Summary
在这里，我们提出了一个协议，利用免疫荧光染色和DNA点印法检测细胞和脑组织中5-羟基甲基细胞氨酸。
Abstract
在哺乳动物基因组中已经发现了多个DNA修饰。其中，对5-甲基细胞氨酸和5-羟基甲基细胞氨酸介导表观遗传机制进行了深入的研究。5-羟基甲基细胞氨酸在大脑胚胎发育和产后发育过程中表现出动态特征，在基因表达中起着调节作用，并涉及多种神经系统疾病。在这里，我们描述了详细的方法，包括免疫荧光染色和DNA点缀，以检测培养细胞和小鼠脑组织中5-羟基甲基细胞氨酸。
Introduction
表观遗传修饰，包括DNA修饰，组蛋白修饰和RNA修饰，已被证明在不同的生物过程和疾病1，2，3， 4,5,6,7.长期以来，DNA甲基化（即5-甲基细胞氨酸（5-mC））一直被视为高度稳定的表观遗传标记，无法在基因组中进一步修饰。最近，发现TET（十-十一位）家族蛋白（TET1、TET2和TET38、9）可氧化至5-羟基甲基细胞氨酸（5-hmC）。进一步研究表明，5-hmC可以作为一个稳定的标记，并通过调节基因表达4，10，11，12发挥生物作用。
目前的证据表明，5-hmC在神经元组织/细胞中相对于哺乳动物的其他类型的组织高度丰富，并在神经元发育13、14过程中表现出动态特征。在神经元系统中，5-hmC介导表观遗传修饰在调节神经干细胞、神经元活动、学习和记忆方面起着重要作用，并涉及多种神经系统疾病，包括雷特综合征、自闭症、阿尔茨海默氏症疾病，亨廷顿舞蹈症等2，13，15，16，17，18，19，20。
有几种方法可以检测细胞和组织中的5-hmC14、21、22、23、24。在这里，我们描述了两种方法来检测5-hmC的存在，并量化5-hmC的全球水平：免疫荧光染色和DNA点斑。这两种方法方便而敏感，在以前的研究中已成功地使用了25、26、27、28、29、30。这两种方法的关键步骤是DNA变性。对于 5-hmC 的免疫荧光染色，需要对具有 1 M HCl 的样品进行预处理。对于 5-hmC 点斑点，使用 NaOH 溶液执行 DNA 变性。这两种方法以及下一代测序是研究5-hmC功能的非常有用的工具。
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Protocol
所有动物程序均已通过浙江大学动物伦理委员会批准。
1. 成人神经干细胞和神经元的培养
- 分离成人神经干细胞从成人（8-10周大）C57/BL6雄性小鼠前脑，如前31，32所述。
- 在DMEM/F-12培养基培养的成人神经干细胞中含有20纳克/mL FGF-2、20纳克/mL EGF、2%B27补充剂、1%抗生素抗霉菌和2mM L-谷氨酰胺，在37°C的5%CO2培养箱中。诱导成人神经干细胞与1μM视黄酸和5μMforskolin的分化48小时如前所述31，32。
- 分离神经元从胚胎天17 （E17）河马小鼠和培养神经巴底培养物含有0.25%L-谷氨酰胺，0.125%谷氨酰胺和2%B27补充剂在5%CO2培养箱在37°C如前所述33。
2. 小鼠的跨式灌注
- 在实验前一天制备10%氯水合物、4%甲醛（PFA）和磷酸盐缓冲盐水（PBS），并储存在4°C。
- 用10%氯合物（50毫克/千克，即p.p.）对成年雄性或雌性C57 BL/6J小鼠进行麻醉，并通过检查身体反应确保动物被深度麻醉。用胶带固定塑料板上的每个肢体（正面朝上）。
- 用手术剪刀切皮肤，然后切割肌肉。用手术剪刀打开胸腔。露出心脏，用精细的手术剪刀切断右中庭的一小部分。
- 用10 mL一次性消毒注射器从左心室用冷PBS（每只成年小鼠约30 mL）给小鼠注射。
- 给小鼠注入4%的PFA（每只成年小鼠约30 mL，每只10分钟），直到它变硬。
- 用骨钳打开鼠标的头骨。取出大脑，放入15 mL离心管中的5 mL 4%PFA，在4°C下固定后。
注：手术结束后清洁手术区域。 - 至少24小时后，将大脑样本转移到30%蔗糖溶液中，在4°C下完全脱水。
3. 大脑切片
- 将大脑样本嵌入最佳切割温度化合物 （OCT） 中，在小容器中冷却至 -20°C 至少 1 小时。
- 部分脑样本厚度为20-40μm，带有低温微托。
- 收集部分到PBS和存储在4°C。
4. 免疫荧光染色
- 拿起目标大脑区域的部分，并把它们放入一个24孔板与PBS。对于盖玻上的培养单元格，直接转到步骤 4.2。
- 在室温下用PBS在摇床上清洗10分钟，再重复两次。
- 取出 PBS，并在 37°C 下用预热的 1 M HCl 处理 30 分钟。
注：加入1 mL盐酸（36-38%），制备1M HCl在化学罩中放入10mL的水中。在 37°C 下在培养箱中预热 1 M HCl。 - 用PBS清洗样品5分钟，再重复两次。
- 在室温下，在摇床上含有3%正常山羊血清和0.1%Triton X-100的PBS块状样品，1小时。
- 在摇摇器上4°C下用特异性原抗体孵育部分过夜。
注：使用以下主要抗体：多克隆兔抗体抗5-羟基甲基细胞氨酸（1：5，000），小鼠单克隆抗体抗NeuN（1：500）。 - 拿出样品，在室温下进一步孵育1小时。
- 用PBS清洗样品10分钟，再重复两次。
- 在室温下用与初级抗体对应的二级抗体在摇床上孵育1小时。用铝盖住盘子。
注：使用以下二级抗体：亚历克萨福来488山羊抗兔子IgG（1：500），亚历克萨福来568山羊抗小鼠IgG（1：500）。反染色核与4+-6-二酰胺-2-苯林多尔（DAPI）。 - 用 PBS 在摇床上清洗样品 10 分钟。再重复两次。
- 将大脑部分安装到幻灯片上，添加适量的防褪色安装介质（约 100-150 μL），并盖上优质盖玻璃。用指甲油密封。
- 使用常规或共聚焦荧光显微镜拍摄图像。
5. 基因组DNA分离
- 通过宫颈脱位使成人C57 BL/6J小鼠（男性或女性）安乐死，并切除大脑。
- 在冰冷的菜上解剖海马、皮层和小脑组织。用组织磨床在1mL的DNA分液缓冲液中研磨组织，并转移到干净的微离心管中。每600μL的莱沙缓冲液加入250μg蛋白酶K。对于细胞颗粒，直接添加莱沙缓冲液，蛋白酶K，并彻底混合。
注：制备DNA液化缓冲液：5 mM EDTA，0.2%SDS，200 mM NaCl，100 mM Tris-HCl，pH 8.5。在实验前清洗和高压灭菌组织研磨机。 - 第二天，在37°C下，每个样品加入约50μg的RNase A，至少12小时。
- 加入同等体积的苯酚：氯仿：等相醇（25：24：1），并完全混合。
- 在20，817 x g下离心15分钟，并将上清液取出到新的微离心管中。
- 将600μL的氯仿加入上清液，沉淀DNA，并彻底混合。
- 在 20，817 x g下离心 15 分钟，并将上清液取出到另一个新管中。
- 将500μL异丙醇加入上清液，并彻底混合。
- 在 20，817 x g下离心 15 分钟，并完全去除上清液。
- 用1mL的70%乙醇清洗沉淀物，在20，817 x g下用离心机1分钟，并完全去除上清液。重复一次。
- 完全干燥DNA颗粒。
- 用Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）溶解DNA颗粒至适当的浓度。
6. DNA点布洛特
- 准备溶液：2 M NaOH、Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）、6x盐酸柠酸钠（SSC）。
- 使样品混合物如表1所示。
- 在100°C处变性DNA样本10分钟，在冰上冷却。
- 切割适当尺寸的尼龙膜（例如，Hybond-N+），然后用 6x SSC 冲洗。
- 将膜放在点状装置上并连接到真空泵。每点在膜上的混合物点6 μL。
- 在80°C下杂交30分钟，用Tris缓冲盐水（TBS）中的无脂牛奶阻断样品膜1小时。
- 在4°C过夜用原抗体孵育。
注：以下原抗体：多克隆兔抗羟基甲基细胞氨酸（1：5，000）。 - 第二天，在室温下孵育样品膜1小时，用TBS清洗10分钟，再重复两次。
- 在室温下用抗兔子二级抗体（1：5，000）孵育膜30分钟。
- 用 TBS 洗涤 10 分钟，再重复两次。
- 可视化化学发光信号，并量化信号强度。
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Representative Results
为了揭示成年小鼠海马区5-hmC的分布，我们用抗体对神经元细胞（NeuN）和5-hmC进行了免疫荧光。在海马区，5-hmC与神经元细胞标记NeuN（图1A-H）共同本地化良好，表明神经元中5-hmC的富集。
为了确定神经元发育过程中的5-hmC动力学，首先使用从增殖和分化的成人神经干细胞（NSCs）中分离出的DNA样本进行点斑点。点斑点结果显示，在NSC分化期间，5-hmC的全球水平显著增加（图2A-B）。此外，点状结果显示，神经元中的5-hmC水平明显高于NSC（图2C-D），表明神经元发育过程中有动态的5-hmC修饰。
图1：成年小鼠海马5-hmC免疫荧光染色。5-hmC与神经元细胞标记NeuN共同本地化良好。刻度条 = 100 μm （A-D）;50 μm （E-F）请点击此处查看此图的较大版本。
图2：成人神经干细胞和神经元中5-hmC的DNA点斑点检测。（A） 在扩散（Proli）和分化（困难）条件下的NSC的5-hmC点状斑点。（C） NSC 和主神经元的 5-hmC 点斑点。甲基蓝染色 （B， D） 分别表示 （A） 和 （C） 中每个浓度的基因组DNA的相等载荷.请点击此处查看此图的较大版本。
| 200 纳克/点 | 400 纳克/点 | 1，000 纳克/点 | |
| Dna | 470 纳克 | 940 纳克 | 2，350 纳克 |
| 2 M NaOH | 2.81 μL | 2.81 μL | 2.81 μL |
| Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5 | 使音量高达 14.06 μL |
表1：制备点斑点样品。
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Discussion
表观遗传修饰在大脑发育、成熟和功能中起着至关重要的作用。作为DNA修饰的稳定标记，动态5-hmC对行为适应、神经元活动有反应，与基因表达呈正相关;因此，它参与大脑的正常功能和神经紊乱4。为了探索它在细胞和组织中的功能，有必要检测5-hmC的存在，并比较治疗前后的水平。在这里，我们演示了两种检测细胞和组织5-hmC的便捷方法，这些方法可以在实验室中使用普通设备进行。
利用免疫荧光染色和DNA点状物检测5-hmC的关键试剂是5-hmC抗体。该方法中使用的5-hmC抗体已被证明具有高灵敏度，并且非常具体。对于 5-hmC 染色，它需要与 HCl 进行 DNA 变性。用HCl正确治疗组织和细胞对于完全脱氧核糖核酸至关重要，并影响结果。脱氧核糖核酸点斑点是一种灵敏的方法来量化5-hmC的量，并且比质谱更方便。要获得成功的点状，需要将DNA样本精确分布到膜上。此外，亚甲蓝色染色有助于确定DNA样本是否同样加载。值得注意的是，此处描述的方法可检测多种类型的细胞和组织中的5-hmC全球水平。为了测量相对于其他碱基的5-hmC量并区分其在基因组中的分布特征，它需要LC-MS/MS和下一代测序。
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Disclosures
不存在相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
XL部分得到了中国国家重点研发项目（2017YFE0196600）和国家自然科学基金（授权号31771395，31571518）的支持。Q.S.得到了国家重点研发项目（2017YFC1001703）和浙江省重点研发项目（2017C03009）的支持。W.X.得到了浙江省自然科学基金（LY18H020002）和浙江省科技厅（2017C37057）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| Adobe Photoshop software | Adobe Inc. | / | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A11008 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A11001 | |
| anti-5-hydroxymethylcytosine | Active Motif | 39769 | |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| B27 supplement | Gibco | 12587-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 12580-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cryostat microtome | Leica | CM1950 | |
| DMEM/F-12 medium | OmegaScientific | DM25 | |
| Epidermal growth factor | PeproTech | 100-15 | |
| Fibroblast growth factor-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| GlutaMax | Thermo | 35050061 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-149 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | Z0325 | |
| Nylon membrane (Hybond™-N+ ) | Amersham Biosciences | RPN303B | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899-10 | |
| Proteinase K | VVR | 39450-01-6 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8210 |
References
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