסות ציטוקין ביטוי, יכול להשפיע על גיוס של TAMs לסביבת מיקרו הגידול. כאן, אנו מתארים שיטת כמותית מבוססת התא כדי להעריך את הגיוס מקרופאג על ידי המדיום הממוזג מתאי הגידול. שיטת הפעולה הזאת משתמשת בקו מקרופאג cell האנושי MV-4-11 כדי לחקור את האטרקציה מקרופאג על ידי המדיום הממוזג מ glioblastoma, ומאפשר השתנות גבוהה ושינויים נמוכים. נתונים שנוצרו באמצעות שיטת העבודה הזאת יכולים לתרום להבנה טובה יותר של האינטראקציה בין הגידול לבין מיקרואקולוגיה של הגידול. שיטת דומה יכולה לשמש להערכת האינטראקציה בין תאי הגידול לבין תאים חיסוניים אחרים, כולל תאי T והרוצח הטבעי (NK) תאים.

Introduction

המקרופאגים הם התאים החיסוניים עם פנוטיic גבוהה ופונקציונלי טרוגניות1. הם משחקים תפקידים חשובים במערכות ההגנה של המארחים, תיקון רקמות, פיתוח והתקדמות הגידול1. TAMs הם מקרופאגים ב מיקרואקולוגיה של גידולים מוצקים. Tams מסוימים יכולים לקדם את צמיחת הגידול באמצעות מעכב T בתיווך התא מתווכת פעילות, מודוללדירוג מיקרוסביבה הגידול (tams), קידום אנגיוגנזה, פלישה גרורות2,3,4, 5. tams הם בין סוגי התאים הנפוצים ביותר ב tams ומספר גבוה יותר של tams בדרך כלל הקשורים הישרדות החולה גרוע יותר בסוגים רבים של גידולים מוצקים6. חתימות גנטיות נפרדות של תאי הגידול משפיעים על יכולתם לגייס מקרופאגים. ב-GBM, גידול אגרסיבי במוח עם תרופה לא, מקרופאגים יכולים לייצג עד חצי של מסת הגידול7. שיתוף הגברה של קולטן הגידול באפידרמיס (Egfr) ואת המוטציה שלה egfrviii היא נצפתה לעתים קרובות ב-GBM, אשר מקנה יתרונות גידול הגידול8. תאים שיתוף הביטוי EGFR ו EGFRvIII למשוך מקרופאגים יותר לעומת תאים ביטוי EGFR או EGFRvIII ביחידים7.

נוגדנים הם משפחה של ציטוקינים קטנים לשחק תפקידים משמעותיים בוויסות הרכב החיסונית ב tme6,9. תאים אנושיים לבטא יותר מ 50 ציטוקינים10. חדירת החיסון בגידולים ממומשת במידה רבה על ידי האינטראקציה בין ציטוקינים וקולטני ציטוקינים11. כל סוג של תאים חיסוניים מבטא קולטנים כימוקין ברורים/נוגדנים והוא יכול להיות מגויס על ידי תאים הפרשת נוגדנים/כימוקין קולטנים ספציפיים12. תאים סרטניים יכולים להגביר את הביטוי של נוגדנים מסוימים כדי לגייס תאים חיסוניים כגון TAMs, הרגולציה תאים T ותאי מדכא מיאלואיד נגזר (MDSCs)6. המצור על כימוקין ספציפיים מופרש על ידי גידולים יכולים להיות דרך מבטיחה חדירה מעכבים של תאים חיסוניים לתוך מסת הגידול.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר הערכה מתורבת של האינטראקציה מקרופאג הגידול, באמצעות מדיה ממוזג מתאי הגידול המכילים נוגדנים ו מקרופאג קווי תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה בינונית

  1. הכנת מדיום תאי גזע ללא הנסיוב
    1. הפשרת תוספת 50x B27, גורם הגידול באפידרמיס (EGF, 20 μg/mL ב 10 מ"מ חומצה אצטית עם 0.1% BSA), ואת גורם הצמיחה פיברוהפיצוץ (FGF, 20 μg/mL ב 10 מ"מ חומצה אצטית עם 0.1% BSA).
    2. להוסיף 500 μL של EGF (הריכוז הסופי 20 ng/mL), 500 μL של FGF (ריכוז סופי 20 ng/mL), 10 מ ל של 50x B27 ל 500 מ ל של בינונית שונה של נשר מדיום/תערובת מזינים F-12 (DMEM/F12) ו-5 מ ל של 100x פניצילין/סטרפטומיצין (עט הפוך את הבקבוק 4-6 פעמים כדי לערבב, מסנן לעקר באמצעות מ500 mL 0.1 יקרומטר הגביע לסינון. סמנו את הבקבוק והחנות ב -4 ° c.
      הערה: המדיום טובה לשימוש עד חודש ב -4 ° c.
  2. הכינו את מדיום התרבות MV-4-11: הוסף 50 mL של סרום בפרה העוברי (FBS) כדי 500 מ ל של Iscove שונה של המדיום של החברה (IMDM). הפוך את הבקבוק 4-6 פעמים כדי לערבב, מסנן לעקר באמצעות מ500 mL 0.1 יקרומטר הגביע לסינון. סמנו את הבקבוק והחנות ב -4 ° c.
    הערה: המדיום טובה לשימוש עד חודש ב -4 ° c.
  3. להכין את המדיום תחזוקה תא הגידול: להוסיף 50 mL של FBS כדי 500 mL של מדיום הנשר של דולבקה שונה (DMEM). הפוך את הבקבוק 4-6 פעמים כדי לערבב, מסנן לעקר באמצעות מ500 mL 0.1 יקרומטר הגביע לסינון. סמנו את הבקבוק והחנות ב -4 ° c.
    הערה: המדיום טובה לשימוש עד חודש ב -4 ° c.

2. הכנה לתא

יום 1:

  1. תאי גידול
  2. לחמם את המדיום תחזוקת תא הגידול (כמתואר בשלב 1.3) ב 37 מעלות צלזיוס אמבט מים 20 דקות.
  3. קח את U87 קפוא, U87: EGFR, U87: EGFRvIII ו U87: EGFR + EGFRvIII תאים ממיכל החנקן הנוזלי. הפשרת התאים באמבט המים 37 ° c במשך 2 דקות.
    התראה: היזהר כשאתה לוקח את התאים ממיכל החנקן הנוזלי. לבש כפפות עם הגנה תרמית ומשקפי בטיחות לפי הצורך.
  4. רסס את משטח התרבות רקמה עם 70% אתנול ולנגב 70% אתנול על פני השטח עם מגבות נייר.
  5. רסס את מבחנות קריוגניים המכילים תאים ובקבוק בינוני עם 70% אתנול, לנגב את 70% אתנול על פני השטח עם מגבות נייר, ולהביא אותם לתוך המכסה התרבותי של הרקמה.
  6. פיפטה 5 מ ל של מדיום לתחזוקת תאים סרטניים לתוך שפופרת צנטריפוגה סטרילית בגודל 15 מ ל. היפוך הצינור המכיל תאים סרטניים 4-6 פעמים כדי לערבב. מנקז את כל התאים. לצינור הצנטריפוגה של 15 מ ל להפוך את צינורית צנטריפוגה 4-6 פעמים כדי לערבב.
  7. צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . ומכה את הסופרנטאנט
  8. לשטוף את התאים עם 10 מ ל של פוספט מאגור מלוחים (PBS). צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . ומכה את הסופרנטאנט
  9. השהה מחדש את התאים בגודל 12 mL של המדיום תחזוקת תאי הגידול (כפי שמתואר בשלב 1.3). הפיפטה עולה ויורד 3-5 פעמים כדי לערבב. העבר את התאים לתוך בקבוקון תרבות תא T75.
  10. לגדל את התאים בחממה 37 ° c עם 5% CO2. לשים את המדיום תחזוקת תא הגידול בחזרה למקרר 4 ° c.

יום 2:

  1. . תבדקו את התאים מתחת למיקרוסקופ שנה את המדיום במידת הצורך. תאים גדלים בתוך מונאולייר בתרבות.

יום שלישי:

  1. התאגף MV-4-11 תאים
    1. לחמם את ה-MV-4-11 בינוני בתרבות (כמתואר בשלב 1.2) באמבט מים בגודל 37 של מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
      הערה: MV-4-11 ניתן לשנות את מקרופאגים ראשיים או קווי תא אחרים מקרופאג, בהתאם לצורך של המחקר הספציפי.
    2. קח את התאים הקפואים MV-4-11 ממיכל החנקן הנוזלי. הפשרת התאים באמבט מים בגודל 37 ° c במשך 2 דקות.
      זהירות: תיזהר כשאתה לוקח את התאים ממיכל החנקן הנוזלי. לבש כפפות עם הגנה תרמית ומשקפי בטיחות לפי הצורך.
    3. רסס את משטח התרבות רקמה עם 70% אתנול ולנגב 70% אתנול על פני השטח עם מגבות נייר.
    4. רסס את מבחנות קריוגניים המכילים תאים ובקבוק בינוני עם 70% אתנול, לנגב את 70% אתנול על פני השטח עם מגבות נייר, ולהביא אותם לתוך המכסה התרבותי של הרקמה.
    5. פיפטה 5 מ ל של MV-4-11 תרבות בינונית (כמתואר בשלב 1.2) לתוך שפופרת צנטריפוגה סטרילית של 15 מ"ל. היפוך הצינור המכיל תאים סרטניים 4-6 פעמים כדי לערבב. מנקז את כל התאים. לצינור הצנטריפוגה של 15 מ ל להפוך את צינורית צנטריפוגה 4-6 פעמים כדי לערבב.
    6. צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . ומכה את הסופרנטאנט
    7. לשטוף את התאים 10 מ ל של PBS ו צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . ומכה את הסופרנטאנט
    8. השהה מחדש את התאים ב-12 mL של מדיום התרבות MV-4-11 (כמתואר בשלב 1.2). פיפטה בעדינות למעלה ולמטה 3-5 פעמים כדי לערבב. העבר את התאים לתוך בקבוקון תרבות תא T75.
    9. לגדל את התאים בחממה 37 ° c עם 5% CO2.
  2. פיצול תאים סרטניים
    1. לחמם את בינונית תא גזע ללא סרום (כפי שמתואר בשלב 1.1) באמבט מים 37 ° c במשך 20 דקות.
    2. רסס את משטח התרבות רקמה עם 70% אתנול ולנגב 70% אתנול על פני השטח עם מגבות נייר. . קח את הפתרון לניתוק התאים מהמקרר לרסס את בקבוקי הניתוק התא מדיום פתרון עם 70% אתנול, לנגב את 70% אתנול על פני השטח עם מגבות נייר ולהביא אותם לתוך המכסה התרבותי של הרקמה.
      הערה: אל תחמם מראש את פתרון התנתקות התא של המאהבורסה.
    3. להעביר את התרבות תא הגידול מן החממה לתוך השכונה תרבות רקמה. מוסיף למדיום, להוסיף 2 מ ל פתרון התנתקות התא לתוך הבקבוקון.
      הערה: שטיפה עם PBS לפני הוספת המאאז היא אופציונלית כאן.
    4. . הגדר את הבקבוקון במכסה המנוע תבדוק אם תאי הגידול. מסתובבים כל דקה ברגע שתאי הגידול מסתובבים, מקישים בעדינות על צד הבקבוקון כדי לעזור לתאים להתנתק מהבקבוקון.
    5. פיפטה 8 מ ל של בינונית תא גזע ללא סרום לתוך הבקבוקון, הצינור למעלה ולמטה 3 פעמים כדי לערבב, ולהעביר את התאים לתוך 15 מ"ל שפופרת צנטריפוגה סטרילית. צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . ומכה את הסופרנטאנט
    6. שטוף את התאים ב 10 מ ל של PBS. הפיפטה עולה ויורד 3-5 פעמים כדי לערבב. צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . ומכה את הסופרנטאנט
      הערה: שלב זה הוא אופציונלי.
    7. להשעות את התאים ב 10 מ ל של בינונית תא גזע ללא סרום (כפי שמתואר בשלב 1.1). הפיפטה עולה ויורד 3-5 פעמים כדי לערבב. לקחת 10 μL של התאים ולערבב עם 10 μL של פתרון כחול טרימין. פיפטה 10 μL של התערובת לתוך שקופית ספירה, מכמת את מספר התאים החיים באמצעות מונה התא אוטומטי.
    8. כוונן את צפיפות התא כדי 2.5 x 105 תאים/mL עם סרום ללא מדיום תא גזע (כפי שמתואר בשלב 1.1), ואת הזרע 2 מ ל של התאים לתוך כל באר של 6-היטב התאים לתרבות התא. עבור כל סוג של תאים, זרעי 3 בארות (דגימת טרילקאט). באותו זמן, להכין 6 בארות עם 2 מ ל של סרום ללא מדיום תאי גזע בלבד (ללא תאים).
      הערה: ניתן להשתמש בדגימות אלה: 1) כפקדים שליליים ו-2) להתאמת אמצעי אחסון בינוניים ממוזגים המבוססים על מספרי תאים.
    9. שים את הצלחות 6-היטב בחממה 37 ° c עם 5% CO2. אפשר לתאים לצמוח 24 שעות ביממה.

3. במקרופאג האטרקציה החוץ גופית

  1. הכנת מדיה ממוזגת
    1. לחמם את המדיום תחזוקת תא הגידול (כמתואר בשלב 1.3) ב 37 מעלות צלזיוס אמבט מים 20 דקות.
    2. רסס את משטח התרבות רקמה עם 70% אתנול ולנגב 70% אתנול על פני השטח עם מגבות נייר. . קח את הפתרון לניתוק התאים מהמקרר לרסס את הבקבוקים של המדיום ואת הפתרון הניתוק התא עם 70% אתנול, לנגב את 70% אתנול על פני השטח עם מגבות נייר ולהביא אותם לתוך המכסה התרבותי של הרקמה.
    3. . קח את הצלחות מהאינקובטור פיפטה בזהירות את המדיה הממוזגת ל -15 מנורות צנטריפוגה סטריליות. . שימו את הצינורות על הקרח פיפטה את התקשורת ב-"תקשורת בלבד" לתוך שפופרת צנטריפוגה סטרילית בהפרדה של 15 מ"ל.
      הערה: לפני שלב זה, הקפד לבדוק תחת המיקרוסקופ כדי לראות אם התאים לצרף. אם לא, ניתן להשתמש בלוחות מצופים בשלב 2.4.8 כדי לאפשר הצמדה טובה יותר או לכלול את התאים הצפים בשלב הספירה.
    4. הוסף 0.5 mL של פתרון התנתקות התא לתוך כל טוב של הצלחת 6-היטב. תבדוק אם תאי הגידול. מסתובבים כל דקה ברגע שתאי הגידול מסתובבים, מקישים בעדינות על צד הצלחת כדי לעזור לתאים להתנתק.
    5. פיפטה 2.5 mL של שמירה על תאי הגידול בינונית לתוך הבאר, הצינורות למעלה ולמטה 3 פעמים כדי לערבב ולהעביר את התאים לתוך 15 מ"ל צינור הצנטריפוגה סטרילי. לקחת 10 μL של התאים ולערבב עם 10 μL של פתרון כחול טרימין. פיפטה 10 μL של התערובת לתוך שקופית ספירה ולכמת את מספר התאים החיים באמצעות מונה התא אוטומטי.
    6. כוונן את עוצמת הקול של המדיה הממוזגת לפי מספר התאים באמצעות סרום בינוני תאי גזע חופשי (37 מעלות בדגירה של ° c). לדוגמה, אם גם יש 3x כמו תאים חיים רבים כמו הבאר עם המספר הנמוך ביותר של תאים, לדלל את המדיה הממוזגת 1:3. שלב זה משמש לשליטה בהפרש הנגרם על-ידי קצב הפצת תאים.
      הערה: הסיבה להשתמש סרום חינם תא גזע בינונית עם 37 ° c דגירה הלילה היא לשלוט על השינוי האפשרי בתקשורת עם ממושך 37 ° c חשיפה.
    7. סנן את המדיה הממוזגת באמצעות מסנני 0.45 יקרומטר. הניחו את המדיה הממוזגת על הקרח.
      הערה: שלב זה מסיר תאים ופסולת תא במדיה הממוזגת.
  2. הכנת תאים MV-4-11
    1. לחמם את מדיום IMDM (ללא FBS) באמבט מים 37 ° c עבור 20 דקות.
    2. רסס את משטח התרבות רקמה עם 70% אתנול ולנגב 70% אתנול על פני השטח עם מגבות נייר. לרסס את בקבוק בינוני עם 70% אתנול, לנגב 70% אתנול על פני השטח עם מגבות נייר ולהביא אותם לתוך המכסה התרבותי של הרקמה.
    3. קח את הבקבוקון של תאים MV-4-11 לתוך המכסה של תרבות הרקמה. פיפטה 10 מ ל של תאים לתוך שפופרת צנטריפוגה סטרילית בעלת 15 מ ל. לקחת 10 μL של תאים ולערבב עם 10 μL של פתרון כחול טרימין. פיפטה 10 μL של התערובת לתוך שקופית ספירה ולכמת את מספר התאים החיים באמצעות מונה התא אוטומטי. צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 5min ב 4 ° c. . ומכה את הסופרנטאנט
    4. לשטוף את התאים עם 10 מ ל של PBS ו צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . ומכה את הסופרנטאנט
    5. השהה מחדש את התאים באמצעי IMDM (ללא FBS) עבור צפיפות תא סופית של 1x106 תאים/mL.
      הערה: ניתן לכוונן את מספר התאים של מקרופאגים שבשימוש.
  3. שיטת טרנסוטוב
    הערה: עבור שלב זה, השתמש בערכת שיטת העברת תאים או רכוש את הריאגנטים והכנס בנפרד. עבור MV-4-11 תאים, בחר transwell מוסיף עם גודל 5 יקרומטר הנקבוביות. כדי לזהות הגירה מקרופאג, באופן ישיר לכמת את מספר מקרופאגים בתא התחתון או להשתמש בשיטות צביעה/שיטות פלוורימטרית. כאן אנו מדגימים את השיטה בשיטת הצביעה.
    1. הביאו את הצלחת 24-היטב, את התוספת ואת הריאגנטים לטמפרטורת החדר.
    2. הוסף 250 μL של תאים MV-4-11 שהוכנו לעיל לכל הוספה.
    3. הוסף 400 μL של בינוני/בינוני ממוזג בלבד (עם הדגירה של לילה ב-37 ° c, דגימות אלה משמשות כשליטה שלילית) לתאים התחתונים של הצלחת 24. עבור כל קו גידול או שליטה, השתמש בדגימות טרילקאט. הימנע מבועות בין ההכנסה לבינונית הממוזגת. בועות לעכב מקרופאגים לעבור בארות התחתון.
    4. מודטה את לוחיות בחממה 37 ° c עם 5% CO2 עבור 4 h.
      הערה: ניתן לכוונן את זמן הדגירה. תאים הגירה לתוך התאים התחתונים ניתן לראות מתחת למיקרוסקופ.
    5. הקש בעדינות על ההוספה על הקיר הפנימי של אותה הבאר וביטול ההוספה. כמו MV-4-11 תאים לצמוח בהשעיה, ניתוק התא פתרון או טריפסין טיפול אינו נחוץ כאן.
    6. מצנעת בעדינות את התאים בבארות למעלה ולמטה 3 פעמים כדי לערבב. העברת 225 μL של השעיית התא לצלחת שחור-חומה 96-באר מתאים למדידה פלורסנט.
    7. לדלל את הצבע CyQuant 1:75 עם מאגר פירוק 4 x. מערבולת לזמן קצר ולסובב את הפתרון. הוסף 75 μL של פתרון לכל טוב של הצלחת 96-באר. הטמפרטורה 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. קרא את הקרינה הפלואורסצנטית באמצעות מסנן nm 480/520 עם קורא לוחית קרינה.
    9. ניתוח נתונים על-ידי חיסור הריק והנורמליזציה לקו התאים של הגידול בפקד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות מוצגות בדרך כלל באמצעות תרשימי עמודות (דוגמה המוצגת באיור 1). דגימות עם 480/520 גבוה ערכים עולה כי המדיה הממוזגת יש קיבולת גבוהה לגייס מקרופאגים. בהתאם לצורך ניסיוני, ניתן לכלול פקדים נוספים. לדוגמה, ניתן להשתמש בנטרול נוגדנים כדי לטפל באמצעי התקשורת הממוזגים כדי לבטל את המקרופאג מוניות, ולבצע את אותה הצורה. ניתן גם להוסיף נוגדנים נוספים (כלומר, CCL2) למדיה הממוזגת, המשמשת כשליטה חיובית.

Figure 1
איור 1: מדיה ממוזג מ U87 תאים ביטוי שיתוף EGFR ו EGFRvIII למשוך מקרופאגים יותר מאשר U87 תאים ביטוי וקטור שליטה, או EGFR/EGFRvIII ביחידים. דמות זו השתנתה מ-An, ואח '7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול זה, קיימים מספר שלבים מרכזיים: 1) הבחירה של הכנסת הטרנסטוב. עבור הקו הנייד MV-4-11, 5 יקרומטר טרנסטוב מוסיף עבודה היטב. עם זאת, עבור קווי תאים אחרים כגון קו מונוציט בשימוש נפוץ THP-1, גודל נקבובית שונה עשוי לעבוד טוב יותר. 2) כאשר קווי תאים שונים גדלים במהירויות שונות, חשוב לכוונן את עוצמת המדיה הממוזגת בהתאם למספרי התאים. למטרה זו, ניתן להשתמש במדיה נטולת-תאים הניתנת לשימוש באותם תנאים ניסיוניים כדי לדלל את המדיה הממוזגת. 3) מכיל ציטוקינים. חשוב להשתמש במדיום ללא סרום כדי seed MV-4-11 תאים בחדר העליון. אם נעשה שימוש ב-FBS כאן, לעתים לא ניתן לצפות בהעברת תאים.

חוקרים יכולים לשנות את האפשרות הזאת עבור יישומים שונים. לדוגמה, תאים סרטניים אחרים, או העיקרי החולה הנגזר תרבות מבע, או תאי העכבר יכול להחליף את קו הגידול במוח התאים בשימוש בדוגמה הנ ל. קו התא מקרופאג יכול להיות מוחלף על ידי מקרופאגים הראשי או מונוציטים מחולים או עכברים בהתאם לצורך הספציפי. נקודה חשובה אחת היא כי החוקרים צריכים לבחור תאים מאותו מינים כדי להבטיח את התוצאה הטובה ביותר. למרות מסלול כימוטקציה מקרופאג הוא שימור מאוד, הווריאציה של רצף החלבון של המבנה בין מינים שונים עשויה להוסיף שכבות של סיבוך כדי לפרש את התוצאות הנסיוניות.

Tams מושכים יותר ויותר תשומת לב באימונולוגיה סרטן13,14. כיצד שינויים גנטיים שונים בגידולים משפיעים על גיוס של TAMs ותאי החיסון אחרים בסביבת מיקרו הגידול עדיין מחכה למחקרים נוספים. על ידי שינוי גדלי נקבובית של מוסיף Transwell הוא, שיטת זה ניתן להשתמש כדי ללמוד אינטראקציה בין הגידול לבין תאים חיסוניים אחרים כגון תאים T ו-NK תאים. אחד היתרונות של שימוש שיטת Transwell כדי להעריך את הגידול-האינטראקציה החיסונית היא כי קל להדגים כיצד אונגנים ספציפיים/מוטציות משפיעות על גיוס של סוג מסוים של תאים חיסוניים. יתר על כן, שיטת זה קל לשנות את הרמה עבור מסכי הגנום כלל. שיטת הפעולה פותחת אפשרויות נוספות לחוקרים למחקר של אינטראקציות תאים החיסון לגידול. בנוסף, שיטת זה ניתן להשתמש כדי ללמוד כיצד התקשורת הממוזגת מתאי הגידול להשפיע על הפרופיל תמלול של מקרופאגים/תאים חיסוניים אחרים.

. כל מה שאומר יש מגבלות לצורך זה, המדיום הממוזג הוא מתאי גידול מתורבתים בתוך מבחנה. נוגדנים המופרש כאן עשוי להיות שונה מאלה שמופרשים על-ידי גידולים שגדלו בvivo. בנוסף, קו התא מקרופאג שונה מן הגידול מקרופאגים הסרטניים, אשר הם פנופי יותר בדרך כלל ומגוונות. לפיכך, יש צורך באישור נוסף של ממצאים בעלי מבחנה באמצעות אחרים בתוך מבחנה ובשיטות vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ויליאם א. וייס הוא ממייסדי Therapeutics. . לzhenyi אין שום דבר לגלות

Acknowledgments

גרנט תמיכה: Z התקבלה תמיכה מתוך הקרן לימונדה של אלכס לעמוד, האגודה האמריקנית לגידול במוח, NIH T32CA108462 ותוכנית למחקר ביורפואי פריצת דרך, אשר ממומנת חלקית על ידי קרן סנדלר. וייס נתמך על ידי מענקי NIH R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103; הקרן לחקר הסרטן ע שמואל וקסמן; והיו ר אוולין ומאטי אנדרסון

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 μm filtration cup Thermo fisher 566-0010
0.45 μm filter unit Millipore SLHA033SS
10 mL serological pipettes Olympus plastics 12-104
15 mL sterile centrifuge tubes Olympus plastics 28-103
1 mL pipette tip ART molecular bioproducts 2779-RI
2 mL aspirating pipet Falcon 357558
24-well plate Millipore ECM507 Part of ECM507, or can be purchased separately
4x lysis buffer Millipore ECM507 Part of ECM507, or can be purchased separately
5 μm Transwell insert Millipore ECM507 Part of ECM507, or can be purchased separately
75 cm2 flask Corning 430641U
Accutase Innovative cell technologies AT-104
B27 Gibco 12587-010
CyQuant Dye Millipore ECM507 Part of ECM507, or can be purchased separately
DMEM Gibco 11965-092
DMEM:F12 Gibco 10565-018
EGF Peprotech AF-100-15
FBS Gibco 26140
FGF Peprotech 100-18B
IMDM Gibco 12440-053
PBS Gibco 14190-144
Pen Strep Gibco 15140-122
Trypan blue Biorad 1450021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, Y., Cao, X. The origin and function of tumor-associated macrophages. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 1-4 (2015).
  2. Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, (2014).
  3. Coussens, L. M., Zitvogel, L., Palucka, A. K. Neutralizing tumor-promoting chronic inflammation: a magic bullet. Science. 339 (6117), 286-291 (2013).
  4. Tsukamoto, H., et al. Combined Blockade of IL6 and PD-1/PD-L1 Signaling Abrogates Mutual Regulation of Their Immunosuppressive Effects in the Tumor Microenvironment. Cancer Research. 78 (17), 5011-5022 (2018).
  5. Borgoni, S., et al. Depletion of tumor-associated macrophages switches the epigenetic profile of pancreatic cancer infiltrating T cells and restores their anti-tumor phenotype. Oncoimmunology. 7 (2), e1393596 (2018).
  6. Argyle, D., Kitamura, T. Targeting Macrophage-Recruiting Chemokines as a Novel Therapeutic Strategy to Prevent the Progression of Solid Tumors. Frontiers in Immunology. 9, 2629 (2018).
  7. An, Z., et al. EGFR cooperates with EGFRvIII to recruit macrophages in glioblastoma. Cancer Research. , (2018).
  8. Fan, Q. W., et al. EGFR phosphorylates tumor-derived EGFRvIII driving STAT3/5 and progression in glioblastoma. Cancer Cell. 24 (4), 438-449 (2013).
  9. Jacquelot, N., Duong, C. P. M., Belz, G. T., Zitvogel, L. Targeting Chemokines and Chemokine Receptors in Melanoma and Other Cancers. Frontiers in Immunology. 9, 2480 (2018).
  10. Arimont, M., et al. Structural Analysis of Chemokine Receptor-Ligand Interactions. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (12), 4735-4779 (2017).
  11. Turner, M. D., Nedjai, B., Hurst, T., Pennington, D. J. Cytokines and chemokines: At the crossroads of cell signalling and inflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (11), 2563-2582 (2014).
  12. Sokol, C. L., Luster, A. D. The chemokine system in innate immunity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (5), (2015).
  13. Pathria, P., Louis, T. L., Varner, J. A. Targeting Tumor-Associated Macrophages in Cancer. Trends in Immunology. 40 (4), 310-327 (2019).
  14. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 399-416 (2017).

Tags

סרטן מחקר סוגיה 150 מקרופאג גידול בינוני ממוזג מיקרוסביבה הגידול גלינובלסטומה קולטן גורם הגידול באפידרמיס
בתוך שיטת חוץ גופית כדי ללמוד גידול-מקרופאג אינטראקציה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

An, Z., Weiss, W. A. In Vitro Assay… More

An, Z., Weiss, W. A. In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction. J. Vis. Exp. (150), e59907, doi:10.3791/59907 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter