Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

Generation af en lever Orthotopic humant Ukalvekød melanom xenograft platform i immundefekt mus

doi: 10.3791/59941 Published: November 6, 2019

Summary

Ortotopisk humant lever metastatisk ukalvekød melanom xenograft musemodeller blev oprettet ved hjælp af kirurgiske ortotopiske implantations teknikker med patient-afledte tumor luns og nål injektion teknikker med kulturperler menneskelige ukalvekød melanom cellelinjer.

Abstract

I de seneste årtier, subkutant implanteret patient-afledte xenograft tumorer eller kulturperler menneskelige cellelinjer er blevet mere og mere anerkendt som mere repræsentative modeller til at studere menneskelige kræft i immundefekt mus end traditionelle etablerede humane celle linjer in vitro. Nylig, ortotopisk implanteret patient-afledte tumor xenograft (PDX) modeller i mus er blevet udviklet til bedre replikere funktioner af patientens tumorer. En lever ortotopisk xenograft musemodel forventes at være en nyttig kræftforskning platform, giver indsigt i tumor biologi og Drug Therapy. Men, lever ortotopisk tumor implantation er generelt kompliceret. Her beskriver vi vores protokoller for ortotopisk implantation af patient-afledte lever-metastatisk ukalvekød melanom tumorer. Vi dyrkede humane lever metastaserende ukalvekød melanom cellelinjer i immundefekt mus. Protokollerne kan resultere i konsekvent høje tekniske succesrater ved hjælp af enten en kirurgisk ortotopisk implantation teknik med bidder af patient-afledte ukalvekød melanom tumor eller en nål injektion teknik med kulturperler menneskelige cellelinje. Vi beskriver også protokoller for CT-scanning til at detektere indvendige levertumorer og for re-implantation teknikker ved hjælp af kryopræserverede tumorer at opnå re-engraftment. Sammen, disse protokoller giver en bedre platform for leveren ortotopisk tumor musemodeller af leveren metastatisk ukalvekød melanom i Translationel forskning.

Introduction

Ukalvekød melanom er den mest almindelige intraokulære maligne tumor blandt voksne i den vestlige verden. I løbet af de seneste 50 år, forekomsten af ukalvekød melanom (5,1 tilfælde per million) har været stabil i USA1,2. Ukalvekød melanom opstår fra melanocytter i iris, ciliære krop, eller choroid, og det er en ekstremt dødelig sygdom, når det udvikler metastase. Dødeligheden hos patienter med ukalvekød melanom metastase var 80% ved 1 år og 92% ved 2 år efter Initial diagnosticering af metastaser. Tiden mellem diagnosticering af metastaser og død er typisk kort, mindre end 6 måneder, uden hensyn til terapi3,4. Kræften spreder sig gennem blodet og har tendens til at overvejende metastaserer til leveren (89-93%)4,5. En effektiv musemodel er presserende behov for yderligere undersøgelse af lever-metastatisk ukalvekød melanom. For Translationel forskning, der er et klart krav om at generere en lever-lokaliseret metastatisk ukalvekød melanom musemodel.

Patient-afledte tumor xenograft (PDX) musemodeller forventes at give individualiserede medicin strategier. Disse modeller kan være prædiktiv for kliniske resultater, være nyttige for prækliniske Lægemiddelvurdering, og anvendes til biologiske undersøgelser af tumorer6. Repræsentative PDX-modeller er ektopisk tumor implanterede xenograft-mus, som har tumor på subkutane steder. De fleste forskere kan gøre kirurgi for subkutan implantation uden særlig praksis7,8. De kan også overvåge subkutane tumorer nemt. Selv om subkutane PDX-modeller blev populære i forskningsfasen, har de nogle forhindringer i at flytte til praktisk brug. Subkutan implantation tvinger patient-afledte tumorer til forankret i et andet mikromiljø fra tumoren oprindelse, således at det fører til engraftment fiasko og langsom tumorvækst 9,10,11, 12,13,14. Orthotopic engraftment kan være en mere ideel og rationel tilgang til en PDX-model, fordi det bruger det samme organ som den oprindelige tumor15,16.

For nylig har vi udviklet protokoller for kirurgiske ortotopiske implantations teknikker af patient-afledte lever-metastatisk ukalvekød melanom tumorer og nål injektion teknikker med en kulturperler menneskelige lever-metastatisk ukalvekød melanom cellelinje i NOD. CG-prkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG) mus17,18. Protokollerne resulterer i konsekvent høje tekniske succesrater. Vi etablerede også CT-scanningsteknikker, der er nyttige til at detektere indvendige levertumorer, og vi udviklede re-implantation af kryopræserverede tumorer i PDX-platformen. Vi fandt, at ukalvekød melanom tumor xenograft modeller opretholde egenskaberne af den oprindelige patient lever tumor, herunder deres histopatologiske og molekylære egenskaber. Sammen, disse teknikker giver en bedre platform for leveren ortotopisk tumormodeller for ukalvekød melanom i Translationel forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Patienter, som er tilmeldt studiet, skal give skriftligt samtykke til anvendelse af kasserede kirurgiske prøver til forskningsformål og genetiske undersøgelser i henhold til en protokol, som er godkendt af den institutionelle undersøgelse. Denne protokol blev gennemført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af de nationale sundhedsinstitutter og godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse (IACUC).

1. indsamling af frisk patient-afledt tumor væv

  1. Opnå patient-afledt tumor væv fra kirurgi eller en nål biopsi i et hospital operationsstue.
  2. Sæt tumorvævet i en 100 mL beholder indeholdende Hanks ' balanceret saltopløsning (HBSS) opløsning på is.
  3. Væv overføres til en steril hætte (biosikkerhedsniveau 2) i et laboratorium.
  4. Fortsæt til trin 2 så hurtigt som muligt.
    Bemærk: Af sikkerhedsmæssige årsager, udelukke patienter med kendt HIV eller hepatitis B eller C infektioner.

2. behandling af frisk patient afledt tumor væv

  1. Læg vævet i et 50 mL rør indeholdende fosfat-bufferet saltvand (PBS) på is. Til vask af vævet, tilsæt PBS i røret og kassér PBS fra røret to gange.
  2. Væv overføres til en Petri skål, der indeholder PBS på is.
  3. Brug sterile pincet og saks til at fjerne de nekrotiske dele af vævet. Hold vævet fugtigt og koldt under trin 2,3 til 2,5. Til nåle biopsiprøver, Spring over trin 2,3 og 2,5, og skær ikke prøverne.
    Bemærk: Det nekrotiske væv ofte bryder fra hinanden let, når de berøres.
  4. Skær vævet i 1 mm3 tern til kirurgisk lever implantation.
  5. Skær resten af vævet i 2 mm terninger i Petri skålen.
  6. De overføres til et 1,7 mm mikrorør med 4% formalin til histologisk analyse og til et andet rør til genomisk og proteopisk analyse.
  7. Sæt mikrorørene i en flydende nitrogen krukke med flydende nitrogen. Overfør rørene til a-80 °C fryser til permanent opbevaring.
    Bemærk: Tiden mellem prøveudtagning fra patienten og vævs behandling bør ikke overstige 30 min.

3. kirurgisk lever implantation med patient afledt tumor væv

  1. Spray alle genstande, som kommer ind i hætten til kirurgi med 70% ethylalkohol.
    Bemærk: Dette omfatter kirurgiske instrumenter, varmepuder og anæstesimaskiner.
  2. Mål vægten af en vatpind og stof ark.
  3. Anæstetize en mus med en 3 – 5% isofluran vaporizer ved at placere den i induktions kammeret.
  4. Når musen er fuldt bedøvet, placere den i liggende position på en varmepude. Placer isofluran keglen på musens snude for at inhalere 1,5 – 3% isofluran til vedligeholdelse af anæstesi.
    Bemærk: Musen skal være på varmepuden under hele proceduren. Manglende opvarmning kan forårsage hypotermi.
  5. Bekræft korrekt anæstesi ved ingen reaktion, når foden af musen er prikket med ultrafine pincet.
  6. Der indsprøjtes buprenorphin (0,6 mg/kg) subkutant på flanken med en 27 G nål på en mikro-sprøjte før operationen.
  7. Påfør 70% ethylalkohol i maven, og spred pels opad og nedad. Efter spredning af pels, Bekræft lettere visualisering af huden under den venstre hypokondriumet område for en lettere snit. Du må ikke barbering af pels fra maven.
    Bemærk: Pelsen vil skjule incisionsstedet efter operationen og forhindre musen i at ridse incisionen efter operationen. Du kan dog barbere pels for at forhindre infektion af incisionsstedet i henhold til institutionelle standarder.
  8. Påfør jod og lad det blive absorberet i huden.
  9. Placer et sterilt kirurgisk drapere med et 2 cm hul på musen.
  10. Løft abdominal hud med buede ultrafine pincet og gøre en 1 cm tværgående venstre hypokondriumet hud indsnit med buet saks.
  11. Indsæt spidsen af den buede saks under huden af snittet og lidt åbne dem for at adskille bughinden fra huden. Træk saksen tilbage fra snittet med lukkede knive.
    Bemærk: Åbning og lukning af en saks inde i musen kan forårsage skader og blødning.
  12. Find leveren under peritoneum. Bekræft en mørk rødlig farve gennem peritoneum.
  13. Med buet saks, lav en 1 cm tværgående snit i peritoneum. Hvis en peritonealdialyse arterie bløder fra skærkanten, straks stoppe blødningen med Cautery.
  14. Grab fedtvæv ved hjælp af buede ultrafine pincet med den ene hånd, Indsæt kanten af en vatpind under den venstre lever lap og rul vatpind nedad med den anden hånd for at bringe leveren ud.
    Bemærk: Grabbing fedtvæv er vigtigt at holde fedtvævet fra stikning til vatpind.
  15. Exteriorize leveren på vatpind og placere leveren på en ikke-vævet absorberende stof ark.
    Bemærk: Stoffet ark spiller to vigtige roller i stabiliserende leveren og absorbere blødning.
  16. Lav et snit 5 mm i bredde og dybde ved hjælp af en steril No. 11 skalpel klinge til at danne en lomme i parentchyma, mens blødt at trykke på incisionsstedet med vatpind.
    1. Skær kniven parallelt med overfladen af leveren og skæres vandret.
    2. Tryk på incisionsstedet med vatpind for at stoppe enhver blødning.
      Bemærk: Hold ikke kniven lodret, ellers vil du bryde gennem leveren og skade store beholdere i midten af leveren.
  17. Rul vatpind opad for at åbne incisionsstedet og implantere en 1 mm3 kube af tumor væv i lommen med buede ultrafine pincet. Træk pincet tilbage, mens du ruller vatpind i omvendt rotation og trykker ned.
    Bemærk: Tryk ned på incisionsstedet med vatpind, mens trække pincet hjælper med at forhindre forskydning af tumoren inde i lommen.
  18. Tag forsigtigt vatpind ud af incisionsstedet efter implantation. Fortsæt til trin 3,19 så hurtigt som muligt.
  19. Put en absorberbare hemostat på incisionstedet.
  20. Bekræft hæmostase. Hvis blødningen fortsætter, tilsæt mere hemostat på incisionstedet.
  21. Skræl leveren af stof arket med pincet (fortrinsvis stump) og sæt leveren tilbage i bughulen.
  22. Sutur bughinden med dobbelt ligatur med 5-0 absorberbare sutur.
  23. Sutur hud med tredobbelt ligatur med 5-0 absorberbare sutur.
    Bemærk: Tredobbelt ligatur hjælper med at forhindre kirurgisk indsnit dehiscens.
  24. Observere musen, indtil helt vågen og sætte den tilbage i buret.
  25. Mål vægten af vatpind og stoffet ark med blod til blødning volumen under operationen. Sammenlign dem med deres oprindelige vægt før operationen. Reducer blødning under operationen til mindre end 10% af cirkulerende blodvolumen i mus.

4. indsamling og behandling af dyrkede humane lever metastaserende Ukalvekød melanom cellelinje

  1. Forbered kultiverede celler.
  2. Saml celler og Beregn celle nummeret ved hjælp af en celle tæller.
  3. Forbered en passende mængde cellesuspension til 10,0 x 106 celler i et 15 ml rør.
  4. Drej røret ved 300 x g i 5 minutter i en centrifuge ved stuetemperatur.
  5. Supernatanten fjernes i 15 mL-røret. Lad celle pellet i bunden af røret.
  6. Tilsæt 50 μL RPMI 1640 medium til et 1,7 mL rør.
  7. Skær spidsen af en 200 μL spids med en saks for at forstørre spids åbningen.
  8. Tilsæt 60 μL kælder membran matrix ved hjælp af en pipette med den afskårne spids i 1,7 mL røret, der har RPMI.
  9. Bland RPMI og matrix i 1,7 mL røret. Vortex det.
  10. Tilsæt 110 μL af blandingen i celle pellet i 15 mL røret. Cellesuspensionen overføres til et nyt 1,7 mL rør.
  11. Hold røret på is før injektion af kanylen.

5. kirurgisk nål implantation af kulturperler humant lever metastatisk Ukalvekød melanom cellelinje i leveren

  1. Følg ovenstående protokol fra trin 3,1 til 3,15.
  2. Opsaml cellesuspensionen med en mikrosprøjte med en 27 G nål.
  3. Indsæt nålen langs overfladen af leveren og forskud spidsen af nålen 5 mm dybere.
  4. Injicer 20 μL cellesuspension i leveren.
  5. Cauterize indsætningspunktet af leveren for at forhindre de injicerede celler i at lække ud. Bekræft hæmostase.
  6. Følg ovenstående protokol fra trin 3,21 til 3,24.

6. CT-scanning

  1. Placer musen i en fastholdelses i vågen tilstand.
  2. Tør halen med en steril alkohol pude til desinfektion og vasodilatation.
  3. Injicer 100 μL CT-kontrastmiddel gennem hale vene med en 27 G nål på en 1 mL sprøjte.
  4. Vent 4 timer efter injektion, før du tager CT-scanningen.
    Bemærk: Det tager 4 h indtil agenten er taget op af leveren Kupffer celler.
  5. Fire timer efter injektion, bedøve den tumor bærende mus med 3 – 5% fordampet isofluran ved at placere den i induktions kammeret.
  6. Når musen er fuldt bedøvet, placere den i udsatte position på en CT. Placer isofluran keglen på musens snude for at inhalere 1,5 – 3% isofluran til vedligeholdelse af anæstesi.
  7. Bekræft korrekt anæstesi ved ingen reaktion, når foden af musen er prikket med ultrafine pincet.
  8. Tag en CT-scanning i 15 min.
  9. Sørg for, at musen, indtil det er fuldt vækket efter CT-scanning og sætte den tilbage i buret.
  10. Vurder for eksistensen af tumor og måle tumorstørrelse på CT billeder.
    Bemærk: Kontrastmidlet forbedrer normal leverparenkyma, så det er let at genkende ikke-forstærket tumor. Må ikke misfortolke galdeblæren og maven som tumor.

7. høst og forarbejdning af væv

  1. Euthanize mus ved hjælp af CO2 efterfulgt af livmoderhalsen dislokation ved at placere pegefingeren og tommelfingeren bag kraniet og trække kroppen ved foden af halen. Fortsæt til trin 7,2 så hurtigt som muligt.
  2. Placer musen i en liggende position og spray maven med 70% ethylalkohol.
  3. Brug sterile pincet og steril saks til at lave en 3-cm tværgående indsnit under xiphoid processen for at udsætte de abdominale organer.
  4. Punkt i tumorvæv og udføre trin 2,1 til 2,2.
  5. Skær resten af tumoren i 2 mm terninger i Petri skålen.
  6. Overfør dem til et kryogenrør med cryomedium til genimplantation efter kryopræservering.
  7. Sæt rørene i en kryogen fryse beholder fyldt med isopropanol.
  8. Overfør beholderen til a-80 °C fryser til midlertidig opbevaring. Kryorørene må ikke sættes direkte i en flydende nitrogen tank. Fryse dem langsomt ved en afkølingshastighed på-1 °C/min at bevare tumor væv.
  9. På den næste dag, overføre rørene til en flydende nitrogen tank til permanent opbevaring.

8. re-implantation

  1. Hold rørene frosne i en flydende nitrogen krukke med flydende nitrogen, indtil de er klar til implantat vævet. Minimer eksponeringen af vævet til stuetemperatur for at opretholde levedygtighed og øge chancerne for engraftment.
  2. Tø kryopræserverede tube i et 37 °c vandbad.
  3. Udfør trin 2.2 – 2.4.
  4. Den optøede tumor implanteret i mus som beskrevet i trin 3.1 – 3.24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kirurgisk ortotopisk implantation ved hjælp af lever lomme metoden kan transplanteres humant lever metastatisk ukalvekød melanom tumor i muse leveren med en høj succesrate på 80% inden for seks måneder. Xenograft tumor engrafts i leveren som en ensomme tumor uden datter knuder (figur 1 og figur 3a). Den kirurgiske ortotopiske injektionsteknik i leveren ved hjælp af microneedles med succes indpodet kulturperler menneskelige lever-metastatisk ukalvekød melanom celler i leveren i alle tilfælde (figur 2 og figur 3b). Men, nogle tilfælde havde udbredelse omkring de vigtigste tumor. Kontrastmidlet detekterer tumorer i leveren på CT, herunder små tumorer af 1 mm størrelse (figur 3b). Re-implantation af kryopræserverede tumorer med succes etableret dem i muse leveren med høj succesrater. De genimplanterede xenograft tumorer efter kryopræservering bevarer egenskaberne for de oprindelige patientens tumorer og præ-cryopreserved tumorer.

Figure 1
Figur 1: patient-afledt tumor xenograft musemodel ved kirurgisk ortotopisk lever implantation. Mus blev aflives efter 6 måneder efter tumor implantation. Pigmenteret sort tumor (sort pil) er ukalvekød melanom. Tumoren er indpodet i den venstre lap i leveren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: leveren ortotopisk Human celle line-afledte tumor xenograft musemodel ved hjælp af nål injektion metode. Mus blev aflives 8 uger efter tumor injektion. Pigmenteret sort tumor (sort pil) er ukalvekød melanom. Tumoren er indpodet i den venstre lap i leveren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: CT billeder af leveren tumorer i venstre lap af leveren. Levertumorer opdages på øget CT. normal lever væv forstærkes af kontrastmiddel. Hvide pile indikerer maven ved siden af leveren. (A) tumoren(sort pil), der tidligere var vist i figur 1. Kirurgisk ortotopisk implantation danner en ensomme tumor. (B) tumorer (sort pil) vist tidligere i figur 2. Nål injektion metode danner en klynge af mange små tumorer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: tekniske tips til leveren lomme metode. (A-C) Venstre lap (hvide pile) af leveren kan eksponeres ud af maven ved hjælp af en vatpind (sort pil) via en 1 cm incision. En retraktor er ikke forpligtet til at udvide snittet. (D) vatpind presser på snittet blødt. Det opnår hæmostase efter at gøre et snit af skalpel (grøn pil). (E) vatpind ruller opad (buet rød pil). Dette løfter leveren parenkym at åbne snittet. Den gule tumor pil) indsættes i lever lommen gennemsnittet af ultrafine pincet (blå pil). (F) vatpind ruller nedad (buet rød pil) for at forhindre en indsat tumor i lommen fra opbakning ud. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De nuværende ortotopisk xenograft-modeller er arbejdskraftintensive, tidskrævende og dyre at skabe. Orthotopic tumor xenograft musemodeller for leverkræft blev etableret mere end to årtier siden19,20,21. Men denne teknik er kompliceret og kræver brug af særligt udstyr, såsom en mikro-nål holder og 6-0 til 8-0 fine suturer under et mikroskop. Tumor og normal lever væv skal sys omhyggeligt, således at suturen ikke skader den skrøbelige lever væv. De konventionelle teknikker fører til komplikationer, såsom hæmatomer og nekrose22. For nylig blev en modificeret teknik udviklet til at løse disse problemer23. Denne modificerede teknik bruger absorberbare hemostatiske materialer i stedet for sutur til at dække tumoren på leveren overflade. Men, denne modificerede metode dækker ikke helt tumoren i leveren parenchyma. En del af tumoren er udsat for udefra. Vi udviklede en kirurgisk ortotopisk implantation teknik-den lever lomme metode-at huse tumoren helt inde i parentchyma18. Vores metode gør en lomme i leveren til at give et naturligt miljø for tumorer. Leveren lomme metode er enklere end den konventionelle teknik, så vi kan afslutte implantation i leveren inden for et par minutter fra begyndelsen af operationen. Denne metode resulterer i dannelsen af en ensom tumor i leveren og udløser ikke metastaser, i det mindste så længe vi observerede musene, hvorimod nåle injektion af en enkelt cellesuspension har tendens til at sprede sig som intra-hepatiske metastaser17. En ensomme tumor er mere hensigtsmæssigt at evaluere tumorvækst og ville være nyttigt at vurdere effekten i et stof forsøg.

Sammenlignet med den oprindelige lever lomme metode18, har vi ændret vores metoder til at forbedre teknikker til implantation. For det første blev en retraktor ikke brugt under operationen for at minimere størrelsen af snittet. Når snittet er mindre, kan vi forkorte sytid i kirurgi. Med en 1 cm indsnit i maven, kan vi nemt bringe den venstre lap udenfor med en vatpind (figur 4a-C). For det andet, en vatpind spiller tre vigtige roller ved at stoppe hæmostase efter at gøre leveren lommen, åbning af leveren lomme til at være i stand til at indsætte en tumor luns og bevare tumoren luns i lommen uden at skubbe tumoren tilbage (figur 4d- F). Den gennemsnitlige blødnings volumen var ca. mindre end 10% af det cirkulerende blodvolumen i mus. Mindre blødning gav stor tillid til kirurgi. For det tredje, et stof ark er nyttigt til fastgørelse af leveren lobe uden for maven. Leveren lobe klæber til arket og dermed forhindrer lobe fra glide tilbage i maven (figur 4c). Man kan nemt skære leveren overflade med en skalpel og injicere en nål til leveren overflade. Som et resultat, skrøbelige lever væv er ikke såret.

Vi præsenterer to fejlfindingstip til denne metode. Først, når en lille incisionsite anvendes, nogle gange en venstre lap er ikke synlig. I denne situation, den venstre lap er sandsynligvis stikning til membranen. Indsæt blunted-kant Tang mellem venstre lap og mellem gulvet for at skrælle lobe af. For det andet, når en tumor luns er placeret i leveren lommen med pincet, kan tumoren holde sig til pincet og trække sig tilbage med det. Tryk på snittet med en vatpind, mens du trækker pincet af. Dette fungerer godt for at forhindre dislokation af tumoren ud af lommen.

Xenograft tumorer er omgivet af mus væv, selv om de er ortotopisk implanteret. Humane stromale celler i patient-afledte tumorer er uundgåeligt erstattet af mus stromale celler. Ideelt, musemodel havde bedre give menneskelige stromale væv omkring tumorer. Chimerisk humaniseret lever mus eller humaniseret immun musemodeller ville være nyttigt at studere engraftment af ukalvekød melanom og til at vurdere, om stofskiftet er det samme som en menneske-lever eller menneske-immun miljø24,25.

Orthotopic lever tumor xenograft musemodeller kræver verifikation af tumor etablering med billeddannelse undersøgelser. Den kommercielt tilgængelige CT kontrastmiddel, udviklet til mus leveren CT billeder, tillader påvisning af indvendige levertumorer i livetilstand på CT. Kontrastmidlet forbedrer specifikt normal leveren på CT. Det er nemt at skelne det ikke-forbedrede site af tumoren26. Agenten opdager små tumorer mindre end 1 mm (datter knuder) omkring hoved tumorer på CT. Agenten kan tolereres af musen, og gør det muligt at overvåge levertumorer periodisk. Agenten ville blive brugt til at evaluere effekten af anti-cancer medicin mod lever-lokaliseret xenograft tumorer.

Generelt anbefales det at vedligeholde PDX-modeller ved et relativt lavt passage nummer (mindre end 10) for at bevare den genetiske og histologiske integritet af den oprindelige patient afledte tumor27,28,29. De fleste forskere afstå fra at gøre flere passager i PDX modeller til at reducere antallet af passager og dyr. Når patient-afledte tumorer er midlertidigt bevaret i en fryser, vi er i stand til at styre PDX-modeller på et lavere passage nummer uden at spilde mus. Dette kaldes biobanking strategi. En kræft biobank er en rationel tilgang til at opretholde tumor egenskaber og reducere antallet af mus28,30. Etablering af en ordentlig biobanking metode kan justere udbuddet af PDX modeller til at opfylde patientens behandling plan eller en mus Drug effektivitet retssag i fremtiden. Vi opnåede re-implantation af kryopræserverede tumorer for kræft biobanking. Vi håber, at denne succes letter brugen af PDX-platformen i den nærmeste fremtid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for M. Ohara, K. Saito og M. Terai, for at gennemgå manuskriptet. Forfatterne anerkender kritisk gennemgang for redaktionel og engelsk assistance af dette manuskript af Dr. R. Sato på Fox Chase Cancer Center. Det arbejde, der er beskrevet heri, blev støttet af Bonnie Kroll Research fund, Mark Weinzierl forskningsfond, Eye Melanoma forskningsfond på Thomas Jefferson University, Osaka community Foundation, og JSPS KAKENHI Grant Number JP 18K15596 hos Osaka City Universitet. Undersøgelser i Dr. A. Aplins laboratorium blev støttet af NIH Grant R01 GM067893. Dette projekt blev også finansieret af en Dean's transformative Science Award, en Thomas Jefferson University programmatisk initiativ Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials, tissues and animals
Buprenorphine
CO2 tank
Cryomedium
Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) Miltenyl Biotec 130-095-700
HBSS 1x, with calcium & magnesium Corning 21-020-CM
Human liver metastatic uveal melanoma cell line
Human uveal melanoma tissue in the liver All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections.
Iodine
Isoflurane Purdue Products 67618-150-17
Isopropanol Fisher scientific A416-1 Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent.
Liquid nitrogen
Matrigel HC BD 354248
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice Jackson Lab 5557 4 to 8 weeks old
PBS 1x, without calcium and magnesium Corning 21-031-CM
RPMI 1640 Corning 10-013-CV
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) Nice-Pak products B603
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution Wako 163-20145
70% Ethyl alcohol solution Fisher Scientific 04-355-122
Name Company Catalog Number Comments
Equipments
Absorbable hemostat Johnson and Johnson 63713-0019-61
Autoclave
Body weight measure
Cautery Bovie Medical MC-23009
Cell counter
Centrifuzer
Cotton swab
Cryo freezing container NALGENE 5100-0001
Cryotube SARSTEDT 72.379
Curved scissors World Precision Instruments 503247
Curved ultrafine forceps World Precision Instruments 501302
Fabric sheet
Freezer
F/AIR Filter Canister Harvard Apparatus 600979
Heating pad
Isoflurane vaporizer Artisan Scientific 66317-1
Liquid nitrogen
Liquid nitrogen jar Thermo Fisher Scientific 2123
Micro-CT scan Siemens
Needle holder World Precision Instruments 501246
Petri dishes Fisher Scientific FB0875713
Pipette
Spray bottle
Sterile hood Biosafety level 2 cabinet
Sterile No.11 scalpel AD Surgical A300-11-0
Straight forceps World Precision Instruments 14226
Surgical drape
Tail vein restrainer Braintree Scientific TV-150-STD
Water bath
1 mL TB syringe with 27 G needle BD 309623
1.7 mL tube Bioexpress C-3260-1
5-0 PDO Suture AD Surgical S-D518R13
15 mL conical tubes AZER SCIENTIFIC ES-9152N
27 G needle BD 780301
27 G needle Hamilton 7803-01
50 mL conical tubes AZER SCIENTIFIC ES-9502N
50 µL micro syringe BD 80630
50 µL micro syringe Hamilton 7655-01
100 mL container Fisher Scientific 12594997
200μL tip

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aronow, M. E., Topham, A. K., Singh, A. D. Uveal Melanoma: 5-Year Update on Incidence, Treatment, and Survival (SEER 1973-2013). Ocular Oncology and Pathology. 4, (3), 145-151 (2018).
  2. Krantz, B. A., Dave, N., Komatsubara, K. M., Marr, B. P., Carvajal, R. D. Uveal melanoma: epidemiology, etiology, and treatment of primary disease. Clinical Ophthalmology. 11, 279-289 (2017).
  3. Gragoudas, E. S., et al. Survival of patients with metastases from uveal melanoma. Ophthalmology. 98, (3), 383-389 (1991).
  4. Diener-West, M., et al. Development of metastatic disease after enrollment in the COMS trials for treatment of choroidal melanoma: Collaborative Ocular Melanoma Study Group Report No. 26. Archives of Ophthalmology. 123, (12), 1639-1643 (2005).
  5. Collaborative Ocular Melanoma Study Group. Assessment of metastatic disease status at death in 435 patients with large choroidal melanoma in the Collaborative Ocular Melanoma Study (COMS): COMS report no. 15. Archives of Ophthalmology. 119, (5), 670-676 (2001).
  6. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, (9), 998-1013 (2014).
  7. Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4, (11), 1670-1680 (2009).
  8. Némati, F., et al. Establishment and characterization of a panel of human uveal melanoma xenografts derived from primary and/or metastatic tumors. Clinical Cancer Research. 16, (8), 2352-2362 (2010).
  9. Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. International Journal of Oncology. 3, (3), 413-422 (1993).
  10. Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1, (3), 471-475 (2010).
  11. Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clinical Cancer Research. 14, (20), 6456-6468 (2008).
  12. Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, (13), 3989-3998 (2007).
  13. Bergamaschi, A., et al. Molecular profiling and characterization of luminal-like and basal-like in vivo breast cancer xenograft models. Molecular Oncology. 3, (5-6), 469-482 (2009).
  14. Ho, K. S., Poon, P. C., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Blood vessel hyperpermeability and pathophysiology in human tumour xenograft models of breast cancer: a comparison of ectopic and orthotopic tumours. BMC Cancer. 12, 579 (2012).
  15. Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, (8), 451-452 (2015).
  16. Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85, (2), 217-221 (2009).
  17. Ozaki, S., et al. Establishment and Characterization of Orthotopic Mouse Models for Human Uveal MelanomaHepatic Colonization. American Journal of Pathology. 186, (1), 43-56 (2016).
  18. Kageyama, K., et al. Establishment of an orthotopic patient-derived xenograft mouse model using uveal melanomahepatic metastasis. Journal of Translational Medicine. 15, (1), 145 (2017).
  19. Fu, X. Y., Besterman, J. M., Monosov, A., Hoffman, R. M. Models of human metastatic colon cancer in nude mice orthotopically constructed by using histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, (20), 9345-9349 (1991).
  20. Rashidi, B., et al. An orthotopic mouse model of remetastasis of human colon cancer liver metastasis. Clinical Cancer Research. 6, (6), 2556-2561 (2000).
  21. Fan, Z. C., et al. Real-time monitoring of rare circulating hepatocellular carcinoma cells in an orthotopic model by in vivo flow cytometry assesses resection on metastasis. Cancer Research. 72, (10), 2683-2691 (2012).
  22. Jacob, D., Davis, J., Fang, B. Xenograftictumor modelsinmiceforcancer research, atechnical review. Gene Therapy and Molecular Biology. 8, 213-219 (2004).
  23. Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. 25, (79), e50544 (2013).
  24. Kim, M., et al. Generation of humanized liver mouse model by transplant of patient-derived fresh human hepatocytes. Transplantation Proceedings. 46, (4), 1186-1190 (2014).
  25. Lavender, K. J., Messer, R. J., Race, B., Hasenkrug, K. J. Production of bone marrow, liver, thymus (BLT) humanized mice on the C57BL/6 Rag2(-/-)γc(-/-)CD47(-/-) background. Journal of Immunological Methods. 407, 127-134 (2014).
  26. Boll, H., et al. Micro-CT based experimental liver imaging using a nanoparticulate contrast agent: a longitudinal study in mice. PLoS One. 6, (9), e25692 (2011).
  27. Zhao, X., et al. Global gene expression profiling confirms the molecular fidelity of primary tumor-based orthotopic xenograft mouse models of medulloblastoma. Neuro-Oncology. 14, (5), 574-583 (2012).
  28. Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer.Clinical. Cancer Research. 12, (15), 4652-4661 (2006).
  29. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, (17), 5315-5319 (2013).
  30. Alkema, N. G., et al. Biobanking of patient and patient-derived xenograft ovarian tumour tissue: efficient preservation with low and high fetal calf serum based methods. Scientific Reports. 6, (5), 14495 (2015).
Generation af en lever Orthotopic humant Ukalvekød melanom xenograft platform i immundefekt mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kageyama, K., Ozaki, S., Sato, T. Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (153), e59941, doi:10.3791/59941 (2019).More

Kageyama, K., Ozaki, S., Sato, T. Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (153), e59941, doi:10.3791/59941 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter