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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Ensayo In Vitro para estudiar la interacción tumor-macrofago

Published: August 1, 2019 doi: 10.3791/59907
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Department of Neurology, University of California, San Francisco, 2Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center, University of California, San Francisco, 3Departments of Pediatrics and Neurological Surgery, University of California, San Francisco

Summary

Este artículo representa un ensayo in vitro útil para evaluar la capacidad del medio acondicionado de las células tumorales para atraer macrófagos.

Abstract

Los macrófagos asociados a tumores (AMA) representan un gran porcentaje de células en la masa tumoral para diferentes tipos de cáncer. El glioblastoma (GBM), un tumor cerebral maligno sin cura, tiene hasta la mitad de los MAAs de masa tumoral. Los AMA pueden ser pro-tumorales o antitumorales, dependiendo de la activación de genes específicos en las células. Las mutaciones genéticas en los tumores, a través de la expresión de citoquinas, pueden afectar el reclutamiento de TAM en el microambiente tumoral. Aquí, describimos un ensayo cuantitativo basado en células para evaluar el reclutamiento de macrófagos por el medio acondicionado de las células tumorales. Este ensayo utiliza la línea celular de macrófagos humanos MV-4-11 para estudiar la atracción de macrófagos por el medio acondicionado del glioblastoma, lo que permite una alta reproducibilidad y baja variabilidad. Los datos generados con este ensayo pueden contribuir a una mejor comprensión de la interacción entre el tumor y el microambiente tumoral. Ensayo similar se puede utilizar para evaluar la interacción entre las células tumorales y otras células inmunitarias, incluyendo las células T y las células asesinas naturales (NK).

Introduction

Los macrófagos son células inmunitarias con alta heterogeneidad fenotípica y funcional1. Desempeñan un papel importante en los sistemas de defensa del huésped, reparación de tejidos, desarrollo y progresión tumoral1. Los AMA son macrófagos en el microambiente de tumores sólidos. Ciertos AMA pueden promover el crecimiento tumoral mediante la inhibición de la actividad citotóxica mediada por células T, lamodulación del microambiente tumoral (TME), la promoción de la angiogénesis, invasión y metástasis 2,3,4, 5. Los AMA se encuentran entre los tipos de células más abundantes en el TME y un mayor número de AMA generalmente se correlaciona con una peor supervivencia del paciente en muchos tipos de tumores sólidos6. Las distintas firmas genéticas de las células tumorales afectan su capacidad para reclutar macrófagos. En GBM, un tumor cerebral agresivo sin cura, los macrófagos pueden representar hasta la mitad de la masa tumoral7. La coamplificación del receptor del factor de crecimiento epidérmico(EGFR)y su mutante de truncamiento EGFRvIII se observa con frecuencia en GBM, que confiere ventajas de crecimiento tumoral8. Las células que co-expresan EGFR y EGFRvIII atraen más macrófagos en comparación con las células que expresan EGFR o EGFRvIII por separado7.

Las quimioquinas son una familia de citoquinas pequeñas que desempeñan un papel importante en la regulación de la composición inmune en el TME6,9. Las células humanas expresan más de 50 citoquinas10. La infiltración inmune en los tumores se realiza en gran medida por la interacción entre las citoquinas y los receptores de citoquinas11. Cada tipo de células inmunitarias expresa distintos receptores de quimiocina/quimiocinas y puede ser reclutado por células que secretan quimiolinas específicas/receptores de quimiocina12. Las células cancerosas pueden aumentar la expresión de ciertas quimiolinas para reclutar células inmunitarias como TAC, células T reguladoras y células supresoras derivadas de mieloides (MDSC)6. El bloqueo de la quimiocina específica secretada por los tumores puede ser una forma prometedora de inhibir la infiltración de células inmunitarias en la masa tumoral.

Aquí, describimos un protocolo que permite la evaluación in vitro de la interacción tumor-macrofaje, utilizando medios acondicionados de las células tumorales que contienen quimiolinas y líneas celulares de macrófagos.

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Protocol

1. Preparación media

  1. Preparación del medio de células madre sin suero
    1. Descongelar el suplemento de 50x B27, el factor de crecimiento epidérmico (EGF, 20 g/ml en ácido acético de 10 mM con 0,1% de BSA), y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, 20 g/ml en ácido acético de 10 mM con 0,1% de BSA).
    2. Añadir 500 l de EGF (concentración final 20 ng/ml), 500 l de FGF (concentración final 20 ng/ml), 10 ml de 50x B27 a 500 ml de mezcla de águila modificada/mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12) de Dulbecco y 5 ml de 100x penicilina/estreptocina. Invertir el frasco 4-6 veces para mezclar, filtrar el esterilizado a través de una taza de filtración de 500 ml de 0,1 m. Marcar la botella y almacenar a 4oC.
      NOTA: El medio es bueno de usar hasta un mes a 4oC.
  2. Preparar el medio de cultivo MV-4-11: Añadir 50 ml de suero bovino fetal (FBS) a 500 ml del medio de Dulbecco modificado (IMDM) de Iscove. Invertir el frasco 4-6 veces para mezclar, filtrar el esterilizado a través de una taza de filtración de 500 ml de 0,1 m. Marcar la botella y almacenar a 4oC.
    NOTA: El medio es bueno de usar hasta un mes a 4oC.
  3. Preparar el medio de mantenimiento de células tumorales: Añadir 50 mL de FBS a 500 mL del medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco. Invertir el frasco 4-6 veces para mezclar, filtrar el esterilizado a través de una taza de filtración de 500 ml de 0,1 m. Marcar la botella y almacenar a 4oC.
    NOTA: El medio es bueno de usar hasta un mes a 4oC.

2. Preparación celular

Día 1:

  1. Descongelación de las células tumorales
  2. Calentar el medio de mantenimiento de las células tumorales (como se describe en el paso 1.3) en un baño de agua de 37 oC durante 20 minutos.
  3. Tome las células congeladas U87, U87:EGFR, U87:EGFRvIII y U87:EGFR+EGFRvIII del tanque de nitrógeno líquido. Descongelar las células en el baño de agua de 37oC durante 2 min.
    ADVERTENCIA: Tenga cuidado al tomar las células del tanque de nitrógeno líquido. Use guantes con protección térmica y gafas de seguridad según sea necesario.
  4. Rocíe la superficie de la campana de cultivo de tejido con 70% de etanol y limpie 70% el etanol en la superficie con toallas de papel.
  5. Rocíe los viales criogénicos que contienen células y el frasco mediano con 70% de etanol, limpie 70% de etanol en la superficie con toallas de papel y tráigalos a la campana de cultivo de tejido.
  6. Pipetear 5 ml de medio de mantenimiento de células tumorales en un tubo centrífugo estéril de 15 ml. Invierta el tubo que contiene las células tumorales 4-6 veces para mezclar. Pipetear todas las células en el tubo centrífugo de 15 ml. Invierta el tubo centrífugo 4-6 veces para mezclar.
  7. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 4 oC. Aspira al sobrenadante.
  8. Lave las células con 10 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS). Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 4 oC. Aspira al sobrenadante.
  9. Resuspender las células en 12 ml de medio de mantenimiento de células tumorales (como se describe en el paso 1.3). Pipetear hacia arriba y hacia abajo 3-5 veces para mezclar. Transfiera las células a un matraz de cultivo celular T75.
  10. Cultivar las células en una incubadora de37oC con un 5% de CO2. Vuelva a colocar el medio de mantenimiento de las células tumorales en el refrigerador de 4 oC.

Día 2:

  1. Compruebe las células bajo el microscopio. Cambie el medio si es necesario. Las células deben crecer en una monocapa en el cultivo.

Día 3:

  1. Descongelación de células MV-4-11
    1. Caliente el medio de cultivo MV-4-11 (como se describe en el paso 1.2) a un baño de agua de 37 oC durante 20 minutos.
      NOTA: MV-4-11 se puede cambiar a macrófagos primarios u otras líneas celulares de macrófagos, dependiendo de la necesidad del estudio específico.
    2. Tome las células congeladas MV-4-11 del tanque de nitrógeno líquido. Descongelar las células a un baño de agua de 37oC durante 2 min.
      PRECAUCION: Tenga cuidado al tomar las células del tanque de nitrógeno líquido. Use guantes con protección térmica y gafas de seguridad según sea necesario.
    3. Rocíe la superficie de la campana de cultivo de tejido con 70% de etanol y limpie 70% el etanol en la superficie con toallas de papel.
    4. Rocíe los viales criogénicos que contienen células y el frasco mediano con 70% de etanol, limpie 70% de etanol en la superficie con toallas de papel y tráigalos a la campana de cultivo de tejido.
    5. Pipeta de 5 ml de medio de cultivo MV-4-11 (como se describe en el paso 1.2) en un tubo centrífugo estéril de 15 ml. Invierta el tubo que contiene las células tumorales 4-6 veces para mezclar. Pipetear todas las células en el tubo centrífugo de 15 ml. Invierta el tubo centrífugo 4-6 veces para mezclar.
    6. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 4 oC. Aspira al sobrenadante.
    7. Lavar las células en 10 ml de PBS y centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 4 oC. Aspira al sobrenadante.
    8. Resuspenda las células en 12 ml de medio de cultivo MV-4-11 (como se describe en el paso 1.2). Pipetear suavemente 3-5 veces para mezclar. Transfiera las células a un matraz de cultivo celular T75.
    9. Cultivar las células en una incubadora de37oC con un 5% de CO2.
  2. División de células tumorales
    1. Caliente el medio de células madre sin suero (como se describe en el paso 1.1) en un baño de agua de 37 oC durante 20 min.
    2. Rocíe la superficie de la campana de cultivo de tejido con 70% de etanol y limpie 70% el etanol en la superficie con toallas de papel. Tome la solución de desprendimiento celular de la nevera. Rocíe las botellas de solución de desprendimiento de medios y células con 70% de etanol, limpie 70% el etanol en la superficie con toallas de papel y tráigalas en la campana de cultivo de tejido.
      NOTA: No precaliente la solución de desprendimiento de células de acusación.
    3. Transfiera el cultivo de células tumorales de la incubadora a la capucha del cultivo de tejido. Aspirar el medio, añadir 2 ml de solución de desprendimiento celular en el matraz.
      NOTA: El acosamiento con PBS antes de añadir accutase es opcional aquí.
    4. Ponga el matraz en el capó. Comprueba si las células tumorales se acumulan cada minuto. Una vez que las células tumorales se redondean, toque suavemente el lado del matraz para ayudar a que las células se separen del matraz.
    5. Pipetear 8 ml de medio de célula sin suero en el matraz, pipetear hacia arriba y hacia abajo 3 veces para mezclar, y transferir las células en un tubo centrífugo estéril de 15 ml. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 4 oC. Aspira al sobrenadante.
    6. Lavar las células en 10 ml de PBS. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 3-5 veces para mezclar. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 4 oC. Aspira al sobrenadante.
      NOTA: Este paso es opcional.
    7. Resuspender las células en 10 ml de medio de células madre libres de suero (como se describe en el paso 1.1). Pipetear hacia arriba y hacia abajo 3-5 veces para mezclar. Tomar 10 s de las células y mezclar con 10 l de solución de Trypan Blue. Pipetear 10 l de la mezcla en la diapositiva de recuento, cuantificar el número de celda viva utilizando un contador de celdas automático.
    8. Ajuste la densidad celular a 2,5 x 105 células/ml con medio de células madre libres de suero (como se describe en el paso 1.1), y la semilla 2 ml de las células en cada pocal de una placa de cultivo celular de 6 pocillos. Para cada tipo de células, semilla 3 pozos (muestra de triplicado). Al mismo tiempo, prepare 6 pozos con 2 ml de medio de células madre sin suero solamente (sin células).
      NOTA: Estas muestras se utilizarán: 1) como controles negativos y 2) para ajustar el volumen medio acondicionado basado en números de celda.
    9. Poner las placas de 6 pocillos en una incubadora de 37oC con 5% de CO2. Deje que las células crezcan durante 24 h.

3. Ensayo de atracción de macrófagos in Vitro

  1. Preparación de medios acondicionados
    1. Calentar el medio de mantenimiento de las células tumorales (como se describe en el paso 1.3) en un baño de agua de 37 oC durante 20 minutos.
    2. Rocíe la superficie de la campana de cultivo de tejido con 70% de etanol y limpie 70% el etanol en la superficie con toallas de papel. Tome la solución de desprendimiento celular de la nevera. Rocíe las botellas del medio y la solución de desprendimiento celular con 70% de etanol, limpie 70% de etanol en la superficie con toallas de papel y tráilas en la campana de cultivo de tejido.
    3. Saque las placas de 6 pocillos de la incubadora. Pipetee cuidadosamente el medio acondicionado en tubos centrífugos estériles de 15 ml. Pon los tubos en hielo. Pipetear el medio en el "solo medios" bien en un tubo de centrífuga estéril separado de 15 ml.
      NOTA: Antes de este paso, asegúrese de comprobar bajo el microscopio para ver si las células se unen. Si no es así, se pueden utilizar placas recubiertas en el paso 2.4.8 para permitir una mejor fijación o incluir las celdas flotantes en el paso de recuento.
    4. Agregue 0,5 ml de solución de desprendimiento de células en cada pocal de la placa de 6 pocillos. Comprueba si las células tumorales se acumulan cada minuto. Una vez que las células tumorales se redondean, toque suavemente el lado de la placa para ayudar a que las células se separen.
    5. Pipetear 2,5 ml de medio de mantenimiento de células tumorales en el pozo, pipeta hacia arriba y hacia abajo 3 veces para mezclar y transferir las células en un tubo centrífugo estéril de 15 ml. Tomar 10 s de las células y mezclar con 10 l de solución de Trypan Blue. Pipetear 10 l de la mezcla en la diapositiva de recuento y cuantificar el número de células vivas utilizando un contador de células automático.
    6. Ajustar el volumen de los medios acondicionados de acuerdo con el número de celda utilizando el medio de células madre libres de suero (37 oC de incubación durante la noche). Por ejemplo, si el pozo A tiene 3 veces más células vivas que el pozo con el menor número de células, diluir su medio acondicionado 1:3. Este paso se utiliza para controlar la diferencia causada por la tasa de proliferación celular.
      NOTA: La razón para utilizar un medio de células madre libres de suero con una incubación de 37 oC durante la noche es controlar el posible cambio en los medios con una exposición prolongada de 37 oC.
    7. Filtre el medio condicionado a través de filtros de 0,45 m. Ponga los medios acondicionados en hielo.
      NOTA: Este paso elimina las células y los desechos celulares en el medio acondicionado.
  2. Preparación de células MV-4-11
    1. Caliente el medio IMDM (sin FBS) a un baño de agua de 37 oC durante 20 minutos.
    2. Rocíe la superficie de la campana de cultivo de tejido con 70% de etanol y limpie 70% el etanol en la superficie con toallas de papel. Rocíe la botella mediana con 70% de etanol, limpie 70% el etanol en la superficie con toallas de papel y tráigalos a la campana de cultivo de tejido.
    3. Lleve el matraz de las células MV-4-11 a la capucha del cultivo de tejido. Pipetear 10 ml de células en un tubo centrífugo estéril de 15 ml. Tomar 10 s de células y mezclar con 10 sL de solución de Trypan Blue. Pipetear 10 l de la mezcla en la diapositiva de recuento y cuantificar el número de células vivas utilizando un contador de células automático. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 4oC. Aspira al sobrenadante.
    4. Lavar las células con 10 ml de PBS y centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 4 oC. Aspira al sobrenadante.
    5. Resuspenda las celdas en el medio IMDM (sin FBS) para una densidad de celda final de 1x106 celdas/ml.
      NOTA: El número de celdas de macrófagos utilizados aquí se puede ajustar.
  3. Ensayo de Transwell
    NOTA: Para este paso, utilice un kit de ensayo de migración de celda o compre los reactivos e insértelos por separado. Para las celdas MV-4-11, elija Transwell inserts con un tamaño de poro de 5 m. Para detectar la migración de macrófagos, cuantifique directamente el número de macrófagos en la cámara inferior o utilice métodos colorimétricos/fluorimétricos. Aquí, demostramos el ensayo utilizando el método colorimétrico.
    1. Lleve la placa de 24 pocillos, la plaquita y los reactivos a temperatura ambiente.
    2. Agregue 250 l de células MV-4-11 preparadas anteriormente en cada plaquita.
    3. Añadir 400 s de medio/medio acondicionado solamente (con incubación durante la noche a 37 oC, estas muestras sirven como control negativo) a las cámaras inferiores de la placa de 24 pocillos. Para cada línea o control tumoral, utilice muestras triplicados. Evite las burbujas entre la plaquita y el medio acondicionado. Las burbujas inhibirán a los macrófagos de migrar a los pozos inferiores.
    4. Incubar las placas en una incubadora de 37oC con 5% de CO2 durante 4 h.
      NOTA: El tiempo de incubación se puede ajustar. Las células que migran a las cámaras inferiores se pueden ver bajo el microscopio.
    5. Toque suavemente la plaquita en la pared interior del mismo pozo y deseche la plaquita. Como las células MV-4-11 crecen en suspensión, la solución de desprendimiento celular o el tratamiento con trippsina no es necesario aquí.
    6. Pipetear suavemente las células de los pozos hacia arriba y hacia abajo 3 veces para mezclar. Transfiera 225 l de suspensión celular a una placa de 96 pocillos de pared negra adecuada para la medición fluorescente.
    7. Diluir el tinte CyQuant 1:75 con tampón de lisis 4x. Vórtice brevemente y gire hacia abajo la solución. Añadir 75 ml de solución a cada pocal de la placa de 96 pocillos. Incubar 15 min a temperatura ambiente.
    8. Lea la fluorescencia con el conjunto de filtros de 480/520 nm con un lector de placas de fluorescencia.
    9. Analice los datos restando el espacio en blanco y normalizándolo a la línea celular del tumor de control.

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Representative Results

Los resultados se muestran generalmente a través de gráficos de barras (ejemplo que se muestra en la Figura 1). Las muestras con valores altos de 480/520 indican que los medios acondicionados tienen una alta capacidad para reclutar macrófagos. Dependiendo de la necesidad experimental, se pueden incluir controles adicionales. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos neutralizantes para tratar los medios condicionados para abolir la quimiotaxis de macrófagos y realizar el mismo ensayo. También se pueden añadir quimiolinas adicionales (es decir, CCL2) a los medios acondicionados, que sirve como un control positivo.

Figure 1
Figura 1: Los medios condicionados de células U87 que expresan co-expresas EGFR y EGFRvIII atraen más macrófagos que las células U87 que expresan un vector de control, o EGFR/EGFRvIII por separado. Esta cifra ha sido modificada de An, et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este protocolo, hay varios pasos clave: 1) selección de la plaquita Transwell. Para la línea de celda MV-4-11, las plaquitas Transwell de 5 m funcionan bien. Sin embargo, para otras líneas celulares como la línea celular de monocitos comúnmente utilizada THP-1, un tamaño de poro diferente podría funcionar mejor. 2) A medida que las diferentes líneas celulares crecen a diferentes velocidades, es importante ajustar el volumen de los medios acondicionados de acuerdo con los números de celda. Para ello, se pueden utilizar medios libres de células incubados en las mismas condiciones experimentales para diluir los medios acondicionados. 3) FBS contiene citoquinas. Es importante utilizar células MV-4-11 libres de suero en la cámara superior. Si se utiliza FBS aquí, a veces no se puede observar la migración de celdas.

Los investigadores pueden modificar este ensayo para diferentes aplicaciones. Por ejemplo, otras células tumorales, ya sea el cultivo primario de xenoinjerto derivado del paciente, o las células del ratón pueden sustituir la línea celular del tumor cerebral utilizada en el ejemplo antes mencionado. La línea celular del macrófago puede ser sustituida por macrófagos primarios o monocitos de pacientes o ratones dependiendo de la necesidad específica. Un punto importante es que los investigadores necesitan seleccionar células de la misma especie para asegurar el mejor resultado. Aunque la vía de quimiotaxis de macrófagos está muy conservada, la variación de la secuencia proteica de la estructura entre diferentes especies puede agregar capas de complicación para interpretar los resultados experimentales.

Los AMA están atrayendo cada vez más atención en la inmunología del cáncer13,14. La forma en que los diferentes cambios genéticos en los tumores afectan el reclutamiento de LOS AMA y otras células inmunitarias en el microambiente tumoral aún espera más estudios. Al cambiar el tamaño de los poros de las inserciones de Transwell, este ensayo se puede utilizar para estudiar la interacción entre el tumor y otras células inmunitarias, como las células T y las células NK. Una ventaja de usar el ensayo Transwell para evaluar la interacción tumor-inmune es que es fácil demostrar cómo los oncogenes/mutaciones específicos afectan el reclutamiento de un cierto tipo de células inmunitarias. Además, este ensayo es fácil de escalar para pantallas de todo el genoma. Este ensayo abre posibilidades adicionales para que los investigadores estudien las interacciones entre tumores y células inmunes. Además, este ensayo se puede utilizar para estudiar cómo los medios condicionados de las células tumorales afectan el perfil de transcripción de los macrófagos u otras células inmunitarias.

Todos los ensayos tienen sus limitaciones. Para este ensayo, el medio acondicionado proviene de células tumorales cultivadas in vitro. Las quimiolinas secretadas aquí podrían ser diferentes de las secretadas por tumores cultivados in vivo. Además, la línea celular del macrófago es diferente de los macrófagos infiltrantes tumorales, que son más fenotípicamente y transcripcionalmente diversos. Por lo tanto, es necesaria una confirmación adicional de los hallazgos in vitro utilizando otros métodos in vitro e in vivo.

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Disclosures

William A. Weiss es cofundador de StemSynergy Therapeutics. Zhenyi An no tiene nada que revelar.

Acknowledgments

Apoyo de la subvención: Z. Un recibió apoyo de Alex's Lemonade Stand Foundation, American Brain Tumor Association, NIH T32CA108462 y Program for Breakthrough Biomedical Research, que es parcialmente financiado por la Fundación Sandler. W. Weiss fue apoyado por las subvenciones NIH R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103; la Fundación Samuel G. Waxman para la Investigación del Cáncer; y la silla Evelyn y Mattie Anderson.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 μm filtration cup Thermo fisher 566-0010
0.45 μm filter unit Millipore SLHA033SS
10 mL serological pipettes Olympus plastics 12-104
15 mL sterile centrifuge tubes Olympus plastics 28-103
1 mL pipette tip ART molecular bioproducts 2779-RI
2 mL aspirating pipet Falcon 357558
24-well plate Millipore ECM507 Part of ECM507, or can be purchased separately
4x lysis buffer Millipore ECM507 Part of ECM507, or can be purchased separately
5 μm Transwell insert Millipore ECM507 Part of ECM507, or can be purchased separately
75 cm2 flask Corning 430641U
Accutase Innovative cell technologies AT-104
B27 Gibco 12587-010
CyQuant Dye Millipore ECM507 Part of ECM507, or can be purchased separately
DMEM Gibco 11965-092
DMEM:F12 Gibco 10565-018
EGF Peprotech AF-100-15
FBS Gibco 26140
FGF Peprotech 100-18B
IMDM Gibco 12440-053
PBS Gibco 14190-144
Pen Strep Gibco 15140-122
Trypan blue Biorad 1450021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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