Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الكشف عن 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا الجذعية العصبية وعقول الفئران

Published: September 19, 2019 doi: 10.3791/59950
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1,2
1The Children's Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, 2The Institute of Translational Medicine, School of Medicine, Zhejiang University

Summary

هنا، نقدم بروتوكول للكشف عن 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا وأنسجة الدماغ، وذلك باستخدام تلطيخ الفلورة المناعية وطرق الحمض النووي نقطة لطخة.

Abstract

وقد تم تحديد تعديلات الحمض النووي متعددة في الجينوم الثدييات. ومن هذا السبب، تمت دراسة الآليات الجينية بوساطة 5-ميثيل سيتوسين و5-هيدروكسي ميثيل السيتوسين بوساطة مكثفة. 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين يعرض السمات الديناميكية أثناء النمو الجنيني وبعد الولادة في الدماغ، ويلعب وظيفة تنظيمية في التعبير الجيني، ويشارك في اضطرابات عصبية متعددة. هنا، ونحن نصف الطرق التفصيلية بما في ذلك تلطيخ الفلورة المناعية والحمض النووي نقطة وصمة عار للكشف عن 5-هيدروكسي ميثيلسيتوسين في الخلايا المستزرعة وأنسجة الدماغ من الماوس.

Introduction

وقد ثبت التعديلات الجيني، بما في ذلك تعديل الحمض النووي، وتعديل الهيستون وتعديل الحمض النووي الريبي، للعب وظائف أساسية في العمليات البيولوجية المتنوعة والأمراض1،2،3، 4 , 5 , 6 , 7- ولفترة طويلة، اعتُبر مثيلة الحمض النووي (أي 5-ميثيلسيتوسين (5-م.م)) علامة جينية مستقرة للغاية ولا يمكن تعديلها مرة أخرى في الجينوم. في الآونة الأخيرة، تم العثور على أن 5-mC يمكن أكسدة إلى 5-هيدروكسي ميثيلسيتوسين (5-hmC) من قبل TET (10-11 translocations) البروتينات العائلية بما في ذلك TET1، TET2، وTET38،9. وتظهر دراسات أخرى أن 5-hmC يمكن أن تكون بمثابة علامة مستقرة ولعب الأدوار البيولوجية من خلال تنظيم التعبير الجيني4،10،11،12.

وتشير الأدلة الحالية إلى أن 5-hmC هو المخصب للغاية في الأنسجة العصبية / الخلايا بالنسبة لأنواع أخرى من الأنسجة في الثدييات، ويعرض الميزات الديناميكية خلال تطوير الخلايا العصبية13،14. في الجهاز العصبي، 5-hmC بوساطة التعديلات الجينية تلعب دورا هاما في تنظيم الخلايا الجذعية العصبية، والنشاط العصبي، والتعلم والذاكرة، وتشارك في اضطرابات عصبية متعددة بما في ذلك متلازمة ريت، التوحد، الزهايمر المرض، مرض هنتنغتون، الخ2،13،15،16،17،18،19،20.

هناك العديد من النهج للكشف عن 5-hmC في الخلايا والأنسجة14،21،22،23،24. هنا، ونحن نصف طريقتين للكشف عن وجود 5-hmC وكمية المستوى العالمي من 5-hmC: تلطيخ الفلورة المناعية والحمض النووي نقطة وصمة عار. هذه الطريقتين مريحة وحساسة، وقد استخدمت بنجاح في الدراسات السابقة25،26،27،28،29،30. الخطوات الرئيسية لهذين الأسلوبين هي إزالة الحمض النووي. لتلطيخ مناعة 5-hmC، مطلوب المعالجة المسبقة للعينات مع 1 M حمض الهيدروكلوريك. ل5-hmC نقطة وصمة عار، يتم تنفيذ denaturation الحمض النووي مع حل هيدروكسيد الصوديوم. هذه الطريقتين جنبا إلى جنب مع تسلسل الجيل القادم هي أدوات مفيدة جداً للتحقيق في وظيفة 5-hmC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافقت لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة تشجيانغ على جميع الإجراءات الحيوانية.

1. ثقافة الخلايا الجذعية العصبية الكبار والخلايا العصبية

  1. عزل الخلايا الجذعية العصبية الكبار من الدماغ الأمامي للبالغين (8-10 أسبوع من العمر) C57/BL6 الماوس الذكور كما هو موضح سابقا31،32.
  2. ثقافة الخلايا الجذعية العصبية الكبار في DMEM / F-12 المتوسطة التي تحتوي على 20 نانوغرام / مل FGF-2، 20 نانوغرام / مل EGF، 2٪ B27 الملحق، 1٪ مضاد للمضادات الحيوية المضادة للميتيكونتيك، و 2 مل L-الجلوتامين في حاضنة CO2 5٪ في 37 درجة مئوية. حث على التمييز بين الخلايا الجذعية العصبية الكبار مع 1 μM حمض الريتينويك و 5 ميكرومتر فورسكولين لمدة 48 ح كما هو موضح سابقا31،32.
  3. عزل الخلايا العصبية من اليوم الجنيني 17 (E17) hippocampi من الماوس والثقافة مع المتوسطة العصبية التي تحتوي على 0.25٪ L-الجلوتامين، 0.125٪ الجلوتاماكس و 2٪ B27 الملحق في حاضنة CO2 5٪ في 37 درجة مئوية كما سبق وصفها33.

2. التسريب عبر القلب من الماوس

  1. إعداد 10٪ من هيدرات الكلورال، 4٪ بارافورمالهايد (PFA) والفوسفات المخزنة المالحة (PBS) قبل يوم واحد من التجربة، وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  2. التخدير ذكر أو أنثى بالغ C57 BL/6J الماوس مع 10٪ من الهيدرات الكلورال (50 ملغ / كغ، i.p.)، وضمان أن الحيوان هو التخدير العميق عن طريق التحقق من رد فعل الجسم. إصلاح كل طرف مع الشريط لزجة على لوحة من البلاستيك (في موقف الوجه المتابعة).
  3. قطع الجلد ثم العضلات مع مقص الجراحة. فتح تجويف الصدر مع مقص الجراحية. كشف القلب وقطع جزء صغير من الأذين الأيمن مع مقص الجراحية غرامة.
  4. Perfuse الماوس مع حقنة معقمة المتاح 10 مل من البطين الأيسر مع PBS الباردة (حوالي 30 مل لكل فأر بالغ).
  5. Perfuse الماوس مع 4٪ PFA (حوالي 30 مل في 10 دقيقة لكل الفئران الكبار) حتى يكون قاسية.
  6. فتح جمجمة الماوس مع ملقط العظام. إزالة الدماغ ووضعها في 5 مل من 4٪ PFA في أنبوب الطرد المركزي 15 مل لتثبيت ما بعد في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: تنظيف المنطقة الجراحية بعد انتهاء الجراحة.
  7. على الأقل 24 ساعة في وقت لاحق، نقل عينات الدماغ إلى محلول السكروز 30٪ للجفاف الكامل في 4 درجة مئوية.

3. قسم الدماغ

  1. تضمين عينات الدماغ في مجمع درجة الحرارة القطع الأمثل (أكتوبر) في حاوية صغيرة، وتهدئة في -20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل.
  2. قسم عينات الدماغ في سمك 20-40 ميكروم مع ميكروتومي cryostat.
  3. جمع المقاطع في PBS وتخزينها في 4 درجة مئوية.

4. تلطيخ الفلورة المناعية

  1. التقاط المقاطع مع مناطق الدماغ المستهدفة ووضعها في لوحة 24 جيدا مع PBS. للخلايا المستزرعة على غطاء، انتقل مباشرة إلى الخطوة 4.2.
  2. غسل مع PBS على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  3. إزالة PBS، وعلاج مع محمّى مسبقا 1 M حمض الهيدروكلوريك لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: إعداد 1 M حمض الهيدروكلوريك عن طريق إضافة 1 مل من حمض الهيدروكلوريك (36-38٪) إلى 10 مل من الماء في غطاء محرك السيارة الكيميائية. سخني 1 م حمض الهيدروكلوريك في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
  4. غسل العينات مع PBS لمدة 5 دقائق.
  5. كتل عينات مع PBS تحتوي على 3٪ مصل الماعز العادي و 0.1٪ تريتون X-100 لمدة 1 ساعة على شاكر في درجة حرارة الغرفة.
  6. حضانة أقسام مع الأجسام المضادة الأولية محددة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية على شاكر.
    ملاحظة: استخدم الأجسام المضادة الأولية التالية: الأجسام المضادة للأرانب متعدد الكلونات المضادة للهيدروكسي ميثيل سيتوسين (1:5,000)، الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة للنيوين (1:500).
  7. إخراج العينات، وحضانة أخرى في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  8. اغسل العينات مع PBS لمدة 10 دقائق.
  9. حضانة مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة للأجسام المضادة الأولية في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على شاكر. تغطية لوحة مع الألومنيوم.
    ملاحظة: استخدام الأجسام المضادة الثانوية التالية: اليكسا فلور 488 الماعز المضادة للأرنب IgG (1:500)، اليكسا فلور 568 الماعز المضادة للماوس IgG (1:500). نوى مضادة للبقع مع 4′-6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI).
  10. غسل العينات مع PBS لمدة 10 دقيقة على شاكر. كرر هذا مرتين أكثر.
  11. جبل أقسام الدماغ على الشرائح، إضافة كمية مناسبة من أنتيفادي تصاعد المتوسطة (حوالي 100-150 درجة مئوية)، وتغطية مع غطاء الزجاج قسط. ختم مع طلاء الأظافر.
  12. التقاط الصور باستخدام مجهر الفلورة العادي أو المعمحور.

5. عزل الحمض النووي الجينومي

  1. قتل شخص بالغ من الفأر C57 BL/6J (ذكر أو أنثى) عن طريق خلع عنق الرحم وإزالة الدماغ.
  2. تشريح الحصين والقشرة والأنسجة المخيخ على طبق تبريد الجليد. طحن الأنسجة مع طاحونة الأنسجة في 1 مل من الحمض النووي اللسيد العازلة ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي نظيفة. إضافة 250 ميكروغرام من بروتيناز K لكل 600 ميكرولتر من الليسياد العازلة. لكريات الخلية، إضافة مباشرة العازلة lysis، proteinase K، وتخلط جيدا.
    ملاحظة: إعداد الحمض النووي اللليس العازلة: 5 MM EDTA، 0.2٪ SDS، 200 مل حمض الكلى في 100 مل تريس-حمض الهيدروكلوريك، درجة الحموضة 8.5. غسل والأوتوكلاف طاحونة الأنسجة قبل التجربة.
  3. في اليوم الثاني، إضافة حوالي 50 ميكروغرام من RNase A لكل عينة لمدة لا تقل عن 12 ساعة في 37 درجة مئوية.
  4. إضافة كمية متساوية من الفينول: الكلوروفورم: isoamyl الكحول (25:24:1) ومزيج تماما.
  5. الطرد المركزي في 20,817 × ز لمدة 15 دقيقة, وإزالة supernatant في أنبوب جديد microcentrifuge.
  6. إضافة 600 درجة مئوية من الكلوروفورم إلى supernatant لتعجيل الحمض النووي، وتخلط جيدا.
  7. الطرد المركزي في 20,817 × ز لمدة 15 دقيقة, وإزالة supernatant في أنبوب جديد آخر.
  8. أضف 500 ميكرو لتر من الإيزوبروبانول إلى الـ supernatant، واخلطها جيداً.
  9. الطرد المركزي في 20,817 × ز لمدة 15 دقيقة, وإزالة supernatant تماما.
  10. غسل هطول الأمطار مع 1 مل من الإيثانول 70٪، الطرد المركزي في 20،817 × ز لمدة 1 دقيقة، وإزالة supernatant تماما. كرر مرة واحدة.
  11. تجفيف بيليه الحمض النووي تماما.
  12. حل بيليه الحمض النووي مع العازلة تريس-حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8.5) إلى التركيز السليم.

6. الحمض النووي نقطة لطخة

  1. إعداد الحلول: 2 M هيدروكسيد الصوديوم، تريز-حمض الهيدروكلوريك العازلة (درجة الحموضة 8.5)، 6X سيترات الصوديوم المالحة (SSC).
  2. جعل خليط عينة كما الجدول 1.
  3. عينات الحمض النووي تشوه في 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتبرد على الجليد.
  4. قطع الحجم المناسب لغشاء النايلون (على سبيل المثال، Hybond-N+) وشطف مع 6X SSC.
  5. وضع الغشاء على جهاز نقطة وصمة عار والاتصال بمضخة فراغ. بقعة 6 ميكرولتر من الخليط لكل نقطة على الغشاء.
  6. يُهجن لمدة 30 دقيقة عند 80 درجة مئوية، ويُسدّن غشاء العينة بالحليب الخالي من الدهون في محلول ملحي مُسْتُعْمِّي ً (TBS) لمدّة ساعة واحدة.
  7. الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: الأجسام المضادة الأولية التالية: أرنب متعدد الكلونات المضادة لهيدروكسي ميثيل سيتوسين (1:5,000).
  8. في اليوم الثاني، قم باحتضان الأغشية العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  9. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة للأرنب الثانوية (1:5,000) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  10. اغسل يُغسل مع السل لمدة 10 دقائق.
  11. تصور إشارات الكيماويات، وقياس كثافة الإشارة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

للكشف عن توزيع 5-hmC في الحصين من الفئران البالغة، قمنا بإجراء الفلورة المناعية مع الأجسام المضادة ضد الخلايا العصبية (NeuN) و 5-hmC. في الحصين، 5-hmC شارك في ترجمة جيدا مع علامة الخلايا العصبية NeuN(الشكل 1A-H)،مما يشير إلى إثراء 5-hmC في الخلايا العصبية.

لتحديد ديناميات 5-hmC أثناء تطوير الخلايا العصبية، تم إجراء نقطة وصمة عار لأول مرة مع عينات الحمض النووي معزولة عن تكاثر وتباين الخلايا الجذعية العصبية الكبار (NSCs). وأظهرت نتائج نقطة وصمة عار أن المستوى العالمي من 5-hmC زيادة كبيرة خلال التمييز بين NSC(الشكل 2A-B). وعلاوة على ذلك، أظهرت نتائج نقطة وصمة عار أن مستوى 5-hmC في الخلايا العصبية كان أعلى بكثير من ذلك من NSCs(الشكل 2C-D)،مما يشير إلى تعديل دينامية 5 hmC خلال تطوير الخلايا العصبية.

Figure 1
الشكل 1: تلطيخ مناعة 5-hmC في الحصين من الفئران البالغة. 5-hmC شارك في ترجمة جيدا مع علامة الخلايا العصبية NeuN. شريط مقياس = 100 ميكرومتر(A-D)؛ 50 ميكرومتر(E-F). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الكشف عن الحمض النووي نقطة وصمة عار من 5 hmC في الخلايا الجذعية العصبية الكبار والخلايا العصبية. (أ)5-hmC نقطة وصمة عار من NSCs تحت انتشار (Proli) والتمايز (ديف) الظروف. (C)5-hmC نقطة وصمة عار من NSCs والخلايا العصبية الأولية. الميثيلين الأزرق تلطيخ(B، D)مما يدل على تحميل على قدم المساواة من الحمض النووي الجينومي في كل تركيز في (أ) و (ج)، على التوالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

200 نانوغرام/نقطة 400 نانوغرام/نقطة 1000 نانوغرام/نقطة
الحمض النووي 470 نانوغرام 940 نانوغرام 2,350 نانوغرام
2 M NaOH 2.81 ميكرولتر 2.81 ميكرولتر 2.81 ميكرولتر
مخزن Tris-HCl المؤقت، درجة الحموضة 7.5 جعل حجم تصل إلى 14.06 درجة مئوية

الجدول 1: إعداد عينات للطخة النقاط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تلعب التعديلات الجينيّة أدوارًا أساسية أثناء نمو الدماغ والنضج والوظيفة. كعلامة مستقرة لتعديل الحمض النووي, دينامية 5-hmC يستجيب للتكيف السلوكي, النشاط العصبي, ويرتبط بشكل إيجابي مع التعبير الجيني; وبالتالي، فإنه يشارك في الوظيفة الطبيعية للدماغ والاضطراب العصبي4. لاستكشاف وظيفتها في الخلايا والأنسجة، فمن الضروري للكشف عن وجود 5-hmC ومقارنة المستوى قبل وبعد العلاج. هنا، أظهرنا طريقتين مناسبتين للكشف عن 5-hmC في الخلايا والأنسجة، والتي يمكن تنفيذها مع المعدات المشتركة في المختبر.

الكاشف الرئيسي للكشف عن 5-hmC مع تلطيخ الفلورة المناعية والحمض النووي نقطة وصمة عار هو الجسم المضاد 5 hmC. وقد ثبت أن الأجسام المضادة 5 hmC المستخدمة في هذه الطريقة لديها حساسية عالية ومحددة جدا. لتلطيخ 5 hmC، فإنه يتطلب إزالة الحمض النووي مع حمض الهيدروكلوريك. العلاج السليم للأنسجة والخلايا مع حمض الهيدروكلوريك أمر بالغ الأهمية لإزالة الحمض النووي الكامل ويؤثر على النتائج. الحمض النووي نقطة وصمة عار هو وسيلة حساسة لتحديد كمية 5-hmC، وأكثر ملاءمة بكثير من الطيف الكتلي. لنقطة وصمة عار ناجحة، مطلوب نشر دقيق لعينات الحمض النووي على الغشاء. وعلاوة على ذلك، يساعد تلطيخ الميثيلين الأزرق على تحديد ما إذا كانت عينات الحمض النووي قد تم تحميلها بالتساوي. وتجدر الإشارة إلى أن الأساليب الموصوفة هنا تكشف عن المستوى العالمي لـ 5-hmC في أنواع متعددة من الخلايا والأنسجة. ولقياس مقدار 5-hmC بالنسبة إلى القواعد الأخرى والتمييز بين ميزة التوزيع في الجينوم، فإنه يتطلب LC-MS/MS وتسلسل الجيل التالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا توجد مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

وقد تم دعم XL جزئيا من قبل البرنامج الوطني لالبحث والتطوير مفتاح الصين (2017YFE0196600)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (منحة رقم 31771395، 31571518). تم دعم Q.S. من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFC1001703) وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي لمقاطعة تشجيانغ (2017C03009). تم دعم W.X. من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ (LY18H020002) وقسم التكنولوجيا العلمية في مقاطعة تشجيانغ (2017C37057).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) Sigma-Aldrich D8417
Adobe Photoshop software Adobe Inc. /
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine Active Motif 39769
anti-NeuN Millipore MAB377
B27 supplement Gibco 12587-010
B27 supplement Gibco 12580-010
B27 supplement Gibco 17504-044
Cryostat microtome Leica CM1950
DMEM/F-12 medium OmegaScientific DM25
Epidermal growth factor PeproTech 100-15
Fibroblast growth factor-basic PeproTech 100-18B
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
GlutaMax Thermo 35050061
L-Glutamine Gibco 25030-149
Neurobasal medium Gibco 21103-049
Normal goat serum Vector Laboratories Z0325
Nylon membrane (Hybond™-N+ ) Amersham Biosciences RPN303B
OCT Leica 14020108926
Pen Strep Gibco 15140-122
Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) Sigma-Aldrich 516726
Poly-D-Lysine Sigma P0899-10
Proteinase K VVR 39450-01-6
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625
Triton X-100 Solarbio T8210

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
  2. Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
  3. Day, J. J., Sweatt, J. D. DNA methylation and memory formation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).
  4. Wu, X. J., Zhang, Y. TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond. Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).
  5. Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. 5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development. Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).
  6. Li, S., Mason, C. E. The pivotal regulatory landscape of RNA modifications. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).
  7. Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection. Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).
  8. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
  9. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  10. Guo, J. U., et al. Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain. Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).
  11. Feng, J., et al. Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).
  12. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Geneticset. , Suppl 33. 245-254 (2003).
  13. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).
  14. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  15. Shu, L. Q., et al. Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease. BMC Genomics. 17, (2016).
  16. Cruvinel, E., et al. Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs. Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).
  17. Bernstein, A. I., et al. 5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity. Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).
  18. Wang, F. L., et al. Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).
  19. Yu, H., et al. Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair. Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).
  20. Wu, H., Zhang, Y. Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).
  21. Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
  22. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
  23. Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
  24. Ito, S., et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466 (7310), (2010).
  25. Wang, T., et al. Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum. Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).
  26. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  27. Wang, T., et al. Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency. Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).
  28. Li, X., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, 15903 (2017).
  29. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).
  30. Tao, H., et al. The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).
  31. Li, X. K., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, (2017).
  32. Li, X., et al. Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).
  33. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).

Tags

علم الأعصاب العدد 151 إزالة مثيلالحمض النووي 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين تلطيخ الفلورة المناعية نقطة لطخة الماوس الدماغ الخلايا الجذعية العصبية الخلايا العصبية
الكشف عن 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا الجذعية العصبية وعقول الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhuang, Y., Chen, J., Xu, W., Shu,… More

Zhuang, Y., Chen, J., Xu, W., Shu, Q., Li, X. The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice. J. Vis. Exp. (151), e59950, doi:10.3791/59950 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter