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Cancer Research

इन विट्रो परख से अध्ययन ट्यूमर-मैक्रोफेज इंटरेक्शन

Published: August 1, 2019 doi: 10.3791/59907
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Department of Neurology, University of California, San Francisco, 2Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center, University of California, San Francisco, 3Departments of Pediatrics and Neurological Surgery, University of California, San Francisco

Summary

यह लेख मैक्रोफेज को आकर्षित करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं से वातानुकूलित माध्यम की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए इन विट्रो परख में एक उपयोगी का प्रतिनिधित्व करता है।

Abstract

ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज (TAMs) कैंसर के विभिन्न प्रकार के लिए ट्यूमर द्रव्यमान में कोशिकाओं का एक बड़ा प्रतिशत के लिए खाते. ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम), कोई इलाज नहीं के साथ एक घातक मस्तिष्क ट्यूमर, एक आधा ट्यूमर जन TAMs अप करने के लिए है। TAMs समर्थक ट्यूमर या विरोधी tumoral हो सकता है, कोशिकाओं में विशिष्ट जीन के सक्रियण पर निर्भर करता है. ट्यूमर में आनुवंशिक उत्परिवर्तन, cytokine अभिव्यक्ति को विनियमित करने के माध्यम से, ट्यूमर microenvironment के लिए TAMs की भर्ती को प्रभावित कर सकते हैं. यहाँ, हम ट्यूमर कोशिकाओं से वातानुकूलित माध्यम द्वारा मैक्रोफेज भर्ती का आकलन करने के लिए एक मात्रात्मक सेल आधारित परख का वर्णन करते हैं। इस परख ग्लियोब्लास्टोमा से वातानुकूलित माध्यम द्वारा मैक्रोफेज आकर्षण का अध्ययन करने के लिए मानव मैक्रोफेज सेल लाइन MV-4-11 का उपयोग करता है, उच्च प्रजननक्षमता और कम परिवर्तनशीलता के लिए अनुमति देता है। इस परख के साथ उत्पन्न डेटा ट्यूमर और ट्यूमर microenvironment के बीच बातचीत की एक बेहतर समझ के लिए योगदान कर सकते हैं. इसी तरह की परख ट्यूमर कोशिकाओं और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, टी कोशिकाओं और प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं सहित.

Introduction

मैक्रोफेज प्रतिरक्षा कोशिकाएं होती हैं जिनमें उच्च लक्षणीय और कार्यात्मक विषमता1होती है . वे मेजबान रक्षा प्रणाली, ऊतक की मरम्मत, विकास और ट्यूमर प्रगति1में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। TAMs ठोस ट्यूमर के microenvironment में मैक्रोफेज हैं. कुछ TAMs टी सेल मध्यस्थता cytotoxic गतिविधि को बाधित करने के माध्यम से ट्यूमर के विकास को बढ़ावा देने, ट्यूमर microenvironment (TME), एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा देने, आक्रमण और मेटास्टेसिस2,3,4, 5. टीएएम टी एम ई में सबसे प्रचुर मात्रा में सेल प्रकारों में से एक है और टीएएम की अधिक संख्या आम तौर पर कई प्रकार के ठोस ट्यूमर 6 में बदतर रोगी के जीवित रहने से संबंधित होतीहै. ट्यूमर कोशिकाओं के विशिष्ट आनुवंशिक हस्ताक्षर मैक्रोफेज की भर्ती करने की उनकी क्षमता को प्रभावित करते हैं। जीबीएम में, कोई इलाज के साथ एक आक्रामक मस्तिष्क ट्यूमर, मैक्रोफेज ट्यूमर द्रव्यमान7के एक आधे तक का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। एपिडर्मल विकास कारक रिसेप्टर (ईजीएफआर) और इसके truncation उत्परिवर्ती EGFRvIII के सह-प्रवर्धन अक्सर जीबीएम में मनाया जाता है, जो ट्यूमर विकास लाभप्रदान 8. कोशिकाओं सह व्यक्त EGFR और EGFRvIII अधिक मैक्रोफेज को आकर्षित करने की तुलना में व्यक्त कोशिकाओं EGFR या EGFRvIII singly7.

चेमोकिन छोटे साइटोकिन्स का एक परिवार है जो टी एम ई6,9में प्रतिरक्षा संरचना को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं . मानव कोशिकाओं 50 से अधिक साइटोकिन्स10व्यक्त करते हैं। ट्यूमर में प्रतिरक्षा घुसपैठ काफी हद तक साइटोकिन्स और साइटोकिन रिसेप्टर्स11के बीच बातचीत से महसूस किया जाता है . प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रत्येक प्रकार के विशिष्ट chemokine रिसेप्टर्स / chemokines व्यक्त करता है और विशिष्टchemokines स्रावित कोशिकाओं द्वारा भर्ती किया जा सकता / कैंसर कोशिकाओं को कुछ chemokines की अभिव्यक्ति में वृद्धि करने के लिए इस तरह के TAMs के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती कर सकते हैं, नियामक टी कोशिकाओं और माइलॉयड व्युत्पन्न दमन कोशिकाओं (MDSCs)6. ट्यूमर द्वारा स्रावित विशिष्ट chemokine की नाकाबंदी ट्यूमर द्रव्यमान में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ को रोकने में एक आशाजनक तरीका हो सकता है।

यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि ट्यूमर-मैक्रोफेज बातचीत के इन विट्रो मूल्यांकन में अनुमति देता है का वर्णन, chemokines और मैक्रोफेज सेल लाइनों युक्त ट्यूमर कोशिकाओं से वातानुकूलित मीडिया का उपयोग कर.

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Protocol

1. मध्यम तैयारी

  1. सीरम मुक्त स्टेम सेल माध्यम की तैयारी
    1. Thaw 50x B27 पूरक, epidermal वृद्धि कारक (EGF, 20 $g/m L में 10 m एसिटिक एसिड के साथ 0.1% बीएसए), और फाइब्रोब्लास्ट वृद्धि कारक (FGF, 20 डिग्री ग्राम /
    2. EGF के 500 $L जोड़ें (अंतिम एकाग्रता 20 ng/mL), FGF के 500 डिग्री एल (अंतिम एकाग्रता 20 एनजी/एमएल), 10 एमएल के 50x B27 करने के लिए 500 एमएल Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम / मिश्रण करने के लिए बोतल 4-6 बार उलटें, एक 500 एमएल 0.1 m निस्पंदन कप के माध्यम से बाँझ फिल्टर। बोतल को चिह्नित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: माध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने के लिए उपयोग करने के लिए अच्छा है।
  2. MV-4-11 संस्कृति माध्यम तैयार: भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 500 एमएल करने के लिए जोड़ें Iscove के संशोधित Dulbecco के मध्यम (IMDM). मिश्रण करने के लिए बोतल 4-6 बार उलटें, एक 500 एमएल 0.1 m निस्पंदन कप के माध्यम से बाँझ फिल्टर। बोतल को चिह्नित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: माध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने के लिए उपयोग करने के लिए अच्छा है।
  3. ट्यूमर सेल रखरखाव माध्यम तैयार करें: Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 500 एमएल करने के लिए FBS के 50 एमएल जोड़ें। मिश्रण करने के लिए बोतल 4-6 बार उलटें, एक 500 एमएल 0.1 m निस्पंदन कप के माध्यम से बाँझ फिल्टर। बोतल को चिह्नित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: माध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने के लिए उपयोग करने के लिए अच्छा है।

2. सेल तैयारी

दिन 1:

  1. ट्यूमर कोशिकाओं thawing
  2. ट्यूमर सेल रखरखाव माध्यम को गर्म (जैसा कि चरण 1.3 में वर्णित है) 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में।
  3. जमे हुए U87, U87: EGFR, U87: EGFRvIII और U87: तरल नाइट्रोजन टैंक से EGFR + EGFRvIII कोशिकाओं ले लो. 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान पर कोशिकाओं thaw.
    चेतावनी: तरल नाइट्रोजन टैंक से कोशिकाओं को लेते समय सावधान रहें। जरूरत के रूप में थर्मल संरक्षण और सुरक्षा काले चश्मे के साथ दस्ताने पहनें।
  4. 70% इथेनॉल के साथ ऊतक संस्कृति हुड सतह स्प्रे और कागज तौलिए के साथ सतह पर 70% इथेनॉल पोंछ।
  5. कोशिकाओं और 70% इथेनॉल के साथ मध्यम बोतल युक्त क्रायोजेनिक शीशियों स्प्रे, कागज तौलिए के साथ सतह पर 70% इथेनॉल पोंछ, और उन्हें ऊतक संस्कृति हुड में ले आओ.
  6. पिपेट 5 एमएल ट्यूमर सेल रखरखाव माध्यम के एक 15 एमएल बाँझ अपकेंद्रण ट्यूब में। मिश्रण करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं युक्त ट्यूब 4-6 बार उलटा। पिपेट सभी कोशिकाओं को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पिपेट करें। अपकेंद्रित्र ट्यूब को 4-6 बार मिलाने के लिए उलटा करें।
  7. कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। अधिनान्त को प्रेरित करें।
  8. कोशिकाओं को 10 एमएल फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (पीबीएस) से धोएं। कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। अधिनान्त को प्रेरित करें।
  9. ट्यूमर सेल रखरखाव माध्यम के 12 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित (चरण 1.3 में वर्णित के रूप में). मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे 3-5 बार पिपेट। कोशिकाओं को एक T75 सेल संस्कृति फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
  10. 5% ब्व्2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को बढ़ाएं। ट्यूमर सेल रखरखाव माध्यम 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज के लिए वापस रखो।

दिन 2:

  1. माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की जाँच करें. यदि आवश्यक हो तो माध्यम बदलें। कोशिकाओं को संस्कृति में एक मोनोलेयर में विकसित होना चाहिए।

दिन 3:

  1. Thawing MV-4-11 कोशिकाओं
    1. MV-4-11 संस्कृति माध्यम गर्म (के रूप में कदम 1.2 में वर्णित) 20 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान पर.
      नोट: MV-4-11 को विशिष्ट अध्ययन की आवश्यकता के आधार पर प्राथमिक मैक्रोफेज या अन्य मैक्रोफेज सेल लाइनों में बदला जा सकता है।
    2. तरल नाइट्रोजन टैंक से जमे हुए MV-4-11 कोशिकाओं ले लो. 2 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान पर कोशिकाओं thaw.
      चेतावनी: तरल नाइट्रोजन टैंक से कोशिकाओं को लेते समय सावधान रहें। जरूरत के रूप में थर्मल संरक्षण और सुरक्षा काले चश्मे के साथ दस्ताने पहनें।
    3. 70% इथेनॉल के साथ ऊतक संस्कृति हुड सतह स्प्रे और कागज तौलिए के साथ सतह पर 70% इथेनॉल पोंछ।
    4. कोशिकाओं और 70% इथेनॉल के साथ मध्यम बोतल युक्त क्रायोजेनिक शीशियों स्प्रे, कागज तौलिए के साथ सतह पर 70% इथेनॉल पोंछ, और उन्हें ऊतक संस्कृति हुड में ले आओ.
    5. Pipette 5 एमएल MV-4-11 संस्कृति माध्यम (के रूप में चरण 1.2 में वर्णित) एक 15 एमएल बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में. मिश्रण करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं युक्त ट्यूब 4-6 बार उलटा। पिपेट सभी कोशिकाओं को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पिपेट करें। अपकेंद्रित्र ट्यूब को 4-6 बार मिलाने के लिए उलटा करें।
    6. कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। अधिनान्त को प्रेरित करें।
    7. पीबीएस के 10 एमएल में कोशिकाओं को धो लें और कोशिकाओं को 200 x ग्राम पर 5 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रण करें। अधिनान्त को प्रेरित करें।
    8. MV-4-11 संस्कृति माध्यम के 12 एमएल में कोशिकाओं को पुन: असाइन करें (जैसा कि चरण 1-2 में वर्णित है)। मिश्रण करने के लिए धीरे से पिपेट ऊपर और नीचे 3-5 बार। कोशिकाओं को एक T75 सेल संस्कृति फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
    9. 5% ब्व्2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को बढ़ाएं।
  2. ट्यूमर कोशिकाओं को विभाजित करना
    1. सीरम मुक्त स्टेम सेल मध्यम गर्म (के रूप में कदम 1.1 में वर्णित) 20 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान पर.
    2. 70% इथेनॉल के साथ ऊतक संस्कृति हुड सतह स्प्रे और कागज तौलिए के साथ सतह पर 70% इथेनॉल पोंछ। फ्रिज से सेल टुकड़ी समाधान ले लो. 70% इथेनॉल के साथ मध्यम और सेल टुकड़ी समाधान बोतलों स्प्रे, कागज तौलिए के साथ सतह पर 70% इथेनॉल पोंछ और उन्हें ऊतक संस्कृति हुड में ले आओ.
      नोट: accutase सेल टुकड़ी समाधान पूर्व गर्म मत करो.
    3. ऊतक संस्कृति हुड में इनक्यूबेटर से ट्यूमर सेल संस्कृति स्थानांतरण। माध्यम को प्रेरित करें, फ्लास्क में सेल टुकड़ी के 2 एमएल जोड़ें।
      नोट: accutase जोड़ने से पहले पीबीएस के साथ rinsing यहाँ वैकल्पिक है.
    4. हुड में फ्लास्क सेट करें। जांच करें कि क्या ट्यूमर कोशिकाओं को हर मिनट दौर. एक बार ट्यूमर कोशिकाओं को दौर, धीरे कोशिकाओं फ्लास्क से अलग करने में मदद करने के लिए फ्लास्क के पक्ष नल।
    5. पिपेट 8 एमएल सीरम मुक्त स्टेम सेल माध्यम के फ्लास्क में, पिपेट अप और नीचे 3 बार मिश्रण करने के लिए, और एक 15 एमएल बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में कोशिकाओं को स्थानांतरित। कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। अधिनान्त को प्रेरित करें।
    6. पीबीएस के 10 एमएल में कोशिकाओं को धो लें। मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे 3-5 बार पिपेट। कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। अधिनान्त को प्रेरित करें।
      नोट: यह चरण वैकल्पिक है।
    7. सीरम मुक्त स्टेम सेल माध्यम के 10 एमएल में कोशिकाओं को पुन: असाइन करें (जैसा कि चरण 1-1 में वर्णित है)। मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे 3-5 बार पिपेट। कोशिकाओं के 10 डिग्री सेल्सियस लीजिये और ट्राइपैन ब्लू विलयन के 10 डिग्री सेल्सियस के साथ मिला लें। पिपेट 10 डिग्री मिश्रण की गिनती स्लाइड में, एक स्वत: सेल काउंटर का उपयोग कर जीवित सेल संख्या मात्रा निर्धारित.
    8. सीरम मुक्त स्टेम सेल माध्यम के साथ 2.5 x 105 कोशिकाओं/एमएल को सेल घनत्व समायोजित करें (जैसा कि चरण 1.1 में वर्णित है), और कोशिकाओं के बीज 2 एमएल को 6-वेल सेल-कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में रखें। कोशिकाओं के प्रत्येक प्रकार के लिए, बीज 3 कुओं (ट्रिपलिकेट नमूना). एक ही समय में, सीरम मुक्त स्टेम सेल मध्यम केवल (कोई कोशिकाओं) के 2 एमएल के साथ 6 कुओं तैयार करते हैं।
      नोट: इन नमूनों का उपयोग किया जाएगा: 1) नकारात्मक नियंत्रण के रूप में और 2) सेल नंबर के आधार पर वातानुकूलित मध्यम मात्रा का समायोजन करने के लिए।
    9. 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 6-वेल प्लेट्स रखो। कोशिकाओं को 24 ज के लिए बढ़ने दें।

3. इन विट्रो मैक्रोफेज आकर्षण परख

  1. वातानुकूलित मीडिया की तैयारी
    1. ट्यूमर सेल रखरखाव माध्यम को गर्म (जैसा कि चरण 1.3 में वर्णित है) 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में।
    2. 70% इथेनॉल के साथ ऊतक संस्कृति हुड सतह स्प्रे और कागज तौलिए के साथ सतह पर 70% इथेनॉल पोंछ। फ्रिज से सेल टुकड़ी समाधान ले लो. 70% इथेनॉल के साथ मध्यम और सेल टुकड़ी समाधान की बोतलों स्प्रे, कागज तौलिए के साथ सतह पर 70% इथेनॉल पोंछ और उन्हें ऊतक संस्कृति हुड में ले आओ.
    3. इनक्यूबेटर से 6-वेल प्लेट्स को बाहर निकाललें। ध्यान से 15 एमएल बाँझ अपकेंद्रण ट्यूबों में वातानुकूलित मीडिया पिपेट। बर्फ पर ट्यूब रखो. एक अलग 15 एमएल बाँझ अपकेंद्रण ट्यूब में "मीडिया केवल" अच्छी तरह से मीडिया Pipette.
      नोट: इस चरण से पहले, यह देखने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करना सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं संलग्न हैं या नहीं। यदि नहीं, तो एक कदम पर लेपित प्लेटों का उपयोग कर सकते हैं 2.4.8 बेहतर लगाव की अनुमति या गिनती चरण में अस्थायी कोशिकाओं को शामिल करें.
    4. 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में सेल टुकड़ी समाधान के 0.5 एमएल जोड़ें. जांच करें कि क्या ट्यूमर कोशिकाओं को हर मिनट दौर. एक बार ट्यूमर कोशिकाओं को दौर, धीरे कोशिकाओं को अलग करने में मदद करने के लिए थाली के पक्ष नल.
    5. पिपेट 2.5 एमएल ट्यूमर सेल रखरखाव माध्यम के कुएं में, पिपेट अप और नीचे 3 बार मिश्रण और एक 15 एमएल बाँझ अपकेंद्रण ट्यूब में कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए। कोशिकाओं के 10 डिग्री सेल्सियस लीजिये और ट्राइपैन ब्लू विलयन के 10 डिग्री सेल्सियस के साथ मिला लें। पिपेट 10 डिग्री मिश्रण की गिनती स्लाइड में और एक स्वत: सेल काउंटर का उपयोग कर जीवित कोशिकाओं की संख्या मात्रा निर्धारित.
    6. सीरम मुक्त स्टेम सेल माध्यम (37 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन रात भर) का उपयोग कर सेल नंबर के अनुसार वातानुकूलित मीडिया की मात्रा समायोजित करें। उदाहरण के लिए, यदि खैर A में 3x के रूप में कई जीवित कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं की कम से कम संख्या के साथ है, अपने वातानुकूलित मीडिया 1:3 पतला. इस चरण का उपयोग कक्ष प्रसार दर के कारण अंतर को नियंत्रित करने के लिए किया जाता है.
      नोट: कारण 37 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन रात भर के साथ सीरम मुक्त स्टेम सेल माध्यम का उपयोग करने के लिए लंबे समय तक 37 डिग्री सेल्सियस जोखिम के साथ मीडिया में संभावित परिवर्तन को नियंत्रित करने के लिए है।
    7. वातानुकूलित मीडिया को 0.45 डिग्री फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें. बर्फ पर वातानुकूलित मीडिया रखो.
      नोट: यह चरण वातानुकूलित मीडिया में कक्षों और कक्ष के मलबे को निकाल ताक.
  2. एमवी-4-11 कोशिकाओं की तैयारी
    1. 20 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान पर IMDM माध्यम (FBS के बिना) गर्म.
    2. 70% इथेनॉल के साथ ऊतक संस्कृति हुड सतह स्प्रे और कागज तौलिए के साथ सतह पर 70% इथेनॉल पोंछ। 70% इथेनॉल के साथ मध्यम बोतल स्प्रे, कागज तौलिए के साथ सतह पर 70% इथेनॉल पोंछ और उन्हें ऊतक संस्कृति हुड में ले आओ.
    3. ऊतक संस्कृति हुड में MV-4-11 कोशिकाओं के फ्लास्क ले लो. पिपेट 10 एमएल कोशिकाओं को 15 एमएल बाँझ अपकेंद्रण ट्यूब में। कोशिकाओं के 10 डिग्री सेल्सियस लीजिये और ट्राइपैन ब्लू विलयन के 10 डिग्री सेल्सियस के साथ मिला लें। पिपेट 10 डिग्री मिश्रण की गिनती स्लाइड में और एक स्वत: सेल काउंटर का उपयोग कर जीवित कोशिकाओं की संख्या मात्रा निर्धारित. कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। अधिनान्त को प्रेरित करें।
    4. पीबीएस के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें और कोशिकाओं को 200 x ग्राम पर 5 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रण करें। अधिनान्त को प्रेरित करें।
    5. 1x106 कोशिकाओं/एमएल के अंतिम सेल घनत्व के लिए IMDM माध्यम (FBS के बिना) में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
      नोट: यहाँ प्रयुक्त मैक्रोफेजों की कोशिका संख्या को समायोजित किया जा सकता है।
  3. ट्रांसवेल परख
    नोट: इस चरण के लिए, एक सेल माइग्रेशन परख किट का उपयोग करें या अभिकर्मकों को खरीदें और अलग से डालें. MV-4-11 कोशिकाओं के लिए, 5 डिग्री मीटर pores आकार के साथ ट्रांसवेल सम्मिलित करता है चुनें। मैक्रोफेज माइग्रेशन का पता लगाने के लिए, सीधे निचले कक्ष में मैक्रोफेज की संख्या का परिमाण निर्धारित करें या रंगीन/फ्लोरीमिट्रिक विधियों का उपयोग करें। यहाँ, हम colorimetric विधि का उपयोग कर परख प्रदर्शित करते हैं.
    1. कमरे के तापमान के लिए 24 अच्छी तरह से थाली, डालने और अभिकर्मकों लाओ.
    2. प्रत्येक सम्मिलित में ऊपर तैयार एमवी-4-11 कोशिकाओं का 250 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
    3. वातानुकूलित मध्यम/मध्यम के 400 डिग्री सेल्सियस जोड़ें (37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ऊष्मायन के साथ, ये नमूने 24-वेल प्लेट के निचले कक्षों में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करते हैं)। प्रत्येक ट्यूमर लाइन या नियंत्रण के लिए, triplicate नमूने का उपयोग करें. सम्मिलित करें और वातानुकूलित माध्यम के बीच बुलबुले से बचें। बुलबुले नीचे कुओं के लिए पलायन से मैक्रोफेज को बाधित करेगा.
    4. प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 के साथ 4 ज के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: ऊष्मायन समय समायोजित किया जा सकता है। निचले कक्षों में प्रवास करने वाले कोशिकाओं को सूक्ष्मदर्शी के नीचे देखा जा सकता है।
    5. धीरे से एक ही अच्छी तरह से की भीतरी दीवार पर डालने नल और डालने को त्यागें. के रूप में MV-4-11 कोशिकाओं निलंबन में बढ़ने, सेल टुकड़ी समाधान या trypsin उपचार यहाँ की जरूरत नहीं है.
    6. धीरे pipette कुओं में कोशिकाओं को ऊपर और नीचे 3 बार मिश्रण करने के लिए. फ्लोरोसेंट माप के लिए उपयुक्त एक काले दीवारों 96-वेल प्लेट को सेल निलंबन के 225 जेडएल स्थानांतरित करें।
    7. 4x lysis बफर के साथ CyQuant डाई 1:75 को विलेन करें। भंवर संक्षेप में और समाधान नीचे स्पिन. 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 75 डिग्री सेल्सियस घोल डालें। कमरे के तापमान पर 15 मिनट इनक्यूबेट।
    8. एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर के साथ सेट 480/520 एनएम फिल्टर का उपयोग कर फ्लोरोसेंट पढ़ें।
    9. खाली घटाना और नियंत्रण ट्यूमर सेल लाइन के लिए सामान्यीकरण द्वारा डेटा का विश्लेषण करें।

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Representative Results

परिणाम आमतौर पर बार ग्राफ़ के माध्यम से दिखाए जाते हैं (उदाहरण चित्र 1में दिखाया गया है)। उच्च 480/520 मूल्यों वाले नमूनों से पता चलता है कि वातानुकूलित मीडिया में मैक्रोफेज की भर्ती करने की उच्च क्षमता है। प्रयोगात्मक आवश्यकता के आधार पर, अतिरिक्त नियंत्रण शामिल किए जा सकते हैं. उदाहरण के लिए, एक एक्रोफेज रसायन को समाप्त करने के लिए वातानुकूलित मीडिया का इलाज करने के लिए एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने का उपयोग कर सकते हैं, और एक ही परख प्रदर्शन कर सकते हैं। एक भी अतिरिक्त chemokines जोड़ सकते हैं (यानी, CCL2) वातानुकूलित मीडिया है, जो एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है.

Figure 1
चित्र ााा्वित 1: U87 कोशिकाओं के सह-उद्धरण EGFR और EGFRvIII से वातानुकूलित मीडिया एक नियंत्रण वेक्टर व्यक्त करने वाले U87 कोशिकाओं की तुलना में अधिक मैक्रोफेज को आकर्षित करता है, या EGFR/EGFRvIII एक साथ। यह आंकड़ा एक, एट अल7से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, कई महत्वपूर्ण चरण हैं: 1) Transwell सम्मिलित करें का चयन। MV-4-11 सेल लाइन के लिए, 5 डिग्री m ट्रांसवेल सम्मिलित करता है अच्छी तरह से काम करते हैं. हालांकि, इस तरह के सामान्य रूप से इस्तेमाल किया monocyte सेल लाइन THP-1 के रूप में अन्य सेल लाइनों के लिए, एक अलग pores आकार बेहतर काम हो सकता है. 2) के रूप में विभिन्न सेल लाइनों अलग गति से बढ़ने, यह सेल संख्या के अनुसार वातानुकूलित मीडिया की मात्रा को समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रयोजन के लिए, एक ही प्रयोगात्मक शर्तों के तहत इनक्यूबेट किए गए सेल-मुक्त मीडिया का उपयोग वातानुकूलित मीडिया को कमजोर करने के लिए किया जा सकता है। 3) FBS साइटोकिन्स शामिल हैं। ऊपरी कक्ष में एमवी-4-11 कोशिकाओं के बीज के लिए सीरम मुक्त माध्यम का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। यदि FBS यहाँ प्रयोग किया जाता है, कभी कभी सेल प्रवास नहीं देखा जा सकता है.

शोधकर्ताओं ने विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए इस परख को संशोधित कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, अन्य ट्यूमर कोशिकाओं, या तो प्राथमिक रोगी व्युत्पन्न xenograft संस्कृति, या माउस कोशिकाओं मस्तिष्क ट्यूमर सेल लाइन ऊपर उल्लिखित उदाहरण में इस्तेमाल स्थानापन्न कर सकते हैं. मैक्रोफेज सेल लाइन को विशिष्ट आवश्यकता के आधार पर रोगियों या चूहों से प्राथमिक मैक्रोफेज या मोनोसाइट्स द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। एक महत्वपूर्ण बात यह है कि शोधकर्ताओं को एक ही प्रजाति से कोशिकाओं का चयन करने के लिए सबसे अच्छा परिणाम सुनिश्चित करने की जरूरत है. हालांकि मैक्रोफेज रमोटाइटिस मार्ग अत्यधिक संरक्षित है, विभिन्न प्रजातियों के बीच संरचना के प्रोटीन अनुक्रम की भिन्नता प्रयोगात्मक परिणामों की व्याख्या करने के लिए जटिलता की परतें जोड़ सकती है।

टीएएम कैंसर इम्यूनोलॉजी13,14में अधिक ध्यान आकर्षित कर रहे हैं . ट्यूमर में विभिन्न आनुवंशिक परिवर्तन कैसे TAMs और ट्यूमर microenvironment में अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती को प्रभावित अभी भी आगे के अध्ययन इंतजार कर रहा है. Transwell आवेषण के pores आकार बदलकर, इस परख ट्यूमर और टी कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं के रूप में अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ट्यूमर-प्रतिरक्षा बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए ट्रांसवेल परख का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि यह प्रदर्शित करना आसान है कि कैसे विशिष्ट oncogenes / परिवर्तन प्रतिरक्षा कोशिकाओं के एक निश्चित प्रकार की भर्ती को प्रभावित. इसके अलावा, इस परख जीनोम व्यापक स्क्रीन के लिए पैमाने पर करने के लिए आसान है. इस परख ट्यूमर प्रतिरक्षा सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए शोधकर्ताओं के लिए अतिरिक्त संभावनाओं को खोलता है. इसके अतिरिक्त, इस परख का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कैसे ट्यूमर कोशिकाओं से वातानुकूलित मीडिया मैक्रोफेज के प्रतिलेखन प्रोफ़ाइल को प्रभावित /

सभी परख अपनी सीमाएं हैं. इस परख के लिए, वातानुकूलित माध्यम ट्यूमर कोशिकाओं से है इन विट्रो में सुसंस्कृत. यहाँ स्रावित chemokines विवो में बड़े ट्यूमर द्वारा स्रावित उन लोगों से अलग हो सकता है. इसके अतिरिक्त, मैक्रोफेज सेल लाइन मैक्रोफेज में घुसपैठ करने वाले ट्यूमर से अलग है, जो अधिक फेनोआमली और ट्रांसक्रिप्शनल रूप से विविध हैं। इसलिए, इन विट्रो निष्कर्षों की आगे पुष्टि अन्य इन विट्रो और विवो विधियों में उपयोग करना आवश्यक है।

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Disclosures

विलियम ए Weiss StemSynergy चिकित्सा के एक सह संस्थापक है. झेनी अन के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

अनुदान सहायता: एक एलेक्स Lemonade स्टैंड फाउंडेशन, अमेरिकी मस्तिष्क ट्यूमर एसोसिएशन, NIH T32CA108462 और निर्णायक जैव चिकित्सा अनुसंधान, जो आंशिक रूप से Sandler फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित है के लिए कार्यक्रम से समर्थन प्राप्त किया. डब्ल्यू Weiss NIH अनुदान R01CA2221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103 द्वारा समर्थित किया गया था; शमूएल जी Waxman कैंसर रिसर्च फाउंडेशन; और एवलिन और मैटी एंडरसन कुर्सी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 μm filtration cup Thermo fisher 566-0010
0.45 μm filter unit Millipore SLHA033SS
10 mL serological pipettes Olympus plastics 12-104
15 mL sterile centrifuge tubes Olympus plastics 28-103
1 mL pipette tip ART molecular bioproducts 2779-RI
2 mL aspirating pipet Falcon 357558
24-well plate Millipore ECM507 Part of ECM507, or can be purchased separately
4x lysis buffer Millipore ECM507 Part of ECM507, or can be purchased separately
5 μm Transwell insert Millipore ECM507 Part of ECM507, or can be purchased separately
75 cm2 flask Corning 430641U
Accutase Innovative cell technologies AT-104
B27 Gibco 12587-010
CyQuant Dye Millipore ECM507 Part of ECM507, or can be purchased separately
DMEM Gibco 11965-092
DMEM:F12 Gibco 10565-018
EGF Peprotech AF-100-15
FBS Gibco 26140
FGF Peprotech 100-18B
IMDM Gibco 12440-053
PBS Gibco 14190-144
Pen Strep Gibco 15140-122
Trypan blue Biorad 1450021

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 150 मैक्रोफेज ट्यूमर वातानुकूलित माध्यम ट्यूमर microenvironment ग्लियोब्लास्टोमा epidermal विकास कारक रिसेप्टर
इन विट्रो परख से अध्ययन ट्यूमर-मैक्रोफेज इंटरेक्शन
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An, Z., Weiss, W. A. In Vitro Assay… More

An, Z., Weiss, W. A. In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction. J. Vis. Exp. (150), e59907, doi:10.3791/59907 (2019).

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