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Neuroscience

Il rilevamento di 5-Hydroxytethylcytosine in cellule staminali neurali e cervelli di topi

Published: September 19, 2019 doi: 10.3791/59950
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1,2
1The Children's Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, 2The Institute of Translational Medicine, School of Medicine, Zhejiang University

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare 5-idrossimetilcitosina nelle cellule e tessuti cerebrali, utilizzando immunofluorescenza colorazione e metodi di DNA dot-blot.

Abstract

Sono state identificate diverse modifiche del DNA nel genoma dei mammiferi. Di questi, sono stati studiati intensamente i meccanismi epigenetici mediati da 5-metilcytosina e 5-idrossimethylcytosine. 5-idrossimetilcitosina mostra caratteristiche dinamiche durante lo sviluppo embrionale e postnatale del cervello, svolge una funzione regolatrice nell'espressione genica, ed è coinvolto in più disturbi neurologici. Qui, descriviamo i metodi dettagliati tra cui l'immunofluorescenza colorazione e DNA dot-blot per rilevare 5-idrossimetilcitosina nelle cellule coltivate e tessuti cerebrali del topo.

Introduction

Le modifiche epigenetiche, tra cui la modificazione del DNA, la modificazione dell'istone e la modificazione dell'RNA, hanno dimostrato di svolgere funzioni essenziali in diversi processi biologici e malattie1,2,3, 4 DEL psu' , 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7. Per lungo tempo, la metilazione del DNA (cioè la metilcitosina 5 mC) è stata vista come un marcatore epigenetico altamente stabile e non può essere ulteriormente modificata nel genoma. Recentemente, è stato scoperto che 5-mC potrebbe essere ossidato a 5-idrossimetilcitosina (5-hmC) da TET (Dieci-undici traslocazioni) proteine di famiglia tra cui TET1, TET2, e TET38,9. Ulteriori studi dimostrano che 5-hmC potrebbe fungere da marcatore stabile e svolgere ruoli biologici attraverso la regolazione dell'espressione genica4,10,11,12.

Le prove attuali indicano che 5-hmC è altamente arricchito nei tessuti neuronali / cellule rispetto ad altri tipi di tessuti nei mammiferi, e presenta caratteristiche dinamiche durante lo sviluppo neuronale13,14. Nel sistema neuronale, le modifiche epigenetiche mediate a 5-hmC svolgono un ruolo importante nella regolazione delle cellule staminali neurali, dell'attività neuronale, dell'apprendimento e della memoria, ed è coinvolta in molteplici disturbi neurologici tra cui la sindrome di Rett, l'autismo, l'Alzheimer malattia di Huntington, ecc.2,13,15,16,17,18,19,20.

Ci sono diversi approcci per rilevare 5-hmC in cellule e tessuti14,21,22,23,24. Qui, descriviamo due metodi per rilevare l'esistenza di 5-hmC e quantificare il livello globale di 5-hmC: colorazione immunofluorescenza e DNA dot-blot. Questi due metodi sono convenienti e sensibili, e sono stati utilizzati con successo negli studi precedenti25,26,27,28,29,30. I passaggi chiave di questi due metodi sono la denaturazione del DNA. Per la colorazione immunofluorescenza di 5-hmC, è necessario pre-trattamento di campioni con 1 M HCl. Per una macchia di punti da 5-hmC, la denaturazione del DNA viene eseguita con soluzione NaOH. Questi due metodi insieme al sequenziamento di nuova generazione sono strumenti molto utili per studiare la funzione di 5-hmC.

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Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato Etico Animale dell'Università di Hejiang.

1. La coltura delle cellule staminali neurali adulte e dei neuroni

  1. Isolare le cellule staminali neurali adulte dal prosencefalo di un adulto (8-10 settimane) mouse maschio C57/BL6 come descritto in precedenza31,32.
  2. Coltura cellule staminali neurali adulte in DMEM/F-12 medio contenente 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% supplemento B27, 1% antibiotico-antimiocolotico, e 2 mM L-Glutamine in un 5% DI CO2 incubatore a 37 . Indurre la differenziazione delle cellule staminali neurali adulte con 1 acido retinoico di M e 5 m forskolin per 48 h come descritto in precedenza31,32.
  3. Isolare i neuroni dal giorno embrionale 17 (E17) ippocampi del topo e della coltura con mezzo neurobasale contenente 0.25% L-Glutamine, 0.125% GlutaMax e 2% B27 supplemento in un 5% DI CO2 incubatore a 37 gradi centigradi come precedentemente descritto33.

2. Perfusione transcardiale del topo

  1. Preparare il 10% di idrato cloro, il 4% di paraformaldeide (PFA) e la salina tamponata di fosfato (PBS) un giorno prima dell'esperimento, e conservare a 4 gradi centigradi.
  2. Anestesizzare un topo adulto maschio o femmina C57 BL/6J con 10% di idrato cloro (50 mg/kg, i.p.), e assicurarsi che l'animale sia profondamente anestesizzato controllando la reazione del corpo. Fissare ogni arto con nastro adesivo su una scheda di plastica (in posizione faccia a faccia in su).
  3. Tagliare la pelle e poi il muscolo con forbici chirurgiche. Aprire la cavità toracica con una forbice chirurgica. Esporre il cuore e tagliare una piccola parte dell'atrio destro con una forbice chirurgica fine.
  4. Perfondere il topo con una siringa sterilizzata usa e getta da 10 mL dal ventricolo sinistro con PBS freddo (circa 30 mL per topo adulto).
  5. Perfondere il topo con 4% PFA (circa 30 mL in 10 min per topi adulti) fino a quando non è rigido.
  6. Aprire il cranio del topo con pinze ossee. Rimuovere il cervello e mettere in 5 mL di 4% PFA in un tubo di centrifuga 15 mL per post-fissazione a 4 gradi centigradi.
    NOT: Pulire l'area chirurgica al termine dell'intervento chirurgico.
  7. Almeno 24 h più tardi, trasferire i campioni di cervello in una soluzione di saccarosio 30% per la completa disidratazione a 4 gradi centigradi.

3. Sezionamento del cervello

  1. Incorporare i campioni cerebrali in composto ottimale per la temperatura di taglio (OCT) in un piccolo contenitore e raffreddati a -20 gradi centigradi per almeno 1 h.
  2. Sezione campioni cerebrali con uno spessore di 20-40 m con un microtoma criostatista.
  3. Raccogliere le sezioni in PBS e conservare a 4 gradi centigradi.

4. Immunofluorescenza Colorazione

  1. Raccogliere le sezioni con le regioni cerebrali mirate e metterli in una piastra di 24 pozze con PBS. Per le celle coltivate su un coverslip, andare direttamente al passaggio 4.2.
  2. Lavare con PBS sullo shaker a temperatura ambiente per 10 min. Ripetere questo due volte di più.
  3. Rimuovere PBS e trattare con preriscaldato 1 M HCl per 30 min a 37 gradi centigradi.
    NOT: Preparare 1 M HCl aggiungendo 1 mL di acido cloridrico (36-38%) in 10 mL di acqua in un cappuccio chimico. Preriscaldare 1 M HCl nell'incubatrice a 37 gradi centigradi.
  4. Lavare i campioni con PBS per 5 min.
  5. Campioni a blocchi con PBS contenenti il 3% del siero di capra normale e lo 0,1% Triton X-100 per 1 h sullo shaker a temperatura ambiente.
  6. Incubare sezioni con anticorpi primari specifici durante la notte a 4 gradi centigradi sullo shaker.
    NOT: Utilizzare i seguenti anticorpi primari: anticorpi del coniglio policlonale anti-5-idrossimetilcitosina (1:5.000), anticorpo monoclonale murino anti-NeuN (1:500).
  7. Estrarre i campioni e incubare ulteriormente a temperatura ambiente per 1 h.
  8. Lavare i campioni con PBS per 10 min. Ripetere questo due volte di più.
  9. Incubare con anticorpi secondari corrispondenti agli anticorpi primari a temperatura ambiente per 1 h sullo shaker. Coprire la piastra con l'alluminio.
    NOT: Utilizzare i seguenti anticorpi secondari: Alexa Fluor 488 capra anti-coniglio IgG (1:500), Alexa Fluor 568 capra anti-topo IgG (1:500). Nuclei controstain con 4'6-diamidino-2-fenilindole (DAPI).
  10. Lavare i campioni con PBS per 10 min sullo shaker. Ripetilo altre due volte.
  11. Montare le sezioni cerebrali sui vetrini, aggiungere una quantità adeguata di supporto di montaggio anti-dissolvenza (circa 100-150 l) e coprire con vetro di copertura premium. Sigillare con smalto.
  12. Scattare immagini con un microscopio a fluorescenza regolare o confocale.

5. Isolamento del DNA genomico

  1. Eutanasia un topo adulto C57 BL/6J (maschio o femmina) per lussazione cervicale e rimuovere il cervello.
  2. Dissezitano i tessuti dell'ippocampo, della corteccia e del cervelletto su un piatto ghiacciato. Macinare i tessuti con un grinder tissutale in 1 mL di tampone di lisi di DNA e trasferirli nel tubo di microcentrifuga pulito. Aggiungete 250 g di proteinease K per 600 luna di tampone di lisi. Per i pellet cellulari, aggiungere direttamente il tampone di lisi, la proteinasi K e mescolare accuratamente.
    NOT: Preparare il buffer di lisi del DNA: 5 mM EDTA, 0.2% SDS, 200 mM NaCl in 100 mM Tris-HCl, pH 8.5. Lavare e autoclare la smerigliatrice dei tessuti prima dell'esperimento.
  3. Il secondo giorno, aggiungere circa 50 g di RNase A per campione per almeno 12 h a 37 gradi centigradi.
  4. Aggiungere un volume uguale di fenolo:cloroformio:alcool isoamyl (25:24:1) e mescolare completamente.
  5. Centrifuga a 20.817 x g per 15 min, e rimuovere il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifuga.
  6. Aggiungere 600 litri di cloroformio al supernatante per far precipitare il DNA e mescolare accuratamente.
  7. Centrifuga a 20.817 x g per 15 min, e rimuovere il supernatante in un altro nuovo tubo.
  8. Aggiungere 500 l di isopropanolo al supernatante e mescolare accuratamente.
  9. Centrifuga a 20.817 x g per 15 min, e rimuovere completamente il supernatante.
  10. Lavare la precipitazione con 1 mL di 70% etanolo, centrifugare a 20,817 x g per 1 min, e rimuovere completamente il supernatante. Ripetere una volta.
  11. Asciugare completamente il pellet di DNA.
  12. Sciogliere il pellet di DNA con il buffer Tris-HCl (pH 8,5) alla concentrazione corretta.

6. DNA Dot Blot

  1. Preparare le soluzioni: 2 M NaOH, tampone Tris-HCl (pH 8.5), 6x citrato di sodio saline (SSC).
  2. Fare la miscela campione come Tabella 1.
  3. Denaturare i campioni di DNA a 100 gradi centigradi per 10 min e raffreddare sul ghiaccio.
  4. Tagliare la giusta dimensione della membrana di nylon (ad es., Hybond-N) e risciacquare con 6x SSC.
  5. Mettere la membrana sull'apparato punto-macchia e collegare alla pompa a vuoto. Spot 6 - L di miscela per punto sulla membrana.
  6. Ibridare per 30 min a 80 gradi centigradi e bloccare la membrana del campione con latte senza grassi in salina tamponata tris (TBS) per 1 h.
  7. Incubare con anticorpo primario a 4 gradi centigradi durante la notte.
    NOTA: il seguente anticorpo primario: coniglio policlonale anti-5-idrossimetilcitosina (1:5.000).
  8. Il secondo giorno, incubare le membrane del campione a temperatura ambiente per 1 h. Lavare con TBS per 10 min.
  9. Incubare la membrana con anticorpo secondario anti-coniglio (1:5,000) per 30 min a temperatura ambiente.
  10. Lavare con TBS per 10 min. Ripetere questo lavaggio altre due volte.
  11. Visualizzare i segnali di chemiluminescenza e quantificare l'intensità del segnale.

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Representative Results

Per rivelare la distribuzione di 5-hmC nell'ippocampo di topi adulti, abbiamo eseguito l'immunofluorescenza con anticorpi contro le cellule neuronali (NeuN) e 5-hmC. Nell'ippocampo, 5-hmC co-localizzato bene con marcatore cellulare neuronale NeuN (Figura 1A-H), suggerendo un arricchimento di 5-hmC nei neuroni.

Per determinare la dinamica di 5-hmC durante lo sviluppo neuronale, è stato eseguito un punto-blot con campioni di DNA isolati da cellule staminali neurali adulte (NSC) adulte che proliferano e differenziate. I risultati delle macchie hanno mostrato che il livello globale di 5-hmC è aumentato significativamente durante la differenziazione di NSC (Figura 2A-B). Inoltre, i risultati delle macchie di punti hanno mostrato che il livello di 5-hmC nei neuroni era significativamente superiore a quello delle NSC (Figura 2C-D), suggerendo una modifica dinamica di 5 hmC durante lo sviluppo neuronale.

Figure 1
Figura 1: colorazione immunofluorescenza di 5-hmC in ippocampo di topi adulti. 5-hmC co-localizzato bene con marcatore di cellula neuronale NeuN. Barra della scala : 100 m (A-D); 50 m (E-F). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Rilevamento del DNA dot-blot di 5-hmC nelle cellule staminali neurali adulte e neuroni. (A) 5-hmC dot-blot di NSC in condizioni di proliferazione (Proli) e differenziazione (Diffe). (C) 5-hmC punto-blot di NSC e neuroni primari. Colorazione blu di metilene (B, D) che indica un carico uguale di DNA genomico ad ogni concentrazione in (A) e (C), rispettivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

200 ng/dot 400 ng/punto 1.000 ng/punto
Dna 470 ng 940 ng 2.350 ng
2 M NaOH 2,81 l 2,81 l 2,81 l
Buffer Tris-HCl, pH 7,5 Rendere il volume fino a 14,06

Tabella 1: La preparazione di campioni per dot-blot.

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Discussion

Le modifiche epigenetiche svolgono un ruolo essenziale durante lo sviluppo cerebrale, la maturazione e la funzione. Come marcatore stabile per la modifica del DNA, dinamico 5-hmC risponde all'adattamento comportamentale, all'attività neuronale, ed è positivamente correlato con l'espressione genica; così, è coinvolto nella normale funzione del cervello e disturbo neurologico4. Per esplorare la sua funzione nelle cellule e nei tessuti, è necessario rilevare l'esistenza di 5-hmC e confrontare il livello prima e dopo il trattamento. Qui, abbiamo dimostrato due metodi pratici per rilevare 5-hmC in cellule e tessuti, che potrebbero essere eseguiti con attrezzature comuni in laboratorio.

Il reagente chiave di rilevamento 5-hmC con colorazione immunofluorescenza e DNA dot-blot è l'anticorpo 5-hmC. L'anticorpo a 5 hmC utilizzato nel metodo ha dimostrato di avere un'alta sensibilità ed è molto specifico. Per la colorazione a 5-hmC, richiede la denaturazione del DNA con HCl. Il corretto trattamento dei tessuti e delle cellule con HCl è fondamentale per la completa denaturazione del DNA e influisce sui risultati. Il DNA dot-blot è un metodo sensibile per quantificare la quantità di 5-hmC, ed è molto più conveniente della spettroscopia di massa. Per una corretta dacca-punto, è necessaria una diffusione precisa dei campioni di DNA sulla membrana. Inoltre, la colorazione blu di metilene aiuta a determinare se i campioni di DNA sono stati ugualmente caricati. Va bene, i metodi qui descritti rilevano il livello globale di 5-hmC in più tipi di cellule e tessuti. Per misurare la quantità di 5-hmC rispetto ad altre basi e distinguerne la caratteristica di distribuzione nel genoma, richiede LC-MS/MS e sequenziamento di nuova generazione.

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Disclosures

Non esistono interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

XL è stata sostenuta in parte dal National Key R&D Program of China (2017YFE0196600) e dalla National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31771395, 31571518). Q.S. è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (2017YFC1001703) e dal Key Research and Development Program della provincia di ehejiang (2017C03009). W.X. è stato sostenuto dalla Fondazione di Scienze Naturali della provincia di ejiang (LY18H020002) e dal Dipartimento di Tecnologia Della Scienza della provincia di Ehejiang (2017C37057).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) Sigma-Aldrich D8417
Adobe Photoshop software Adobe Inc. /
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine Active Motif 39769
anti-NeuN Millipore MAB377
B27 supplement Gibco 12587-010
B27 supplement Gibco 12580-010
B27 supplement Gibco 17504-044
Cryostat microtome Leica CM1950
DMEM/F-12 medium OmegaScientific DM25
Epidermal growth factor PeproTech 100-15
Fibroblast growth factor-basic PeproTech 100-18B
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
GlutaMax Thermo 35050061
L-Glutamine Gibco 25030-149
Neurobasal medium Gibco 21103-049
Normal goat serum Vector Laboratories Z0325
Nylon membrane (Hybond™-N+ ) Amersham Biosciences RPN303B
OCT Leica 14020108926
Pen Strep Gibco 15140-122
Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) Sigma-Aldrich 516726
Poly-D-Lysine Sigma P0899-10
Proteinase K VVR 39450-01-6
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625
Triton X-100 Solarbio T8210

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References

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