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Neuroscience

Der Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in neuralen Stammzellen und Gehirnen von Mäusen

Published: September 19, 2019 doi: 10.3791/59950
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1,2
1The Children's Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, 2The Institute of Translational Medicine, School of Medicine, Zhejiang University

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in Zellen und Hirngeweben vor, wobei Immunfluoreszenzfärbungundungen und DNA-Dot-Blot-Methoden verwendet werden.

Abstract

Im Säugetiergenom wurden mehrere DNA-Modifikationen identifiziert. Davon wurden 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin-vermittelte epigenetische Mechanismen intensiv untersucht. 5-Hydroxymethylcytosin zeigt dynamische Merkmale während der embryonalen und postnatalen Entwicklung des Gehirns, spielt eine regulierende Funktion in der Genexpression und ist an mehreren neurologischen Störungen beteiligt. Hier beschreiben wir die detaillierten Methoden einschließlich Immunfluoreszenzfärbung und DNA-Dot-Blot zum Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in kultivierten Zellen und Gehirngeweben der Maus.

Introduction

Epigenetische Modifikationen, einschließlich DNA-Modifikation, Histonmodifikation und RNA-Modifikation, haben gezeigt, dass sie wesentliche Funktionen in verschiedenen biologischen Prozessen und Krankheiten spielen1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7. Lange Zeit wurde die DNA-Methylierung (d.h. 5-Methylcytosin (5-mC)) als hochstabiler epigenetischer Marker angesehen und kann im Genom nicht weiter modifiziert werden. Kürzlich wurde festgestellt, dass 5-mC durch TET-Proteine (Ten-eleven Translokationen) einschließlich TET1, TET2 und TET38,9zu 5-Hydroxymethylcytosin(5-hmC) oxidiert werden könnten. Weitere Studien zeigen, dass 5-hmC als stabiler Marker dienen und biologische Rollen spielen könnte, indem die Genexpression4,10,11,12reguliert wird.

Die vorliegenden Beweise deuten darauf hin, dass 5-hmC in neuronalen Geweben/Zellen im Vergleich zu anderen Gewebearten bei Säugetieren hoch angereichert ist und dynamische Merkmale während der neuronalen Entwicklung13,14aufweist. Im neuronalen System spielen 5-hmC-vermittelte epigenetische Modifikationen eine wichtige Rolle bei der Regulierung neuronaler Stammzellen, neuronaler Aktivität, Lernen und Gedächtnis und sind an mehreren neurologischen Erkrankungen wie Rett-Syndrom, Autismus, Alzheimer beteiligt. Krankheit, Huntington, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.

Es gibt mehrere Ansätze zum Nachweis von 5-hmC in Zellen und Geweben14,21,22,23,24. Hier beschreiben wir zwei Methoden, um die Existenz von 5-hmC zu erkennen und das globale Niveau von 5-hmC zu quantifizieren: Immunfluoreszenzfärbung und DNA-Punktfleck. Diese beiden Methoden sind bequem und empfindlich, und wurden erfolgreich in früheren Studien25,26,27,28,29,30verwendet. Die wichtigsten Schritte dieser beiden Methoden sind die DNA-Denaturierung. Für die Immunfluoreszenzfärbung von 5-hmC ist eine Vorbehandlung von Proben mit 1 M HCl erforderlich. Bei 5-hmC Dot-Blot wird die DNA-Denaturierung mit NaOH-Lösung durchgeführt. Diese beiden Methoden sind zusammen mit der Sequenzierung der nächsten Generation sehr nützliche Werkzeuge zur Untersuchung der Funktion von 5-hmC.

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Protocol

Alle Tierverfahren wurden von der Tierethikkommission der Universität Zhejiang genehmigt.

1. Die Kultur der adulten neuronalen Stammzellen und Neuronen

  1. Isolieren Sie adulte neuronale Stammzellen aus dem Vorderhirn einer Erwachsenen (8-10 Wochen alt) C57/BL6 männliche Maus wie zuvor beschrieben31,32.
  2. Kultur adulte neuronale Stammzellen in DMEM/F-12 Medium mit 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27-Ergänzung, 1% Antimykotik und 2 mM L-Glutamin in einem 5%CO2-Inkubator bei 37 °C. Induzieren Sie die Differenzierung von adulten neuronalen Stammzellen mit 1 M Retinsäure und 5 M Forskolin für 48 h, wie zuvor beschrieben31,32.
  3. Isolieren Sie Neuronen aus dem embryonalen Tag 17 (E17) Hippocampi der Maus und Kultur mit neurobasalen Medium mit 0,25% L-Glutamin, 0,125% GlutaMax und 2% B27 Ergänzung in einem 5%CO2-Inkubator bei 37 °C, wie zuvor beschrieben33.

2. Transkardiale Perfusion der Maus

  1. 10% Chlorhydrat, 4% Paraformaldehyd (PFA) und Phosphat gepufferte Salzsäure (PBS) einen Tag vor dem Experiment vorbereiten und bei 4 °C lagern.
  2. Anästhetisieren Sie eine erwachsene männliche oder weibliche C57 BL/6J Maus mit 10% Chloralhydrat (50 mg/kg, i.p.), und stellen Sie sicher, dass das Tier durch die Überprüfung der Körperreaktion tief beäscht wird. Befestigen Sie jedes Glied mit Klebeband auf einem Kunststoffbrett (in einer Face-up-Position).
  3. Schneiden Sie die Haut und dann den Muskel mit einer Operationsschere. Öffnen Sie die Brusthöhle mit einer chirurgischen Schere. Setzen Sie das Herz aus und schneiden Sie einen kleinen Teil des rechten Vorhofs mit einer feinen chirurgischen Schere ab.
  4. Durchnässen Sie die Maus mit einer 10 ml Einweg-Sterilspritze aus dem linken Ventrikel mit kaltem PBS (ca. 30 ml pro erwachsener Maus).
  5. Durchdringen Sie die Maus mit 4% PFA (ca. 30 ml in 10 min pro erwachsenen Mäusen), bis sie steif ist.
  6. Öffnen Sie den Schädel der Maus mit Knochenzange. Entfernen Sie das Gehirn und geben Sie in 5 ml 4% PFA in einem 15 ml Zentrifugenrohr für die Postfixierung bei 4 °C.
    HINWEIS: Reinigen Sie den Operationsbereich, nachdem die Operation beendet ist.
  7. Mindestens 24 h später übertragen Sie die Hirnproben in eine 30%ige Saccharoselösung zur vollständigen Dehydrierung bei 4 °C.

3. Gehirn-Sektion

  1. Die Hirnproben in eine optimale Schnitttemperaturverbindung (OCT) in einen kleinen Behälter einbetten und bei -20 °C mindestens 1 h abkühlen.
  2. Schnitt Gehirnproben mit einer Dicke von 20-40 m mit einem Kryostat-Mikrotom.
  3. Teile in PBS sammeln und bei 4 °C lagern.

4. Immunfluoreszenz Färbung

  1. Nehmen Sie die Abschnitte mit den zielgerichteten Hirnregionen auf und legen Sie sie in eine 24-Well-Platte mit PBS. Wenn Sie kultivierte Zellen auf einem Deckzettel enthalten, fahren Sie direkt zu Schritt 4.2.
  2. Waschen Sie mit PBS auf dem Shaker bei Raumtemperatur für 10 min. Wiederholen Sie dies zweimal mehr.
  3. PBS entfernen und mit vorgewärmten 1 M HCl 30 min bei 37 °C behandeln.
    HINWEIS: Bereiten Sie 1 M HCl vor, indem Sie 1 ml Salzsäure (36-38%) in 10 ml Wasser in einer chemischen Haube. 1 M HCl im Inkubator bei 37 °C vorheizen.
  4. Waschen Sie die Proben mit PBS für 5 min. Wiederholen Sie dies zweimal mehr.
  5. Blockproben mit PBS mit 3% normalem Ziegenserum und 0,1% Triton X-100 für 1 h auf dem Shaker bei Raumtemperatur.
  6. Inkubieren Sie Abschnitte mit spezifischen Primärantikörpern über Nacht bei 4 °C auf dem Shaker.
    HINWEIS: Verwenden Sie die folgenden primären Antikörper: polyklonale Kaninchenantikörper Anti-5-Hydroxymethylcytosin (1:5.000), Maus monoklonaler Antikörper-Neun (1:500).
  7. Nehmen Sie die Proben heraus und brüten Sie bei Raumtemperatur 1 h weiter.
  8. Waschen Sie die Proben mit PBS für 10 min. Wiederholen Sie dies zweimal mehr.
  9. Inkubieren Sie mit sekundären Antikörpern, die den primären Antikörpern bei Raumtemperatur für 1 h auf dem Shaker entsprechen. Bedecken Sie die Platte mit Aluminium.
    HINWEIS: Verwenden Sie die folgenden sekundären Antikörper: Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Kaninchen IgG (1:500), Alexa Fluor 568 Ziege Anti-Maus IgG (1:500). Counterstain-Kerne mit 4-6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
  10. Waschen Sie die Proben mit PBS für 10 min auf dem Shaker. Wiederholen Sie dies noch zweimal.
  11. Montieren Sie Hirnabschnitte auf die Dias, fügen Sie eine angemessene Menge an Antifade-Montagemedium (ca. 100-150 l) hinzu und decken Sie sie mit Premium-Abdeckungsglas ab. Siegel mit Nagellack.
  12. Nehmen Sie Bilder mit einem regelmäßigen oder konfokalen Fluoreszenzmikroskop auf.

5. Genomische DNA-Isolierung

  1. Euthanisieren Sie eine erwachsene C57 BL/6J Maus (männlich oder weiblich) durch Zervixdislokation und entfernen Sie das Gehirn.
  2. Sezieren Sie das Hippocampus-, Kortex- und Kleinhirngewebe auf einer eisgekühlten Schale. Gewebe mit einem Gewebeschleifer in 1 ml DNA-Lysepuffer mahlen und in saubere Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Fügen Sie 250 g Proteinase K pro 600 l Lysepuffer hinzu. Bei Zellpellets Lysepuffer, Proteinase K direkt hinzufügen und gründlich mischen.
    HINWEIS: Herstellung von DNA-Lysepuffer: 5 mM EDTA, 0,2% SDS, 200 mM NaCl in 100 mM Tris-HCl, pH 8,5. Waschen und autoklavieren Sie den Gewebeschleifer vor dem Experiment.
  3. Am zweiten Tag etwa 50 g RNase A pro Probe für mindestens 12 h bei 37 °C hinzufügen.
  4. Fügen Sie ein gleiches Volumen phenolisch hinzu:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und vollständig mischen.
  5. Zentrifugieren Sie bei 20.817 x g für 15 min, und entfernen Sie den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenrohr.
  6. Fügen Sie dem Überstand 600 l Chloroform hinzu, um die DNA zu fällen, und mischen Sie sie gründlich.
  7. Zentrifugieren Sie bei 20.817 x g für 15 min, und entfernen Sie den Überstand in ein anderes neues Rohr.
  8. Fügen Sie dem Überstand 500 l Isopropanol hinzu und mischen Sie es gründlich.
  9. Zentrifugieren Sie bei 20.817 x g für 15 min, und entfernen Sie den Überstand vollständig.
  10. Den Niederschlag mit 1 ml 70% Ethanol, Zentrifuge bei 20.817 x g 1 min, waschen und den Überstand vollständig entfernen. Wiederholen Sie dies einmal.
  11. Trocknen Sie das DNA-Pellet vollständig.
  12. DNA-Pellet mit Tris-HCl-Puffer (pH 8.5) auflösen auf die richtige Konzentration.

6. DNA Dot Blot

  1. Bereiten Sie die Lösungen vor: 2 M NaOH, Tris-HCl Puffer (pH 8.5), 6x Saline-Natriumcitrat (SSC).
  2. Machen Sie die Probenmischung als Tabelle 1.
  3. DEnaturieren SIE DNA-Proben bei 100 °C für 10 min und kühlen Sie auf Eis ab.
  4. Schneiden Sie die richtige Größe der Nylonmembran (z.B. Hybond-N+) und spülen Sie mit 6x SSC.
  5. Setzen Sie die Membran auf Punkt-Blot-Gerät und verbinden Sie sich mit der Vakuumpumpe. Spot 6 l Gemisch pro Punkt auf die Membran.
  6. 30 min bei 80 °C hybridisieren und die Probenmembran mit fettfreier Milch in Tris-gepufferter Salin (TBS) für 1 h blockieren.
  7. Mit Primärantikörpern bei 4 °C über Nacht inkubieren.
    ANMERKUNG: der folgende primäre Antikörper: polyklonales Kaninchen-Anti-5-Hydroxymethylcytosin (1:5.000).
  8. Am zweiten Tag die Probenmembranen bei Raumtemperatur für 1 h inkubieren. 10 min mit TBS waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zweimal.
  9. Inkubieren Sie die Membran mit Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:5.000) für 30 min bei Raumtemperatur.
  10. Waschen Sie mit TBS für 10 min. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zweimal.
  11. Visualisieren Sie die Chemilumineszenzsignale und quantifizieren Sie die Signalintensitäten.

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Representative Results

Um die Verteilung von 5-hmC im Hippocampus von erwachsenen Mäusen zu zeigen, führten wir Immunfluoreszenz mit Antikörpern gegen neuronale Zellen (NeuN) und 5-hmC durch. Im Hippocampus, 5-hmC ko-lokalisiert gut mit neuronalen Zellmarker NeuN (Abbildung 1A-H), was auf eine Anreicherung von 5-hmC in Neuronen.

Um die Dynamik von 5-hmC während der neuronalen Entwicklung zu bestimmen, wurde zuerst ein Punktblot mit DNA-Proben durchgeführt, die aus vermehrten und differenzierten adulten neuronalen Stammzellen (NSCs) isoliert wurden. Die Dot-Blot-Ergebnisse zeigten, dass das globale Niveau von 5-hmC während der Differenzierung von NSC signifikant zunahm (Abbildung 2A-B). Darüber hinaus zeigten Punkt-Blot-Ergebnisse, dass der Gehalt an 5-hmC in Neuronen signifikant höher war als der von NSCs (Abbildung 2C-D), was auf eine dynamische 5-hmC-Modifikation während der neuronalen Entwicklung hindeutet.

Figure 1
Abbildung 1: Immunfluoreszenzfärbung von 5-hmC im Hippocampus von erwachsenen Mäusen. 5-hmC gut mit neuronalen Zellmarker NeuN kolokalisiert. Skala bar = 100 m (A-D); 50 m (E-F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: DNA-Punkt-Blot-Nachweis von 5-hmC in adulten neuronalen Stammzellen und Neuronen. (A) 5-hmC-Punktblot von NSCs unter Proliferations- (Proli) und Differenzierungsbedingungen (Diffe). (C) 5-hmC Dot-Blot von NSCs und primärneuronen. Methylenblaufärbung (B, D), die eine gleichmäßige Belastung der genomischen DNA bei jeder Konzentration in (A) bzw. (C) anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

200 ng/Punkt 400 ng/Punkt 1.000 ng/Punkt
Dna 470 ng 940 ng 2.350 ng
2 M NaOH 2,81 l 2,81 l 2,81 l
Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 Machen Sie das Volumen bis zu 14,06

Tabelle 1: Die Vorbereitung von Proben für Punktblot.

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Discussion

Epigenetische Modifikationen spielen eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung, Reifung und Funktion des Gehirns. Als stabiler Marker für die DNA-Modifikation reagiert dynamisches 5-hmC auf Verhaltensanpassung, neuronale Aktivität und ist positiv mit der Genexpression korreliert; somit ist es an der normalen Funktion des Gehirns und der neurologischen Störungbeteiligt 4. Um seine Funktion in Zellen und Geweben zu erforschen, ist es notwendig, die Existenz von 5-hmC zu erkennen und den Pegel vor und nach der Behandlung zu vergleichen. Hier zeigten wir zwei praktische Methoden zum Nachweis von 5-hmC in Zellen und Geweben, die mit gängigen Geräten im Labor durchgeführt werden konnten.

Das wichtigste Reagenz für den Nachweis von 5-hmC mit Immunfluoreszenzfärbung und DNA-Dot-Blot ist der 5-hmC-Antikörper. Der in der Methode verwendete 5-hmC-Antikörper hat nachweislich eine hohe Empfindlichkeit und ist sehr spezifisch. Für 5-hmC Färbung, Es erfordert DNA-Denaturierung mit HCl. Die richtige Behandlung von Geweben und Zellen mit HCl ist entscheidend für die vollständige DNA-Denaturierung und wirkt sich auf die Ergebnisse aus. Der DNA-Punktfleck ist eine empfindliche Methode zur Quantifizierung der Menge von 5-hmC und ist viel bequemer als die Massenspektroskopie. Für eine erfolgreiche Punktblot ist eine präzise Streuung von DNA-Proben auf die Membran erforderlich. Darüber hinaus hilft Methylenblaufärbung festzustellen, ob DNA-Proben gleichermaßen geladen waren. Beachten Sie, dass die hier beschriebenen Methoden den globalen Gehalt von 5-hmC in mehreren Zell- und Gewebetypen erkennen. Um die Menge von 5-hmC im Vergleich zu anderen Basen zu messen und sein Verteilungsmerkmal im Genom zu unterscheiden, ist EINE LC-MS/MS-Sequenzierung der nächsten Generation erforderlich.

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Disclosures

Es gibt keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

XL wurde teilweise vom National Key R&D Program of China (2017YFE0196600) und der National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31771395, 31571518) unterstützt. Q.S. wurde vom National Key Research and Development Program of China (2017YFC1001703) und dem Key Research and Development Program der Provinz Zhejiang (2017C03009) unterstützt. W.X. wurde von der Natural Science Foundation der Provinz Zhejiang (LY18H020002) und der Abteilung für Wissenschaftstechnologie der Provinz Zhejiang (2017C37057) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) Sigma-Aldrich D8417
Adobe Photoshop software Adobe Inc. /
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine Active Motif 39769
anti-NeuN Millipore MAB377
B27 supplement Gibco 12587-010
B27 supplement Gibco 12580-010
B27 supplement Gibco 17504-044
Cryostat microtome Leica CM1950
DMEM/F-12 medium OmegaScientific DM25
Epidermal growth factor PeproTech 100-15
Fibroblast growth factor-basic PeproTech 100-18B
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
GlutaMax Thermo 35050061
L-Glutamine Gibco 25030-149
Neurobasal medium Gibco 21103-049
Normal goat serum Vector Laboratories Z0325
Nylon membrane (Hybond™-N+ ) Amersham Biosciences RPN303B
OCT Leica 14020108926
Pen Strep Gibco 15140-122
Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) Sigma-Aldrich 516726
Poly-D-Lysine Sigma P0899-10
Proteinase K VVR 39450-01-6
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625
Triton X-100 Solarbio T8210

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References

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