Summary
Neobladder humant levermetastatisk ukalv melanom xenograft musmodeller skapades med hjälp av kirurgiska ortotopisk implantation tekniker med patient-derived tumör bit och nål injektion tekniker med odlade mänskliga ukalv melanom cellinjer.
Abstract
Under de senaste decennierna, subkutant implanterade patient-härledda xenograft tumörer eller odlade humana cellinjer har alltmer erkänts som mer representativa modeller för att studera mänskliga cancerformer hos immunobristfällig möss än traditionella etablerade mänskliga cell linjer in vitro. Nyligen, ortotopiskt implanterade patient-derived tumör xenograft (PDX) modeller i möss har utvecklats för att bättre replikera funktioner av patient tumörer. En lever neobladder xenograft musmodell förväntas vara en nyttig cancer forskningsplattform, som ger insikter i tumörbiologi och läkemedelsbehandling. Emellertid, lever ortotopisk tumör implantation är i allmänhet komplicerat. Här beskriver vi våra protokoll för ortotopisk implantation av patient-derived lever-metastaserande ukalv melanomtumörer. Vi odlade humana levermetastatiska uvealt melanom cellinjer i immunbrist möss. Protokollen kan resultera i genomgående hög teknisk framgång priser med antingen en kirurgisk ortotopisk implantation teknik med bitar av patient-derived ukalv melanom tumör eller en nål injektion teknik med odlade mänskliga cellinjer. Vi beskriver också protokoll för datortomografi att upptäcka inre levertumörer och för re-implantation tekniker med kryopreserved tumörer för att uppnå re-engraftelse. Tillsammans, dessa protokoll ger en bättre plattform för lever ortotopisk tumör musmodeller av levermetastatisk ukalv melanom i translationell forskning.
Introduction
Ukalvmelanom är den vanligaste intraokulära maligna tumören bland vuxna i västvärlden. Under de senaste 50 åren har incidensen av ukalvmelanom (5,1 fall per miljon) varit stabil i USA1,2. Ukalv melanom härrör från melanocyter i iris, ciliär kroppen, eller åderhinnan, och det är en extremt dödlig sjukdom när den utvecklar metastaser. Döds frekvensen för patienter med ukalv melanom metastaser var 80% vid 1 år och 92% vid 2 år efter initial diagnos av metastaser. Tiden mellan diagnos av metastaser och död är typiskt kort, mindre än 6 månader, utan avseende på terapi3,4. Cancern sprider sig genom blodet och tenderar att dominant metastasera till levern (89-93%)4,5. En effektiv musmodell behövs snarast för ytterligare utredning av levermetastatisk ukalv melanom. För translationell forskning, det finns en tydlig efterfrågan att generera en lever-lokaliserad metastaserad ukalv melanom musmodell.
Patient-derived tumör xenograft (PDX) musmodeller förväntas ge individualiserad medicin strategier. Dessa modeller kan vara prediktiva för kliniska resultat, vara användbara för preklinisk läkemedels utvärdering, och användas för biologiska studier av tumörer6. Representativa PDX modeller är ectopically tumör-implanterade xenograft möss, som har tumör vid subkutana platser. De flesta forskare kan göra kirurgi för subkutan implantation utan särskild praxis7,8. De kan också övervaka subkutan tumörer lätt. Även subkutana PDX-modeller blev populära i forskningsfasen, de har några hinder i att flytta till praktisk användning. Subkutan implantation tvingar patient-härledda tumörer att att på en annan mikromiljö från tumörens ursprung, så att det leder till engrafations misslyckande och långsam tumörtillväxt 9,10,11, 12,13,14. Ortotopisk inympelse kan vara en mer idealisk och rationell strategi för en PDX modell eftersom den använder samma organ som den ursprungliga tumören15,16.
Nyligen utvecklade vi protokoll för kirurgiska ortotopisk implantation tekniker för patient-derived lever-metastaserande ukalv melanomtumörer och nål injektion tekniker med en odlade mänskliga levern-metastaserande ukalv melanom cell linje i NOD. CG-prkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG) möss17,18. Protokollen resulterar i genomgående hög teknisk framgång priser. Vi etablerade också CT scanning tekniker som är användbara för att upptäcka inre levertumörer, och vi utvecklat ny implantation av kryopreserved tumörer i PDX plattformen. Vi fann att ukalv melanom tumör xenograft modeller bibehålla egenskaperna hos den ursprungliga patienten lever tumör, inklusive deras histopatologiska och molekylära funktioner. Tillsammans, dessa tekniker ger en bättre plattform för lever ortotopisk tumörmodeller för ukalv melanom i translationell forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Patienter som rekryterats i studien bör ge skriftligt medgivande som gör det möjligt att använda kasserade kirurgiska prover för forskningsändamål och genetiska studier, enligt ett institutionellt granskningsnämnd godkänt protokoll. Detta protokoll genomfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i handledningen för vård och användning av laboratoriedjur vid National Institutes of Health och godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC).
1. insamling av färsk patient-derived tumör vävnad
- Få patient-derived tumör vävnad från kirurgi eller en nål biopsi i ett sjukhus operationssalen.
- Sätt tumör vävnad i en 100 mL behållare som innehåller Hanks balanserad saltlösning (HBSS) lösning på is.
- Överför vävnaden till en steril huva (biosäkerhetsnivå 2) i ett laboratorium.
- Gå vidare till steg 2 så snart som möjligt.
Anmärkning: Av säkerhetsskäl utesluta patienter med kända HIV-eller hepatit B-eller C-infektioner.
2. behandling av färskt patient-derived tumör vävnad
- Lägg vävnaden i ett 50 mL-rör som innehåller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på is. För tvättning av vävnaden, tillsätt PBS i röret och kassera PBS från röret två gånger.
- Överför vävnaden till en petriskål som innehåller PBS på is.
- Med hjälp av sterila pinpett och sax, ta bort nekrotiska delar av vävnaden. Håll vävnaden fuktig och kall under steg 2,3 till 2,5. För nål biopsi prover, hoppa över steg 2,3 och 2,5, och skär inte proverna.
Anmärkning: Den nekrotiska vävnaden bryts ofta isär lätt vid beröring. - Skär vävnaden i 1 mm3 kuber för kirurgisk lever implantation.
- Skär resten av vävnaden i 2 mm kuber i petriskål.
- Överför dem till en 1,7 mm mikrorör med 4% formalin för histologisk analys och till ett annat rör för genomisk och proteomisk analys.
- Sätt mikrorören i en flytande kväve burk med flytande kväve. Överför rören till a-80 ° c frys för permanent förvaring.
Anmärkning: Tiden mellan prov avlägsnande från patienten och vävnad bearbetning bör inte överstiga 30 min.
3. kirurgisk lever implantation med patient-derived tumör vävnad
- Spraya alla föremål som kommer in i huven för kirurgi med 70% etylalkohol.
Anmärkning: Detta inkluderar kirurgiska instrument, värmedynor och anestesimaskiner. - Mät vikten på en bomullspinne och tygplåt.
- Anesthetize en mus med en 3 – 5% isofluran spridare genom att placera den i induktions kammaren.
- När musen är helt sövda, placera den i liggande läge på en värmedyna. Placera isofluran konen på musens nos för att inhalera 1,5-3% isofluran för underhåll av anestesi.
Anmärkning: Musen måste vara på värmeplattan under hela proceduren. Brist på värme kan orsaka hypotermi. - Bekräfta ordentlig anestesi av ingen reaktion när foten av musen är prickad med Ultrafine pincett.
- Injicera buprenorfin (0,6 mg/kg) subkutant på flanken med hjälp av en 27 G nål på en mikrospruta före operationen.
- Applicera 70% etylalkohol på buken och fördela pälsen uppåt och nedåt. Efter att ha spridit pälsen, bekräfta lättare visualisering av huden under den vänstra subcostala område för en lättare snitt. Raka inte av pälsen från buken.
Anmärkning: Pälsen kommer att dölja snittet platsen efter operationen och förhindra att musen skrapa snittet efter operationen. Du kan dock raka pälsen för att förhindra infektion av snitt platsen enligt institutionella standarder. - Applicera jod och låt den absorberas i huden.
- Placera en steril kirurgisk drapera med ett 2 cm hål på musen.
- Lyft buk huden med böjda Ultrafine pinkoppar och göra en 1 cm tvärgående vänster subcostala hud snitt med böjda sax.
- Sätt spetsen på den böjda saxen under huden på snittet och lätt öppna dem för att separera bukhinnan från huden. Dra tillbaka saxen från snittet med slutna blad.
Anmärkning: Att öppna och stänga saxar inuti musen kan orsaka skador och blödningar. - Lokalisera levern under peritoneum. Bekräfta en mörk rödaktig färg genom peritoneum.
- Med böjda saxar, gör en 1 cm tvärgående snitt i peritoneum. Om en peritonealdialys artär blöder från skäreggen, omedelbart stoppa blödningen med cautery.
- Greppa fettvävnad med böjda Ultrafine Pink med en hand, infoga kanten av en bomullspinne under vänster leverlob och rulla pinnen nedåt med den andra handen för att få ut levern.
Anmärkning: Greppa fettvävnad är viktigt att hålla fettvävnad från att hålla sig till bomullspinne. - Exteriorize levern på bomullspinne och placera levern på en icke-vävda absorberande tyg blad.
Anmärkning: Tyget arket spelar två viktiga roller i stabiliserande levern och absorbera blödning. - Gör ett snitt 5 mm i bredd och djup med en steril No. 11 skalpell blad för att bilda en ficka i parenkymet medan mjukt trycka på snitt plats med bomullspinne.
- Sätt in bladet parallellt med ytan av levern och skär horisontellt.
- Tryck på snittet plats med bomullspinne för att stoppa någon blödning.
Anmärkning: Förvara inte bladet vertikalt, annars kommer du att bryta igenom levern och skada stora fartyg i mitten av levern.
- Rulla bomullspinnen uppåt för att öppna snitt platsen och implantatet en 1 mm3 kub av tumör vävnad i fickan med böjda Ultrafine pinmupp. Dra in tånden medan du rullar bomullspinnen i omvänd rotation och tryck ned.
Anmärkning: Att trycka ner på snittet platsen med bomullspinnen medan indragning av tång hjälper till att förhindra förskjutning av tumören inne i fickan. - Ta försiktigt bomullspinnen från snitt platsen efter implantation. Gå vidare till steg 3,19 så snart som möjligt.
- Sätt en absorberbara hemostat på snittet webbplatsen.
- Bekräfta hemostas. Om blödning fortsätter, tillsätt mer hemostat på snittet webbplatsen.
- Skala levern från tyget arket med pinkoppar (företrädesvis Blunt-slutade) och sätta levern tillbaka in i bukhålan.
- Sutur bukhinnan med dubbel ligatur med 5-0 resorberbar sutur.
- Sutur Skin med Triple ligatur med 5-0 resorberbara sutur.
Anmärkning: Trefaldig ligatur hjälper till att förhindra kirurgiska snitt dehiscence. - Observera musen tills den är helt vaken och Lägg tillbaka den i buren.
- Mät vikten på bomullspinnen och tyg bladet med blod för blödande volym under operationen. Jämför dem med sina ursprungliga vikter före operationen. Minska blödning under operationen till mindre än 10% av cirkulerande blodvolym i mus.
4. insamling och behandling av odlade humana Levermetastatiska Ukalv melanom cellinjer
- Förbered odlade celler.
- Samla celler och beräkna cellnumret med hjälp av en cell räknare.
- Bered en lämplig mängd cellsuspension för 10,0 x 106 celler i en 15 ml tub.
- Snurra röret på 300 x g i 5 minuter i en centrifug vid rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten i 15 mL-röret. Lämna cellen pelleten i botten av röret.
- Tillsätt 50 μL RPMI 1640-medium i ett 1,7 mL-rör.
- Skär spetsen på en 200 μL spets med sax för att förstora spetsen öppningen.
- Tillsätt 60 μL basalmembran mat ris med hjälp av en pipett med snitt spetsen i 1,7 mL-röret som har RPMI.
- Blanda RPMI och Matrix i 1,7 mL-röret. Vortex det.
- Tillsätt 110 μL av blandningen i cellpelleten i 15 mL-röret. Överför cellsuspensionen till ett nytt 1,7 mL-rör.
- Håll röret på isen innan injektion av nålen.
5. kirurgisk nål implantation av odlade humana levern metastaserande Ukalv melanom cell linje i levern
- Följ ovanstående protokoll från steg 3,1 till 3,15.
- Samla upp cellsuspensionen med en mikrospruta med en 27 G nål.
- Stick in nålen längs med ytan av levern och skjut spetsen på nålen 5 mm djupare.
- Injicera 20 μL cellsuspension i levern.
- Cauterize insättningspunkten i levern för att förhindra att de injicerade cellerna läcker ut. Bekräfta hemostas.
- Följ ovanstående protokoll från steg 3,21 till 3,24.
6. datortomografi
- Placera musen i en hämmaren i vaken tillstånd.
- Torka av svansen med en steril alkohol pad för desinfektion och vasodilatation.
- Injicera 100 μL av CT-kontrastmedlet genom svans venen med en 27 G nål på en 1 mL spruta.
- Vänta 4 h efter injektion innan du tar datortomografi.
Anmärkning: Det tar 4 h tills agenten tas upp av levern Kupffer celler. - Fyra timmar efter injektion, söva tumören-bärande mus med 3 – 5% förånad isofluran genom att placera den i induktions kammaren.
- När musen är helt sövda, placera den i liggande position på en CT. Placera isofluran konen på musens nos för att inhalera 1,5 – 3% isofluran för underhåll av anestesi.
- Bekräfta ordentlig anestesi av ingen reaktion när foten av musen är prickad med Ultrafine pincett.
- Ta en datortomografi i 15 min.
- Se till att musen tills den är helt väckt efter datortomografi och sätta tillbaka den i buren.
- Utvärdera för förekomsten av tumör och mäta tumörstorlek på CT-bilder.
Anmärkning: Kontrastmedlet förbättrar normal leverparenkymet så att det är lätt att känna igen oförstärkt tumör. Misstolka inte gallblåsan och magen som tumör.
7. skörd och bearbetning av vävnad
- Euthanize möss med CO2 följt av cervikal dislokation genom att placera pekfingret och tummen bakom skallen och dra i kroppen genom basen av svansen. Gå vidare till steg 7,2 så snart som möjligt.
- Placera musen i liggande läge och spraya buken med 70% etylalkohol.
- Använd sterila tång och steril sax för att göra en 3-cm tvärgående snitt under xiphoid processen att exponera bukorganen.
- Punktskatter på tumör vävnaden och utför steg 2,1 till 2,2.
- Skär resten av tumören i 2 mm kuber i petriskål.
- Överför dem till ett kryogent rör med cryomedium för förnyad implantation efter frysförvaring.
- Placera rören i en kryogen frysnings behållare fylld med isopropanol.
- Överför behållaren till en-80 ° c frys för tillfällig förvaring. Placera inte kryorören med cryomedium direkt i en flytande kväve tank. Frys dem långsamt vid en kylhastighet av-1 ° c/min för att bevara tumör vävnad.
- På nästa dag, överför rören till en flytande kväve tank för permanent förvaring.
8. återimplantation
- Håll rören frysta i en flytande kväve burk med flytande kväve tills den är redo att implantatet vävnad. Minimera exponeringen av vävnaden till rumstemperatur för att bibehålla lönsamheten och öka chanserna för engrafering.
- Tina nedfrysta Tube i ett 37 ° c vattenbad.
- Utför steg 2.2 – 2.4.
- Implantat den tinade tumören i möss som beskrivs i steg 3.1 – 3.24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kirurgisk ortotopisk implantation med hjälp av levern Pocket metod kan transplantera mänskliga levern metastaserande ukalv melanom tumör i musen levern med en hög framgång på 80% inom sex månader. Den xenograft tumör engrafts i levern som en solitär tumör utan dotter noduli (figur 1 och figur 3a). Den kirurgiska ortotopiska injektion tekniken i levern med hjälp av mikronålar framgångsrikt inympade odlade humana lever-metastaserande ukalv melanomceller i levern i alla fall (figur 2 och figur 3b). Emellertid, vissa fall hade spridning runt huvud tumören. Kontrastmedlet detekterar tumörer i levern på CT, inklusive små tumörer av 1 mm storlek (figur 3b). Re-implantation av kryopreserverade tumörer framgångsrikt etablerat dem i musen levern med hög framgång priser. Den re-implanterade xenograft tumörer efter kryopreservation behåller egenskaperna hos de ursprungliga patient tumörer och pre-kryopreserved tumörer.
Figur 1: patient-derived tumör xenograft musmodell av kirurgisk ortotopisk lever implantation. Mouse var euthanized efter 6 månader efter tumör implantation. Pigmenterad svart tumör (svart pil) är ukalv melanom. Tumören är inympad i den vänstra LOB i levern. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: lever ortoämne Human cell linje-derived tumör xenograft musmodell med hjälp av nål injektion metod. Mouse var euthanized 8 veckor efter tumör injektion. Pigmenterad svart tumör (svart pil) är ukalv melanom. Tumören är inympad i den vänstra LOB i levern. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: CT-bilder av levertumörer i vänster LOB i levern. Levertumörer upptäcks på förbättrad CT. normal levervävnad förstärks av kontrastmedel. Vita pilar indikerar magen bredvid levern. (A) tumören (svart pil) som tidigare visades i figur 1. Kirurgisk ortotopisk implantation bildar en solitär tumör. B) tumörerna (den svarta pilen) som visas tidigare i figur 2. Nål injektion metod bildar ett kluster av många små tumörer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: tekniska tips för levern Pocket metod. (a-C) Vänster lob (vita pilar) i levern kan exponeras ur buken med hjälp av en bomullstuss (svart pil) via en 1 cm snitt. En upprullningsdon krävs inte för att vidga snittet. Dbomullspinne pressar på snittet mjukt. Det erhåller hemostas efter att ha gjort ett snitt av skalpell (grön pil). (E) bomullspinne rullar uppåt (böjd röd pil). Detta lyfter leverparenkymet att öppna snittet. Tumören gula pilen) sätts in i levern fickan genom snittet av Ultrafine pincett (blå pil). (F) bomullspinne rullar nedåt (böjd röd pil) för att förhindra en insatt tumör i fickan från att backa ut. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De nuvarande ortotopiska xenograft-modellerna är arbetsintensiva, tidskrävande och dyra att skapa. Ortotopisk tumör xenograft musmodeller för levercancer etablerades mer än två decennier sedan19,20,21. Men denna teknik är komplicerad och kräver användning av särskild utrustning, såsom en mikro-nål hållare och 6-0 till 8-0 fina suturer under mikroskop. Tumör och normal levervävnad måste sys upp försiktigt så att suturen inte skadar den bräckliga levern vävnad. De konventionella teknikerna leder till komplikationer, såsom hematom och nekros22. Nyligen utvecklades en modifierad teknik för att lösa dessa problem23. Denna modifierade teknik använder absorberbara hemostatiska material i stället för sutur för att täcka tumören på levern ytan. Emellertid, denna modifierade metoden täcker inte helt tumören inom leverparenkymet. En del av tumören utsätts för utsidan. Vi utvecklade en kirurgisk ortotopisk implantation teknik-levern Pocket metod-att hus tumören helt inuti parenkymet18. Vår metod gör en ficka i levern för att ge en naturlig miljö för tumörer. Levern Pocket metod är enklare än konventionell teknik, tillåter oss att avsluta implantation i levern inom några minuter från början av operationen. Denna metod resulterar i bildandet av en solitär tumör i levern och utlöser inte metastaser, åtminstone så länge vi observerade möss, medan nål injektion av en enda cellsuspension tenderar att sprida som intrahepatiska metastaser17. En solitär tumör är lämpligare att utvärdera tumörtillväxt och skulle vara bra att bedöma effekten i en drog rättegång.
Jämfört med den ursprungliga levern Pocket metod18, vi har ändrat våra metoder för att förbättra tekniker för implantation. Först användes en upprullningsdon inte under operationen för att minimera storleken på snittet. När snittet är mindre, kan vi förkorta sömnads tiden i kirurgi. Med en 1 cm snitt i buken, kan vi enkelt föra vänster LOB utanför med en bomullstuss (figur 4a-C). För det andra, en bomullstuss spelar tre viktiga roller genom att stoppa hemostas efter att ha gjort levern fickan, öppna levern fickan för att kunna sätta in en tumör bit och behålla tumören bit i fickan utan att trycka tumören tillbaka (figur 4D- F). Den genomsnittliga blödnings volymen var ungefär mindre än 10% av cirkulerande blodvolym hos möss. Mindre blödning gav stort förtroende för kirurgi. Tredje, ett tyg blad är användbart för fastställande av leverlob utanför buken. Levern LOB pinnar till arket och därmed hindrar LOB från att glida tillbaka in i buken (figur 4c). Man kan lätt skära levern ytan med en skalpell och injicera en nål till levern ytan. Som ett resultat, bräcklig levervävnad inte skadas.
Vi presenterar två felsökningstips för den här metoden. Först, när en liten snitt plats används, ibland en vänster LOB är inte synlig. I denna situation, den vänstra LOB är sannolikt fastnar på membranet. Sätt avtrummade tång mellan vänster LOB och membranet att skala LOB av. För det andra, när en tumör bit placeras i levern fickan med tång, tumören kan hålla sig till pinps och dra tillbaka med den. Tryck på snittet med en bomullstuss medan du reträtt tång. Detta fungerar bra för att förhindra förskjutningar av tumören ur fickan.
Xenograft tumörer är omgivna av mus vävnad, även om de är ortotopiskt implanteras. Mänskliga stromacellceller i patient-derived tumörer oundvikligen ersätts av mus stromaceller. Helst hade musmodellen bättre ge mänsklig stromacellstumörer vävnad runt tumörer. Chimeric humaniserad lever mus eller humaniserad immun musmodeller skulle vara till hjälp för att studera inympelse av ukalv melanom och att utvärdera om läkemedelsmetabolismen är densamma som en människa-lever eller människa-immun miljö24,25.
Orthotopic lever tumör xenograft musmodeller kräver verifiering av tumör etablering med Imaging studier. Den kommersiellt tillgängliga CT kontrastmedel, utvecklad för mus lever CT-bilder, gör det möjligt att upptäcka inre levertumörer i levande tillstånd på CT. Kontrastmedlet förbättrar specifikt normal lever på CT. Det är lätt att skilja den oförstärkta platsen för tumören26. Agenten upptäcker små tumörer mindre än 1 mm (dotter noduli) runt huvud tumörer på CT. Agenten kan tolereras av musen, och gör det möjligt att övervaka levertumörer regelbundet. Agenten skulle användas för att utvärdera effekten av anti-cancerläkemedel mot lever-lokaliserade xenograft tumörer.
Generellt är det rekommenderat att underhålla PDX-modeller vid ett relativt lågt passage nummer (mindre än 10) för att bevara genetisk och histologisk integritet hos den ursprungliga patient-härledda tumören27,28,29. De flesta forskare avstå från att göra flera passager i PDX modeller för att minska antalet passager och djur. När patient-härledda tumörer tillfälligt bevaras i en frys, kan vi kontrollera PDX modeller på ett lägre passage nummer utan att slösa möss. Detta kallas biobankning strategi. En cancer Biobank är en rationell metod för att bibehålla tumör egenskaper och för att minska antalet möss28,30. Upprättandet av en ordentlig biobankning metod kan justera utbudet av PDX modeller för att möta patientens behandlingsplan eller en mus läkemedels effekt prövning i framtiden. Vi uppnådde förnyad implantation av kryopreserverade tumörer för cancer biobankning. Vi hoppas att denna framgång underlättar PDX plattforms användning inom en snar framtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot M. Ohara, K. Saito, och M. Terai, för att ha granskat manuskriptet. Författarna erkänner kritisk granskning för redaktionell och engelsk hjälp av detta manuskript av Dr. R. Sato på Fox Chase Cancer Center. Det arbete som beskrivs häri stöddes av Bonnie Kroll forskningsfonden, mark Weinzierl forskningsfonden, Eye melanom forskningsfond vid Thomas Jefferson University, Osaka community Foundation, och JSPS KAKENHI Grant Number JP 18K15596 på Osaka City University. Studier i Dr. A. Aplins laboratorium stöddes av NIH Grant R01 GM067893. Detta projekt finansierades också av en Dean ' s Transformative Science Award, en Thomas Jefferson University programmatiska Initiative Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials, tissues and animals | |||
| Buprenorphine | |||
| CO2 tank | |||
| Cryomedium | |||
| Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) | Miltenyl Biotec | 130-095-700 | |
| HBSS 1x, with calcium & magnesium | Corning | 21-020-CM | |
| Human liver metastatic uveal melanoma cell line | |||
| Human uveal melanoma tissue in the liver | All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections. | ||
| Iodine | |||
| Isoflurane | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| Isopropanol | Fisher scientific | A416-1 | Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent. |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel HC | BD | 354248 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | Jackson Lab | 5557 | 4 to 8 weeks old |
| PBS 1x, without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CM | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-013-CV | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Nice-Pak products | B603 | |
| 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | Wako | 163-20145 | |
| 70% Ethyl alcohol solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Absorbable hemostat | Johnson and Johnson | 63713-0019-61 | |
| Autoclave | |||
| Body weight measure | |||
| Cautery | Bovie Medical | MC-23009 | |
| Cell counter | |||
| Centrifuzer | |||
| Cotton swab | |||
| Cryo freezing container | NALGENE | 5100-0001 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72.379 | |
| Curved scissors | World Precision Instruments | 503247 | |
| Curved ultrafine forceps | World Precision Instruments | 501302 | |
| Fabric sheet | |||
| Freezer | |||
| F/AIR Filter Canister | Harvard Apparatus | 600979 | |
| Heating pad | |||
| Isoflurane vaporizer | Artisan Scientific | 66317-1 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Liquid nitrogen jar | Thermo Fisher Scientific | 2123 | |
| Micro-CT scan | Siemens | ||
| Needle holder | World Precision Instruments | 501246 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Pipette | |||
| Spray bottle | |||
| Sterile hood | Biosafety level 2 cabinet | ||
| Sterile No.11 scalpel | AD Surgical | A300-11-0 | |
| Straight forceps | World Precision Instruments | 14226 | |
| Surgical drape | |||
| Tail vein restrainer | Braintree Scientific | TV-150-STD | |
| Water bath | |||
| 1 mL TB syringe with 27 G needle | BD | 309623 | |
| 1.7 mL tube | Bioexpress | C-3260-1 | |
| 5-0 PDO Suture | AD Surgical | S-D518R13 | |
| 15 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9152N | |
| 27 G needle | BD | 780301 | |
| 27 G needle | Hamilton | 7803-01 | |
| 50 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9502N | |
| 50 µL micro syringe | BD | 80630 | |
| 50 µL micro syringe | Hamilton | 7655-01 | |
| 100 mL container | Fisher Scientific | 12594997 | |
| 200μL tip |
References
- Aronow, M. E., Topham, A. K., Singh, A. D. Uveal Melanoma: 5-Year Update on Incidence, Treatment, and Survival (SEER 1973-2013). Ocular Oncology and Pathology. 4 (3), 145-151 (2018).
- Krantz, B. A., Dave, N., Komatsubara, K. M., Marr, B. P., Carvajal, R. D. Uveal melanoma: epidemiology, etiology, and treatment of primary disease. Clinical Ophthalmology. 11, 279-289 (2017).
- Gragoudas, E. S., et al. Survival of patients with metastases from uveal melanoma. Ophthalmology. 98 (3), 383-389 (1991).
- Diener-West, M., et al. Development of metastatic disease after enrollment in the COMS trials for treatment of choroidal melanoma: Collaborative Ocular Melanoma Study Group Report No. 26. Archives of Ophthalmology. 123 (12), 1639-1643 (2005).
- Collaborative Ocular Melanoma Study Group. Assessment of metastatic disease status at death in 435 patients with large choroidal melanoma in the Collaborative Ocular Melanoma Study (COMS): COMS report no. 15. Archives of Ophthalmology. 119 (5), 670-676 (2001).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Némati, F., et al. Establishment and characterization of a panel of human uveal melanoma xenografts derived from primary and/or metastatic tumors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2352-2362 (2010).
- Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. International Journal of Oncology. 3 (3), 413-422 (1993).
- Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
- Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clinical Cancer Research. 14 (20), 6456-6468 (2008).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Bergamaschi, A., et al. Molecular profiling and characterization of luminal-like and basal-like in vivo breast cancer xenograft models. Molecular Oncology. 3 (5-6), 469-482 (2009).
- Ho, K. S., Poon, P. C., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Blood vessel hyperpermeability and pathophysiology in human tumour xenograft models of breast cancer: a comparison of ectopic and orthotopic tumours. BMC Cancer. 12, 579 (2012).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15 (8), 451-452 (2015).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (2), 217-221 (2009).
- Ozaki, S., et al. Establishment and Characterization of Orthotopic Mouse Models for Human Uveal MelanomaHepatic Colonization. American Journal of Pathology. 186 (1), 43-56 (2016).
- Kageyama, K., et al. Establishment of an orthotopic patient-derived xenograft mouse model using uveal melanomahepatic metastasis. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 145 (2017).
- Fu, X. Y., Besterman, J. M., Monosov, A., Hoffman, R. M. Models of human metastatic colon cancer in nude mice orthotopically constructed by using histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (20), 9345-9349 (1991).
- Rashidi, B., et al. An orthotopic mouse model of remetastasis of human colon cancer liver metastasis. Clinical Cancer Research. 6 (6), 2556-2561 (2000).
- Fan, Z. C., et al. Real-time monitoring of rare circulating hepatocellular carcinoma cells in an orthotopic model by in vivo flow cytometry assesses resection on metastasis. Cancer Research. 72 (10), 2683-2691 (2012).
- Jacob, D., Davis, J., Fang, B. Xenograftictumor modelsinmiceforcancer research, atechnical review. Gene Therapy and Molecular Biology. 8, 213-219 (2004).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. 25 (79), e50544 (2013).
- Kim, M., et al. Generation of humanized liver mouse model by transplant of patient-derived fresh human hepatocytes. Transplantation Proceedings. 46 (4), 1186-1190 (2014).
- Lavender, K. J., Messer, R. J., Race, B., Hasenkrug, K. J. Production of bone marrow, liver, thymus (BLT) humanized mice on the C57BL/6 Rag2(-/-)γc(-/-)CD47(-/-) background. Journal of Immunological Methods. 407, 127-134 (2014).
- Boll, H., et al. Micro-CT based experimental liver imaging using a nanoparticulate contrast agent: a longitudinal study in mice. PLoS One. 6 (9), e25692 (2011).
- Zhao, X., et al. Global gene expression profiling confirms the molecular fidelity of primary tumor-based orthotopic xenograft mouse models of medulloblastoma. Neuro-Oncology. 14 (5), 574-583 (2012).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer.Clinical. Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Alkema, N. G., et al. Biobanking of patient and patient-derived xenograft ovarian tumour tissue: efficient preservation with low and high fetal calf serum based methods. Scientific Reports. 6 (5), 14495 (2015).
