Summary
Her præsenterer vi en protokol til påvisning af 5-hydroxymethylcytosin i celler og hjernevæv, ved hjælp af immunofluorescens farvning og DNA dot-blot metoder.
Abstract
Der er identificeret flere DNA-modifikationer i pattedyrs genomet. Af det, 5-methylcytosin og 5-hydroxymethylcytosin-medierede epigenetiske mekanismer er blevet intensivt undersøgt. 5-hydroxymethylcytosin viser dynamiske funktioner under embryonale og postnatale udvikling af hjernen, spiller en regulerende funktion i genekspression, og er involveret i flere neurologiske lidelser. Her beskriver vi de detaljerede metoder, herunder immunofluorescens farvning og DNA dot-blot at detektere 5-hydroxymethylcytosin i dyrkede celler og hjernens væv af mus.
Introduction
Epigenetiske modifikationer, herunder DNA modifikation, Histon modifikation og RNA modifikation, har vist sig at spille væsentlige funktioner i forskellige biologiske processer og sygdomme1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7. i lang tid, DNA-methylering (dvs., 5-methylcytosin (5-mC)) er blevet betragtet som en meget stabil epigenetisk markør og kan ikke ændres yderligere i genomet. For nylig, det har været konstateret, at 5-mC kunne oxideres til 5-hydroxymethylcytosin (5-HMC) af tet (ti-elleve translocations) familie proteiner, herunder TET1, TET2,og TET3 8,9. Yderligere undersøgelser viser, at 5-HMC kunne tjene som en stabil markør og spille biologiske roller ved at regulere genekspression4,10,11,12.
De nuværende beviser indikerer, at 5-HMC er stærkt beriget i neuronal væv/celler i forhold til andre typer af væv i pattedyr, og udviser dynamiske funktioner under neuronal udvikling13,14. I neuronal system, 5-hmC medierede epigenetiske modifikationer spiller en vigtig rolle i reguleringen af neurale stamceller, neuronal aktivitet, indlæring og hukommelse, og er involveret i flere neurologiske lidelser, herunder RETT syndrom, autisme, Alzheimers sygdom, Huntingtons sygdom, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.
Der er flere tilgange til påvisning af 5-HMC i celler og væv14,21,22,23,24. Her beskriver vi to metoder til at påvise eksistensen af 5-hmC og kvantificere det globale niveau af 5-hmC: immunofluorescens farvning og DNA dot-blot. Disse to metoder er bekvemme og følsomme, og er blevet anvendt med succes i tidligere undersøgelser25,26,27,28,29,30. De vigtigste trin i disse to metoder er DNA-denaturering. For immunofluorescens farvning af 5-hmC kræves forbehandling af prøver med 1 M HCl. For 5-hmC dot-blot er DNA-denaturering udført med NaOH-opløsning. Disse to metoder sammen med næste generations sekvensering er meget nyttige værktøjer til at undersøge funktionen af 5-hmC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg er blevet godkendt af dyreetiske komité på Zhejiang Universitet.
1. kulturen af voksne neurale stamceller og neuroner
- Isoler voksne neurale stamceller fra forhjernen af en voksen (8-10 uger gammel) C57/BL6 mandlig mus som beskrevet tidligere31,32.
- Kultur voksne neurale stamceller i DMEM/F-12 medium indeholdende 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 supplement, 1% antibiotikum-antimykotisk, og 2 mM L-glutamin i en 5% CO2 inkubator ved 37 °c. Inducerer differentieringen af voksne neurale stamceller med 1 μm retinsyre og 5 μm forskolin for 48 h som beskrevet tidligere31,32.
- Isoler neuroner fra embryon dag 17 (E17) hippocampi af mus og kultur med neurobasal medium indeholdende 0,25% L-glutamin, 0,125% GlutaMax og 2% B27 supplement i en 5% CO2 inkubator ved 37 °c som tidligere beskrevet33.
2. transcardial perfusion af musen
- 10% kon densering chloralet hydrat, 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) og fosfat bufferet saltvand (PBS) fremstilles en dag før forsøget og opbevares ved 4 °C.
- Anesthetize en voksen mandlig eller kvindelig C57 BL/6J mus med 10% kon densering chloralet hydrat (50 mg/kg, IP), og sikre, at dyret er dybt bedøvet ved at kontrollere kroppen reaktion. Fastgør hvert led med klæbrig tape på en plastik plade (i en forsiden-up position).
- Skær huden og derefter musklen med kirurgi saks. Åbn brysthulen med en kirurgisk saks. Udsæt hjertet og afskårne en lille del af det højre atrium med en fin kirurgisk saks.
- Perfuse musen med en 10 mL engangs steriliseret sprøjte fra venstre ventrikel med kold PBS (ca. 30 mL per voksen mus).
- Perfuse musen med 4% PFA (ca. 30 mL i 10 min per voksne mus), indtil den er stiv.
- Åbn kraniet af musen med knogle tang. Hjernen fjernes, og der sættes 5 mL 4% PFA i et 15 mL centrifugeglas til efter fiksering ved 4 °C.
Bemærk: Rengør operationsområdet efter operationen er afsluttet. - Mindst 24 h senere, overføre hjerne prøverne til en 30% saccharose opløsning til fuldstændig dehydrering ved 4 °C.
3. skæring i hjernen
- Integrer hjerne prøverne i optimal skære temperatur forbindelse (OCT) i en lille beholder, og afkøles ved-20 °C i mindst 1 time.
- I en tykkelse på 20-40 μm med en kryostat mikrotom.
- Saml sektioner i PBS og opbevar ved 4 °C.
4. immunofluorescens farvning
- Saml afsnittene med de målrettede hjerneområder og læg dem i en 24-brønd plade med PBS. For dyrkede celler på en cover liste, gå direkte til trin 4,2.
- Vask med PBS på rysteapparatet ved stuetemperatur i 10 min. Gentag dette to gange.
- Fjern PBS, og Behandl med forvarmet 1 M HCl i 30 min ved 37 °C.
Bemærk: Forbered 1 M HCl ved tilsætning af 1 mL saltsyre (36-38%) i 10 mL vand i en kemisk hætte. Forvarm 1 M HCl i inkubator ved 37 °C. - Prøverne vaskes med PBS i 5 min. Gentag dette to gange mere.
- Blok prøver med PBS, der indeholder 3% normalt gede serum og 0,1% Triton X-100 i 1 time på rysteapparatet ved stuetemperatur.
- Inkuber sektioner med specifikke primære antistoffer natten over ved 4 °C på rysteapparatet.
Bemærk: Brug følgende primære antistoffer: polyklonale kanin antistoffer anti-5-hydroxymethylcytosin (1:5000), mus monoklonale antistof Antineun (1:500). - Tag prøverne ud, og yderligere inkubere ved stuetemperatur i 1 time.
- Prøverne vaskes med PBS i 10 min. Gentag dette to gange mere.
- Inkuber med sekundære antistoffer, som svarer til de primære antistoffer ved stuetemperatur i 1 time på rysteapparatet. Dæk pladen med aluminium.
Bemærk: Brug følgende sekundære antistoffer: Alexa fluor 488 ged anti-kanin IgG (1:500), Alexa fluor 568 ged anti-mus IgG (1:500). Counterstain kerner med 4 ′ -6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). - Prøverne vaskes med PBS i 10 minutter på rysteapparatet. Gentag dette to gange mere.
- Monter hjerne sektioner på slidene, tilsæt den rigtige mængde anti fade monterings medium (ca. 100-150 μL), og dæk med Premium Cover glas. Tætning med neglelak.
- Tag billeder med et regulært eller Konfokal fluorescens mikroskop.
5. genomisk DNA-isolation
- Euthanize en voksen C57 BL/6J mus (mand eller kvinde) ved livmoderhals dislokation og fjerne hjernen.
- Dissekere hippocampus, cortex og cerebellum væv på en isafkølet skål. Grind væv med en vævs sliber i 1 mL DNA-lysis-buffer og overføres til rent mikrocentrifuge glas. Tilsæt 250 μg proteinase K pr. 600 μL lysis-buffer. For celle pellets, tilsæt direkte lysis buffer, proteinase K, og bland grundigt.
Bemærk: Forbered DNA-lyse buffer: 5 mM EDTA, 0,2% SDS, 200 mM NaCl i 100 mM Tris-HCl, pH 8,5. Vask og autoklave vævs kværn før eksperimentet. - Den anden dag tilsættes ca. 50 μg RNase A pr. prøve i mindst 12 timer ved 37 °C.
- Tilsæt en tilsvarende mængde phenol: chloroform: isoamylalkohol (25:24:1) og bland fuldstændigt.
- Der centrifugeres ved 20.817 x g i 15 minutter, og supernatanten fjernes i et nyt mikrocentrifuge glas.
- Tilsæt 600 μL chloroform til supernatanten for at fremskynde DNA, og bland grundigt.
- Centrifuge ved 20.817 x g i 15 minutter, og Fjern supernatanten i et andet nyt rør.
- Tilsæt 500 μL isopropanol til supernatanten, og bland grundigt.
- Centrifugeres ved 20.817 x g i 15 minutter, og supernatanten fjernes helt.
- Nedbøren vaskes med 1 mL 70% ethanol, centrifugeres ved 20.817 x g i 1 min., og supernatanten fjernes helt. Gentag en gang.
- Tør DNA-pellet helt.
- DNA-pellet opløses med Tris-HCl buffer (pH 8,5) til den rette koncentration.
6. DNA prik blot
- Forbered løsningerne: 2 M NaOH, Tris-HCl buffer (pH 8,5), 6x saltvands natriumcitrat (SSC).
- Gør prøveblandingen til tabel 1.
- DNA-prøver ved 100 °C i 10 minutter, og afkøles på is.
- Skær den rigtige størrelse af nylon membran (f. eks, Hybond-N +) og skyl med 6x SSC.
- Sæt membranen på dot-blot apparat og Tilslut til vakuumpumpen. Spot 6 μL blanding per prik på membranen.
- Hybridize i 30 min ved 80 °C, og Bloker prøve membranen med fedtfri mælk i Tris-bufferet saltvand (TBS) i 1 time.
- Inkuber med primær antistof ved 4 °C natten over.
Bemærk: følgende primære antistof: polyklonal kanin anti-5-hydroxymethylcytosin (1:5000). - På den anden dag Inkuber du prøve membranerne ved stuetemperatur i 1 time. vask med TBS i 10 min. Gentag denne vask to gange mere.
- Inkuber membranen med anti-kanin-sekundært antistof (1:5000) i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vask med TBS i 10 min. Gentag denne vask to gange mere.
- Visualiser chemiluminescens signaler, og Kvantificer signal intensiteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at afsløre fordelingen af 5-hmC i hippocampus af voksne mus, udførte vi immunofluorescens med antistoffer mod neuronal celler (NeuN) og 5-hmC. I hippocampus, 5-hmC Co-lokaliseret godt med neuronal cellemarkør NeuN (figur 1a-H), tyder på en berigelse af 5-HMC i neuroner.
For at bestemme dynamikken i 5-hmC under neuronal udvikling blev en prik-blot først udført med DNA-prøver isoleret fra prolifererende og differentierede voksne neurale stamceller (NSCs). Dot-blot resultater viste, at det globale niveau af 5-hmC steg betydeligt under differentieringen af NSC (figur 2a-B). Yderligere, dot-blot resultater viste, at niveauet af 5-hmC i neuroner var betydeligt højere end for NSCs (figur 2c-D), tyder på en dynamisk 5-HMC modifikation under neuronal udvikling.
Figur 1: immunofluorescens farvning af 5-hmC i hippocampus af voksne mus. 5-hmC Co-lokaliseret godt med neuronal cellemarkør NeuN. Skala bar = 100 μm (A-D); 50 μm (E-F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: DNA-prik-blot påvisning af 5-hmC i voksne neurale stamceller og neuroner. A) 5-HMC dot-blot af nscs under spredning (proli) og differentierings betingelser (diffe). (C) 5-HMC dot-blot af nscs og primære neuroner. Methylenblåt farvning (B, D), der angiver en lige belastning af GENOMISK DNA ved hver koncentration i henholdsvis litraA) ogC). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| 200 ng/prik | 400 ng/prik | 1.000 ng/prik | |
| Dna | 470 ng | 940 ng | 2.350 ng |
| 2 M NaOH | 2,81 μL | 2,81 μL | 2,81 μL |
| Tris-HCl buffer, pH 7,5 | Gør lydstyrken op til 14,06 μL |
Tabel 1: forberedelse af prøver til prik-blot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epigenetiske modifikationer spiller vigtige roller under hjernens udvikling, modning og funktion. Som en stabil markør for DNA modifikation reagerer Dynamic 5-hmC på adfærds tilpasning, neuronal aktivitet og er positivt korreleret med genekspression; således er det involveret i den normale funktion af hjernen og neurologiske lidelse4. For at undersøge dets funktion i celler og væv, er det nødvendigt at påvise eksistensen af 5-hmC og sammenligne niveauet før og efter behandling. Her demonstrerede vi to bekvemme metoder til påvisning af 5-hmC i celler og væv, som kunne udføres med fælles udstyr i laboratoriet.
Det vigtigste reagens til påvisning af 5-hmC med immunofluorescens farvning og DNA dot-blot er 5-hmC-antistoffet. Det 5-hmC antistof, der anvendes i metoden, har vist sig at have høj følsomhed og er meget specifik. For 5-hmC-farvning kræver det DNA-denaturering med HCl. Korrekt behandling af væv og celler med HCl er afgørende for fuldstændig DNA-denaturering og påvirker resultaterne. DNA dot-blot er en følsom metode til at kvantificere mængden af 5-hmC, og er meget mere bekvemt end massespektroskopi. For en vellykket prik-blot er der behov for præcis spredning af DNA-prøver på membranen. Yderligere, methylenblåt farvning hjælper bestemme, om DNA-prøver blev lige indlæst. Af note, de metoder, der er beskrevet her opdage det globale niveau af 5-hmC i flere typer af celler og væv. For at måle mængden af 5-hmC i forhold til andre baser og skelne dens fordeling funktion i genom, det kræver LC-MS/MS og næste generation sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der findes ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
XL blev delvist støttet af det nationale Key R & D program i Kina (2017YFE0196600) og National Natural Science Foundation of China (Grant NOS. 31771395, 31571518). Q.S. blev støttet af Kinas nationale nøgle forsknings-og udviklingsprogram (2017YFC1001703) og det centrale forsknings-og udviklingsprogram for Zhejiang-provinsen (2017C03009). W.X. blev støttet af den naturvidenskabelige Foundation i Zhejiang-provinsen (LY18H020002) og Science Technology Department of Zhejiang-provinsen (2017C37057).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| Adobe Photoshop software | Adobe Inc. | / | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A11008 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A11001 | |
| anti-5-hydroxymethylcytosine | Active Motif | 39769 | |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| B27 supplement | Gibco | 12587-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 12580-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cryostat microtome | Leica | CM1950 | |
| DMEM/F-12 medium | OmegaScientific | DM25 | |
| Epidermal growth factor | PeproTech | 100-15 | |
| Fibroblast growth factor-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| GlutaMax | Thermo | 35050061 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-149 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | Z0325 | |
| Nylon membrane (Hybond™-N+ ) | Amersham Biosciences | RPN303B | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899-10 | |
| Proteinase K | VVR | 39450-01-6 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8210 |
References
- Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
- Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
- Day, J. J., Sweatt, J. D. DNA methylation and memory formation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).
- Wu, X. J., Zhang, Y. TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond. Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).
- Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. 5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development. Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).
- Li, S., Mason, C. E. The pivotal regulatory landscape of RNA modifications. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).
- Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection. Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- Guo, J. U., et al. Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain. Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).
- Feng, J., et al. Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Geneticset. , Suppl 33. 245-254 (2003).
- Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).
- Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
- Shu, L. Q., et al. Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease. BMC Genomics. 17, (2016).
- Cruvinel, E., et al. Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs. Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).
- Bernstein, A. I., et al. 5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity. Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).
- Wang, F. L., et al. Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).
- Yu, H., et al. Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair. Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).
- Wu, H., Zhang, Y. Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
- Inoue, A., Zhang, Y. Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
- Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
- Ito, S., et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466 (7310), (2010).
- Wang, T., et al. Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum. Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).
- Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
- Wang, T., et al. Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency. Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).
- Li, X., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, 15903 (2017).
- Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).
- Tao, H., et al. The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).
- Li, X. K., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, (2017).
- Li, X., et al. Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
