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Neuroscience

तंत्रिका स्टेम सेल और चूहे के दिमाग में 5-hydroxymethylcytosine का पता लगाने

Published: September 19, 2019 doi: 10.3791/59950
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1,2
1The Children's Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, 2The Institute of Translational Medicine, School of Medicine, Zhejiang University

Summary

यहाँ, हम कोशिकाओं और मस्तिष्क के ऊतकों में 5-हाइड्रॉक्सीमेथिलसाइटोसाइन का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और डीएनए डॉट ब्लॉट विधियों का उपयोग करते हैं।

Abstract

स्तनधारी जीनोम में कई डीएनए संशोधनों की पहचान की गई है। इनमें से 5-मेथिलसाइटोसाइन और 5-हाइड्रॉक्सीमेथिलसाइटोसाइन-मध्य-एपिजेनेटिक तंत्र का गहन अध्ययन किया गया है। 5-हाइड्रॉक्सीमेथिल साइटोसाइन मस्तिष्क के भ्रूण और प्रसवोत्तर विकास के दौरान गतिशील विशेषताओं को प्रदर्शित करता है, जीन अभिव्यक्ति में एक नियामक समारोह निभाता है, और कई न्यूरोलॉजिकल विकारों में शामिल है। यहाँ, हम सुसंस्कृत कोशिकाओं और माउस के मस्तिष्क के ऊतकों में 5-hydroxymethylcytosine का पता लगाने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और डीएनए डॉट ब्लॉट सहित विस्तृत तरीकों का वर्णन करते हैं।

Introduction

डीएनए संशोधन, हिस्टोन संशोधन और आरएनए संशोधन सहित एपिजेनेटिक संशोधनों को विविध जैविक प्रक्रियाओं और रोगों में आवश्यक कार्य करने के लिए दिखाया गया है1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7.एक लंबे समय के लिए, डीएनए मिथाइलेशन (यानी, 5-मेथिलसाइटोसाइन (5-एमसी) को एक अत्यधिक स्थिर एपिजेनेटिक मार्कर के रूप में देखा गया है और इसे जीनोम में और संशोधित नहीं किया जा सकता है। हाल ही में, यह पाया गया है कि टीईटी 1, टीईटी 2 और टीईटी 38,9सहित टीईटी (दस-इलेवन ट्रांसलोकेशन) परिवार प्रोटीन द्वारा 5-हाइड्रॉक्सीमेथिल साइटोसाइन (5-एचएमएस) को 5-एमसी ऑक्सीकृत किया जा सकता है। आगे के अध्ययनों से पता चलता है कि 5-एचएमएस एक स्थिर मार्कर के रूप में काम कर सकता है और जीन अभिव्यक्ति4,10,11,12को विनियमित करने के माध्यम से जैविक भूमिका निभा सकता है .

वर्तमान साक्ष्यों से पता चलता है कि 5-एचएमएस स्तनधारियों में अन्य प्रकार के ऊतकों के सापेक्ष न्यूरोनल ऊतकों/कोशिकाओं में अत्यधिक समृद्ध है, और तंत्रिका विकास13,14के दौरान गतिशील विशेषताओं को दर्शाती है। न्यूरोनल सिस्टम में, 5-एचएमएस मध्यस्थता एपिजेनेटिक संशोधन तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, न्यूरॉन गतिविधि, सीखने और स्मृति, और Rett सिंड्रोम सहित कई न्यूरोलॉजिकल विकारों में शामिल है, आत्मकेंद्रित, अल्जाइमर रोग , हंटिंगटन रोग आदि2,13,15,16,17,18,19,20.

कोशिकाओं और ऊतकों में 5-hmC का पता लगाने के लिए कई दृष्टिकोण हैं14,21,22,23,24. यहाँ, हम 5-एचएमएस के अस्तित्व का पता लगाने के लिए दो विधियों का वर्णन करते हैं और 5-एचएमएस के वैश्विक स्तर की मात्रा निर्धारित करते हैं: इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और डीएनए डॉट ब्लॉट। ये दो तरीके सुविधाजनक और संवेदनशील हैं और पिछले अध्ययनों में सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है25,26,27,28,29,30. इन दो तरीकों के प्रमुख कदम डीएनए विकृतीकरण हैं। 5-एचएमएससी के इम्यूनोफ्लोरेसी धुंधला के लिए, 1 एम एच सीएल के साथ नमूनों के पूर्व उपचार की आवश्यकता है। 5-hmC डॉट ब्लॉट के लिए, डीएनए विकृतीकरण NaOH समाधान के साथ किया जाता है। इन दो तरीकों के साथ अगली पीढ़ी अनुक्रमण 5-hmC के समारोह की जांच के लिए बहुत उपयोगी उपकरण हैं.

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं झेजियांग विश्वविद्यालय की पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है.

1. वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल और न्यूरॉन्स की संस्कृति

  1. एक वयस्क (8-10 सप्ताह पुराने) C57/BL6 पुरुष माउस के forebrain से वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को अलग करें जैसा कि पहलेवर्णित 31,32.
  2. DMEM/F-12 मध्यम में संस्कृति वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं युक्त 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 पूरक, 1% एंटीबायोटिक-antimycotic, और 2 एम एम एल-ग्लूटामाइन में एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस. वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के विभेदको प्रेरित करें जिसमें 1 डिग्री एम रेटिनोइक अम्ल और 5 डिग्री सेल्सियस फोरस्कोलिन 48 एच के लिए जैसा कि पहले31,32वर्णित है .
  3. भ्रूण के दिन से न्यूरॉन्स अलग 17 (E17) neurobasal माध्यम के साथ माउस और संस्कृति के हिप्पोकैम्पी 0.25% एल-ग्लूटामाइन, 0.125% GlutaMax और 2% B27 पूरक में एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस के रूप में पहले33वर्णित .

2. माउस के ट्रांसकार्डियल भ्रम

  1. प्रयोग से एक दिन पहले 10% क्लोरल हाइड्रेट, 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) और फॉस्फेट बफरेड लवण (पीबीएस) तैयार कीजिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर कीजिए।
  2. एक वयस्क पुरुष या महिला C57 BL/6J माउस के साथ 10% क्लोरल हाइड्रेट (50 मिलीग्राम/किलोग्राम, आई.पी.) का एनेस्थेटाइज करें और यह सुनिश्चित करें कि शरीर की प्रतिक्रिया की जांच करके जानवर गहरा एनेस्थेटाइज़ किया गया है। एक प्लास्टिक बोर्ड पर चिपचिपा टेप के साथ प्रत्येक अंग को ठीक करें (एक चेहरा स्थिति में).
  3. त्वचा और फिर सर्जरी कैंची के साथ मांसपेशियों में कटौती. एक शल्य कैंची के साथ वक्ष गुहा खोलें. दिल को उजागर और एक ठीक शल्य कैंची के साथ सही atrium का एक छोटा सा हिस्सा काट दिया.
  4. ठंड पीबीएस (वयस्क माउस प्रति 30 एमएल के आसपास) के साथ बाएं वेंट्रिकल से एक 10 एमएल डिस्पोजेबल बाँझ सिरिंज के साथ माउस को दूर करें।
  5. 4% पीएफए के साथ माउस को प्रति वयस्क चूहों में 10 मिनट में लगभग 30 एमएल पर डालना जब तक यह कठोर न हो जाए।
  6. हड्डी संदंश के साथ माउस की खोपड़ी खोलें। मस्तिष्क निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर पोस्ट-फिक्सेशन के लिए एक 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 4% पीएफए के 5 एमएल में डाल दिया।
    नोट: सर्जरी समाप्त होने के बाद सर्जिकल क्षेत्र को साफ करें।
  7. कम से कम 24 घंटे बाद, मस्तिष्क के नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्ण निर्जलीकरण के लिए 30% सुक्रोज समाधान में स्थानांतरित करें।

3. मस्तिष्क अनुभागिंग

  1. एक छोटे कंटेनर में इष्टतम काटने तापमान यौगिक (OCT) में मस्तिष्क के नमूने एम्बेड, और कम से कम 1 एच के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर शांत हो जाओ।
  2. एक cryostat microtome के साथ 20-40 डिग्री की मोटाई पर धारा मस्तिष्क के नमूने.
  3. पीबीएस में वर्गों लीजिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग

  1. लक्षित मस्तिष्क क्षेत्रों के साथ वर्गों उठाओ और उन्हें पीबीएस के साथ एक 24 अच्छी थाली में डाल दिया. एक coverslip पर सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए, कदम 4.2 के लिए सीधे जाओ.
  2. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शेकर पर पीबीएस के साथ धो लें। इसे दो बार और दोहराएं।
  3. पीबीएस निकालें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए preheated 1 एम एचसीएल के साथ इलाज।
    नोट: 1 एमएल हाइड्रोक्लोरिक एसिड (36-38%) जोड़कर 1 एम एच सीएल तैयार करें। एक रासायनिक हुड में पानी के 10 एमएल में. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में 1 एम एच सीएल को प्रीहीट करें।
  4. 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ नमूने धो लें. यह दो बार और दोहराएँ.
  5. पीबीएस के साथ ब्लॉक नमूने जिसमें 3% सामान्य बकरी सीरम और 0.1% ट्राइटन एक्स-100 कमरे के तापमान पर शेकर पर 1 एच के लिए।
  6. शेकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट वर्गों।
    नोट: निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें: पॉलीक्लोनल खरगोश एंटीबॉडी-5-हाइड्रॉक्सीमेथिलसाइटोसाइन (1:5,000), माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एंटी-न्यून (1:500)।
  7. नमूने बाहर ले लो, और आगे 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट.
  8. 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ नमूने धो लें. यह दो बार और दोहराएँ.
  9. शेकर पर 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए इसी माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट। प्लेट को एल्यूमीनियम के साथ कवर करें।
    नोट: निम्नलिखित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें: एलेक्सा फ्लोर 488 बकरी विरोधी rabbit IgG (1:500), Alexa Fluor 568 बकरी विरोधी माउस IgG (1:500). 4 के साथ काउंटरस्टेन न्यूक्लिय-6-डायमिडिनो-2-फेनिलिनोडोल (डीएपीआई)।
  10. शेकर पर 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ नमूने धो लें। इसे दो बार और दोहराइए।
  11. स्लाइड पर मस्तिष्क वर्गों माउंट, antifade बढ़ते माध्यम की उचित राशि जोड़ने (लगभग 100-150 $L), और प्रीमियम कवर ग्लास के साथ कवर. नेल पॉलिश के साथ सील.
  12. एक नियमित रूप से या confocal फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ छवियों को ले लो.

5. जीनोमिक डीएनए अलगाव

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा एक वयस्क C57 BL/6J माउस (पुरुष या महिला) Euthanize और मस्तिष्क को हटा दें.
  2. एक बर्फ ठंडा पकवान पर हिप्पोकैम्पस, प्रांतस्था और सेरिबैलम ऊतकों को दूर करें। डीएनए lysis बफर के 1 एमएल में एक ऊतक चक्की के साथ ऊतकों पीस और साफ microcentrifuge ट्यूब में स्थानांतरण. 600 डिग्री सेल्सियस के प्रति प्रोटीने के 250 ग्राम जोड़ें बफर। सेल छर्रों के लिए, सीधे lysis बफर, proteinase कश्मीर जोड़ने के लिए, और अच्छी तरह से मिश्रण.
    नोट: डीएनए lysis बफर तैयार: 5 एमएम EDTA, 0.2% एसडीएस, 100 एम एम Tris-HCl, पीएच 8.5 में 200 एम एम NaCl. प्रयोग से पहले टिशू ग्राइंडर को धोकर ऑटोक्लेव करें।
  3. दूसरे दिन, 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 12 एच के लिए प्रति नमूना RNase ए के बारे में 50 डिग्री जोड़ें।
  4. फीनॉल की एक बराबर मात्रा जोड़ें:क्लोरोफॉर्म:आइसोमिल अल्कोहल (25:24:1) और पूरी तरह से मिश्रण।
  5. 15 मिनट के लिए 20,817 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, और एक नया microcentrifuge ट्यूब में supernatant हटा दें।
  6. डीएनए वेग के लिए supernatant करने के लिए क्लोरोफॉर्म के 600 $L जोड़ें, और अच्छी तरह से मिश्रण.
  7. 15 मिनट के लिए 20,817 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, और एक और नई ट्यूब में supernatant हटा दें।
  8. सुपरनेंट में आइसोप्रोपेनोल का 500 डिग्री सेल्सियस मिलाएं, और अच्छी तरह से मिलाएं।
  9. 15 मिनट के लिए 20,817 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, और पूरी तरह से supernatant हटा दें।
  10. 70% इथेनॉल के 1 एमएल के साथ वर्षा धो लें, 1 मिनट के लिए 20,817 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, और supernatant पूरी तरह से हटा दें। एक बार दोहराएँ.
  11. डीएनए गोली पूरी तरह से सूखी.
  12. उचित एकाग्रता के लिए Tris-HCl बफर (पीएच 8.5) के साथ डीएनए गोली भंग.

6. डीएनए डॉट ब्लॉट

  1. समाधान तैयार करें: 2 एम NaOH, Tris-HCl बफर (पीएच 8.5), 6x नमकीन सोडियम साइट्रेट (एसएससी).
  2. नमूना मिश्रण को सारणी 1के रूप में बनाएं।
  3. 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर विकृत डीएनए नमूने, और बर्फ पर ठंडा।
  4. नायलॉन झिल्ली (उदा., Hybond-N +) के उचित आकार में कटौती और 6x एसएससी के साथ कुल्ला।
  5. बिंदु ब्लॉट उपकरण पर झिल्ली रखो और वैक्यूम पंप से कनेक्ट. झिल्ली पर प्रति डॉट मिश्रण के 6 डिग्री एल स्पॉट.
  6. 80 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए हाइब्रिड करें, और 1 ज के लिए ट्रास-बफर नमकीन (टीबीएस) में वसा मुक्त दूध के साथ नमूना झिल्ली को ब्लॉक करें।
  7. रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट।
    नोट: निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी: पॉलीक्लोनल खरगोश विरोधी-5-hydroxyethylcytosine (1:5,000).
  8. दूसरे दिन, 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर नमूना झिल्ली को 10 मिनट के लिए टीबीएस के साथ धो लें। इस धोने को दो बार और दोहराएं।
  9. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए विरोधी rabbit माध्यमिक एंटीबॉडी (1:5,000) के साथ झिल्ली इनक्यूबेट।
  10. 10 मिनट के लिए टीबीएस के साथ धो लें. इस धो दो बार और दोहराएँ.
  11. केमियुमिनेसेंस संकेतों को विज़ुअलाइज़ करें, और संकेत तीव्रता की मात्रा निर्धारित करें।

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Representative Results

वयस्क चूहों के हिप्पोकैम्पस में 5-एचएमएस के वितरण को प्रकट करने के लिए, हमने न्यूरोनल कोशिकाओं (न्यूएन) और 5-एचएमएस सी के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस किया। हिप्पोकैम्पस में, 5-एचएमएससह न्यूरोनल सेल मार्कर न्यून के साथ अच्छी तरह से स्थानीयकृत (चित्र 1A-H), न्यूरॉन्स में 5-एचएमएस का संवर्धन का सुझाव देता है।

न्यूरोनल विकास के दौरान 5-एचएमएस की गतिशीलता का निर्धारण करने के लिए, एक डॉट ब्लॉट पहले proliferating और विभेदित वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (NSCs) से अलग डीएनए नमूने के साथ प्रदर्शन किया गया था. डॉट ब्लॉट के परिणामों से पता चला है कि एनएससी के विभेदन के दौरान 5-एचएमएस के वैश्विक स्तर में काफी वृद्धि हुई (चित्र 2ए-बी)। इसके अलावा, डॉट ब्लॉट परिणामों से पता चला है कि न्यूरॉन्स में 5-एचएमएस का स्तर एनएससी की तुलना में काफी अधिक था (चित्र 2C-D), न्यूरॉन विकास के दौरान एक गतिशील 5-एचएमएस संशोधन का सुझाव देता है।

Figure 1
चित्रा 1: वयस्क चूहों के हिप्पोकैम्पस में 5-एचएमएससी का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला। 5-HMC सह न्यूरोनल सेल मार्कर NeuN के साथ अच्छी तरह से स्थानीयकृत. स्केल बार ] 100 डिग्री मी (ए-डी) ; 50 डिग्री मी(ई-एफ) कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: डीएनए डॉट ब्लॉट का पता लगाने 5-hmC वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और न्यूरॉन्स में. (क)प्रसार (प्रोली) और विभेद (डिफ) शर्तों के अंतर्गत एनएससी के 5-एचएमएस डॉट ब्लॉट। (ग)5-एचएमएस एन एस सी और प्राथमिक न्यूरॉन्स का डॉट-ब्लॉट। मेथिलीन नीला दाग(बी, डी) क्रमशः (ए) और (ब्) में प्रत्येक सांद्रता में जीनोमिक डीएनए के बराबर लोड होने का संकेत देता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

200 एनजी/ 400 एनजी/ 1,000 एनजी/
डीएनए 470 एनजी 940 एनजी 2,350 एनजी
2 एम नाओह 2.81 $एल 2.81 $एल 2.81 $एल
Tris-HCl बफर, पीएच 7.5 14.06 डिग्री सेल्सियस तक की मात्रा बनाएँ

तालिका 1: डॉट ब्लॉट के लिए नमूनों की तैयारी।

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Discussion

Epigenetic संशोधनों मस्तिष्क के विकास के दौरान आवश्यक भूमिका निभाते हैं, परिपक्वता, और समारोह. डीएनए संशोधन के लिए एक स्थिर मार्कर के रूप में, गतिशील 5-hmC व्यवहार अनुकूलन करने के लिए प्रतिक्रिया करता है, न्यूरॉन गतिविधि, और सकारात्मक जीन अभिव्यक्ति के साथ सहसंबद्ध है; इस प्रकार, यह मस्तिष्क और तंत्रिका संबंधी विकार4के सामान्य समारोह में शामिल है। कोशिकाओं और ऊतकों में अपने कार्य का पता लगाने के लिए, 5-एचएमएस के अस्तित्व का पता लगाना और उपचार से पहले और बाद में स्तर की तुलना करना आवश्यक है। यहाँ, हम दो सुविधाजनक तरीकों का पता लगाने के लिए का प्रदर्शन 5-hmC कोशिकाओं और ऊतकों में, जो प्रयोगशाला में आम उपकरणों के साथ किया जा सकता है.

इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और डीएनए डॉट ब्लॉट के साथ 5-एचएमएसका का पता लगाने का मुख्य अभिकर्मण 5-एचएमएस एंटीबॉडी है। विधि में इस्तेमाल 5-hmC एंटीबॉडी उच्च संवेदनशीलता के लिए सिद्ध किया गया है और बहुत विशिष्ट है. 5-hmC धुंधला के लिए, यह एचसीएल के साथ डीएनए विकृतीकरण की आवश्यकता है. एचसीएल के साथ ऊतकों और कोशिकाओं का उचित उपचार पूर्ण डीएनए विकृतीकरण के लिए महत्वपूर्ण है और परिणामों को प्रभावित करता है। डीएनए डॉट ब्लॉट 5-एचएमएस की मात्रा को परिमाणित करने के लिए एक संवेदनशील तरीका है, और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोस्कोपी की तुलना में अधिक सुविधाजनक है। एक सफल डॉट ब्लॉट के लिए, झिल्ली पर डीएनए नमूनों के सटीक प्रसार की आवश्यकता है। इसके अलावा, मेथिलीन ब्लू धुंधला यह निर्धारित करने में मदद करता है कि डीएनए नमूने समान रूप से लोड किए गए थे या नहीं। ध्यान दें, यहाँ वर्णित विधियों कोशिकाओं और ऊतकों के कई प्रकार में 5-hmC के वैश्विक स्तर का पता लगाने. अन्य आधारों के सापेक्ष 5-hmC की मात्रा को मापने और जीनोम में इसकी वितरण सुविधा को अलग करने के लिए, इसके लिए LC-MS/MS और अगली पीढ़ी अनुक्रमण की आवश्यकता होती है।

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Disclosures

कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित मौजूद नहीं हैं।

Acknowledgments

एक्स्ट्रा लार्ज भाग में चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2017YFE0196600) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (ग्रेंट नंबर 31771395, 31571518) द्वारा समर्थित किया गया था। Q.S. चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2017YFC1001703) और झेजियांग प्रांत (2017C03009) के प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था। W.X. झेजियांग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (LY18H020002) और झेजियांग प्रांत के विज्ञान प्रौद्योगिकी विभाग (2017C37057) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) Sigma-Aldrich D8417
Adobe Photoshop software Adobe Inc. /
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine Active Motif 39769
anti-NeuN Millipore MAB377
B27 supplement Gibco 12587-010
B27 supplement Gibco 12580-010
B27 supplement Gibco 17504-044
Cryostat microtome Leica CM1950
DMEM/F-12 medium OmegaScientific DM25
Epidermal growth factor PeproTech 100-15
Fibroblast growth factor-basic PeproTech 100-18B
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
GlutaMax Thermo 35050061
L-Glutamine Gibco 25030-149
Neurobasal medium Gibco 21103-049
Normal goat serum Vector Laboratories Z0325
Nylon membrane (Hybond™-N+ ) Amersham Biosciences RPN303B
OCT Leica 14020108926
Pen Strep Gibco 15140-122
Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) Sigma-Aldrich 516726
Poly-D-Lysine Sigma P0899-10
Proteinase K VVR 39450-01-6
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625
Triton X-100 Solarbio T8210

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
  2. Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
  3. Day, J. J., Sweatt, J. D. DNA methylation and memory formation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).
  4. Wu, X. J., Zhang, Y. TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond. Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).
  5. Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. 5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development. Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).
  6. Li, S., Mason, C. E. The pivotal regulatory landscape of RNA modifications. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).
  7. Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection. Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).
  8. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
  9. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  10. Guo, J. U., et al. Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain. Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).
  11. Feng, J., et al. Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).
  12. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Geneticset. , Suppl 33. 245-254 (2003).
  13. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).
  14. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  15. Shu, L. Q., et al. Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease. BMC Genomics. 17, (2016).
  16. Cruvinel, E., et al. Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs. Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).
  17. Bernstein, A. I., et al. 5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity. Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).
  18. Wang, F. L., et al. Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).
  19. Yu, H., et al. Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair. Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).
  20. Wu, H., Zhang, Y. Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).
  21. Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
  22. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
  23. Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
  24. Ito, S., et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466 (7310), (2010).
  25. Wang, T., et al. Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum. Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).
  26. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  27. Wang, T., et al. Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency. Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).
  28. Li, X., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, 15903 (2017).
  29. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).
  30. Tao, H., et al. The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).
  31. Li, X. K., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, (2017).
  32. Li, X., et al. Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).
  33. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).

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तंत्रिका विज्ञान अंक 151 डीएनए demethylation 5-hydroxyethylcytosine इम्यूनोफ्लोरेसी स्टेनिंग डॉट ब्लॉट माउस मस्तिष्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं न्यूरॉन
तंत्रिका स्टेम सेल और चूहे के दिमाग में 5-hydroxymethylcytosine का पता लगाने
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Zhuang, Y., Chen, J., Xu, W., Shu,… More

Zhuang, Y., Chen, J., Xu, W., Shu, Q., Li, X. The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice. J. Vis. Exp. (151), e59950, doi:10.3791/59950 (2019).

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