Summary
여기에서, 우리는 면역 형광 염색 및 DNA 점 얼룩 방법을 활용하여 세포와 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸시토신을 검출하는 프로토콜을 제시한다.
Abstract
포유류 게놈에서 여러 DNA 변형이 확인되었다. 그 중, 5-메틸시토신 및 5-하이드록시메틸시토신 매개 후생유전학 적 메커니즘이 집중적으로 연구되었습니다. 5-하이드록시메틸시토신은 뇌의 배아 및 산후 발달 시 동적 특징을 표시하고 유전자 발현에서 조절 기능을 하며 여러 신경 장애에 관여합니다. 여기서, 우리는 마우스의 배양 된 세포 및 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸 사이토신을 검출하기 위해 면역 형광 염색 및 DNA 도트 블롯을 포함한 상세한 방법을 설명합니다.
Introduction
DNA 변형, 히스톤 변형 및 RNA 변형을 포함한 후생 유전학적 변형은 다양한 생물학적 과정과 질병1,2,3에서필수적인 기능을 하는 것으로 나타났습니다. 4개 , 5개 , 6개 , 7.오랜 시간 동안, DNA 메틸화(즉, 5-메틸시토신(5-mC))는 매우 안정적인 후성유전학 적 마커로서 간주되어 왔으며 게놈에서 더 이상 변형될 수 없다. 최근, 5-mC는 TET1, TET2 및 TET38,9를포함하는 TET(11-11전좌) 패밀리 단백질에 의해 5-하이드록시메틸시토신(5-hmC)으로 산화될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 추가 연구는 5-hmC가 안정한 마커로 작용할 수 있고 유전자 발현조절을통해 생물학적 역할을 할 수 있음을 보여준다4,10,11,12.
본 증거는 5-hmC가 포유동물의 다른 유형의 조직에 비해 신경 조직/세포에서 고도로 농축되고, 신경 발달13,14동안 동적 특징을 나타낸다는 것을 나타낸다. 신경 시스템에서, 5-hmC 중재 후생 유전학 수정 신경 줄기 세포를 조절에 중요 한 역할을, 신경 활동, 학습 및 메모리, Rett 증후군을 포함 하 여 여러 신경 질환에 관여, 자폐증, 알 츠 하이 머 병 질병, 헌팅턴병 등2,13,15,16,17,18,19,20.
세포 및 조직14,21,22,23,24에서5-hmC를 검출하기위한 몇 가지 접근법이 있습니다. 여기에서, 우리는 5-hmC의 존재를 검출하고 5-hmC의 글로벌 수준을 정량화하는 2개의 방법을 기술합니다: 면역 형광 염색 및 DNA 점 얼룩. 이 두 가지 방법은 편리하고 민감하며 이전 연구25,26,27,28,29,30에서성공적으로 사용되었습니다. 이 두 방법의 주요 단계는 DNA 변성입니다. 5-hmC의 면역 형광 염색을 위해 1 M HCl로 시료를 전처리해야합니다. 5-hmC 도트 블롯의 경우 NAOH 용액으로 DNA 변이가 수행됩니다. 이 두 가지 방법은 차세대 시퀀싱과 함께 5-hmC의 기능을 조사하는 데 매우 유용한 도구입니다.
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Protocol
모든 동물 절차는 절강 대학의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 성인 신경 줄기 세포와 뉴런의 문화
- 성인의 전뇌로부터 성체 신경줄기세포를 분리(8-10주령) C57/BL6 수컷 마우스는 앞서31,32.
- 배양 성인 신경 줄기 세포DMEM/F-12 배지에서 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 보충제, 1% 항생제 항마이코제, 및 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에서 2 mML-글루타민을 함유한다. 앞서 설명한바와같이 48시간 동안 1 μM 레티노산 및 5 μM 산림을 가진 성인 신경 줄기 세포의 분화를유도한다.
- 배아일17(E17)으로부터 뉴런을 0.25% L-글루타민, 0.125% 글루타맥 및 2% B27 보충제를 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에 함유하는 신경기질 배지로 마우스 및 배양물의해마를 33.
2. 마우스의 트랜스카다이얼 관류
- 실험 하루 전에 10% 클로랄 수화물, 4% 파라포름알데히드(PFA) 및 인산완충 식염수(PBS)를 준비하고 4°C에서 보관합니다.
- 성인 남성 또는 여성 C57 BL/6J 마우스를 10% 클로랄 수화물(50 mg/kg, i.p.)으로 마취시키고 신체 반응을 확인하여 동물이 깊은 마취를 하도록 합니다. 플라스틱 보드에 끈적끈적한 테이프로 각 팔다리를 고정합니다(앞면 이면에 있음).
- 수술 가위로 피부를 잘라 다음 근육을 잘라. 외과 용 가위로 흉강을 엽니다. 심혼을 드러내고 정밀한 외과 가위로 오른쪽 심방의 작은 부분을 잘라냅니다.
- 왼쪽 심실에서 10 mL 일회용 살균 주사기로 마우스를 차가운 PBS (성인 마우스 당 약 30 mL)로 주입하십시오.
- 딱딱해질 때까지 4% PFA(성인 마우스 당 10분에서 약 30mL)로 마우스를 주입합니다.
- 뼈 집게로 마우스의 두개골을 엽니 다. 뇌를 제거하고 4°C에서 후 고정을 위해 15 mL 원심분리관에서 4% PFA의 5 mL에 넣습니다.
참고: 수술이 끝난 후 수술 부위를 청소하십시오. - 적어도 24 시간 후에, 4 °C에서 완전한 탈수에 대한 30 % 자당 용액으로 뇌 샘플을 전송합니다.
3. 뇌 절제
- 뇌 샘플을 작은 용기에 최적의 절삭 온도 화합물(OCT)에 넣고 -20°C에서 적어도 1시간 동안 식힙니다.
- 저온 유지 마이크로토메와 20-40 μm의 두께에서 뇌 샘플을 섹션.
- PBS에 섹션을 수집하고 4 °C에서 저장합니다.
4. 면역 형광 염색
- 표적 뇌 영역과 섹션을 선택하고 PBS와 24 잘 접시에 넣어. 커버 슬립에 배양 된 세포의 경우 4.2 단계로 직접 이동하십시오.
- 실온에서 셰이커에 PBS로 10분 동안 씻으시고 두 번 더 반복합니다.
- PBS를 제거하고, 37°C에서 30분 동안 예열된 1M HCl로 치료한다.
참고: 염산 1mL(36-38%)를 첨가하여 1M HCl을 준비합니다. 화학 후드에 10 mL의 물로 넣습니다. 37°C에서 인큐베이터에서 1M HCl을 예열합니다. - 샘플을 PBS로 5분 동안 세척합니다.
- 3% 정상 염소 혈청과 0.1% 트리톤 X-100을 함유한 PBS샘플을 실온에서 셰이커에 1시간 동안 차단하였다.
- 셰이커상에서 4°C에서 하룻밤 동안 특정 1차 항체로 섹션을 배양한다.
참고: 다음과 같은 1차 항체를 사용한다: 폴리클론 토끼 항체 항체-5-하이드록시메틸시토신(1:5,000), 마우스 단클론 항체 항체-NeuN(1:500). - 샘플을 꺼내, 1 시간 동안 실온에서 더 배양.
- 샘플을 PBS로 10분 동안 세척합니다.
- 셰이커상에서 1시간 동안 실온에서 1차 항체에 대응하는 이차 항체와 배양한다. 알루미늄으로 접시를 덮습니다.
참고: 다음이차 항체를 사용한다: 알렉사 플루어 488 염소 항토끼 IgG (1:500), 알렉사 플루어 568 염소 항 마우스 IgG (1:500). 4′-6-디아미디노-2-페닐린돌 (DAPI)와 카운터 스테인 핵. - 셰이커에서 10분 동안 PBS로 샘플을 씻습니다. 이 작업을 두 번 더 반복합니다.
- 슬라이드에 뇌 섹션을 장착하고, 적당한 양의 안티페이드 장착 매체(약 100-150 μL)를 추가하고 프리미엄 커버 유리로 덮습니다. 매니큐어로 밀봉하십시오.
- 일반 또는 공초점 형광 현미경으로 이미지를 찍습니다.
5. 게놈 DNA 격리
- 성인 C57 BL/6J 마우스(남성 또는 여성)를 자궁 경부 탈구로 안락사시키고 뇌를 제거합니다.
- 해마, 피질 및 소뇌 조직을 얼음 냉각 접시에 해부하십시오. DNA 분해 완충액 1 mL에서 조직 분쇄기로 조직을 갈고 깨끗한 미세 원심 분리튜브로 옮김을 옮김하십시오. 용해 완충액 600 μL 당 250 μg의 단백질A제 K를 첨가하십시오. 세포 펠릿의 경우 용해 완충액, 단백질AE K를 직접 추가하고 철저히 혼합하십시오.
참고: DNA 용해 완충액을 준비: 5 mM EDTA, 0.2% SDS, 200 mM NaCl 에서 100 mM 트리스-HCl, pH 8.5. 실험 전에 티슈 그라인더를 세척하고 오토클레이브합니다. - 둘째 날에는 37°C에서 적어도 12시간 동안 시료당 약 50 μg의 RNase A를 첨가한다.
- 페놀:클로로폼:이소아밀 알코올(25:24:1)을 넣고 완전히 섞어보세요.
- 20,817 x g에서 15 분 동안 원심 분리를 하고, 상급체를 새로운 미세 원심분리튜브로 제거한다.
- 600 μL의 클로로포름을 상급체에 첨가하여 DNA를 침전시키고 철저히 섞습니다.
- 20,817 x g에서 15 분 동안 원심 분리를 하고 상급체를 다른 새로운 튜브로 제거합니다.
- 이소프로판올 500 μL을 상급체에 넣고 완전히 섞어줍니다.
- 원심분리기는 15분 동안 20,817 x g으로 제거하고 상급체를 완전히 제거합니다.
- 강수량을 70% 에탄올 1mL로 세척하고 원심분리기를 20,817 x g에서 1분 동안 세척하고 상구체를 완전히 제거합니다. 한 번 반복합니다.
- DNA 펠릿을 완전히 건조시고 말립니다.
- DNA 펠릿을 트리스-HCl 완충액(pH 8.5)으로 적절한 농도로 용해시.
6. DNA 도트 블롯
- 용액 을 준비하십시오 : 2 M NaOH, Tris-HCl 버퍼 (pH 8.5), 6 x 식염수 구연산염 (SSC).
- 샘플 혼합물을 표 1로만듭니다.
- 100 °C에서 DNA 샘플을 10분 동안 변성시키고 얼음을 식힙니다.
- 나일론 멤브레인(예: Hybond-N+)의 적절한 크기를 자르고 6x SSC로 헹구십시오.
- 멤브레인을 도트 블롯 장치에 놓고 진공 펌프에 연결합니다. 점당 혼합물의 6 μL을 멤브레인에 두드킵니다.
- 80°C에서 30분 동안 혼성화하고, 트리스 완충식 식염수(TBS)에서 무지방 우유로 시료 막을 1시간 동안 차단합니다.
- 1차 항체를 밤새 4°C에서 배양한다.
참고 : 다음과 같은 기본 항체 : 폴리 클론 토끼 항 - 5-하이드록시메틸 시토신 (1:5,000). - 둘째 날에는 시료 막을 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 10 분 동안 TBS로 씻으하십시오.
- 실온에서 30 분 동안 항 토끼 이차 항체 (1 :5,000)로 멤브레인을 배양하십시오.
- 10 분 동안 TBS로 씻으하십시오.
- 화학 발광 신호를 시각화하고 신호 강도를 정량화합니다.
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Representative Results
성인 마우스의 해마에서 5-hmC의 분포를 밝히기 위해, 우리는 신경 세포 (NeuN) 및 5-hmC에 대한 항체로 면역 형광을 수행했습니다. 해마에서, 5-hmC는 뉴런 세포 마커 NeuN(그림1A-H)과잘 국소화되어 뉴런에서 5-hmC의 농축을 시사한다.
신경 발달 도중 5-hmC의 역학을 결정하기 위하여는, 점 얼룩은 증식하고 분화한 성인 신경 줄기 세포 (NSC)에서 분리된 DNA 견본으로 처음으로 수행되었습니다. 도트-블롯 결과는 NSC의 분화 동안 5-hmC의 글로벌 수준이 유의히 증가하였다(도2A-B). 또한, 도트-블롯 결과는 뉴런에서 5-hmC의 수준이 신경 세포 발달 동안 동적 5-hmC 변형을 시사하는 NSC(도2C-D)보다유의한 것으로 나타났다.
그림 1: 성인 마우스의 해마에서 5-hmC의 면역형광 염색. 5-hmC는 뉴런 세포 마커 NeuN과 잘 국소화되었다. 배율 막대 = 100 μm(A-D); 50 μm(E-F). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 성인 신경 줄기 세포 및 뉴런에서 5-hmC의 DNA 도트 블롯 검출. (A)확산(Proli) 및 분화(Diffe) 조건하에서 NSC의 5-hmC 도트 블롯. (C)5-hmC 도트-블롯의 NSC 및 1차 뉴런. 메틸렌 청색염색(B, D)은각각(A)및(C)에서각각의 농도에서 게놈 DNA의 동등한 하중을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 200 ng/점 | 400 ng/점 | 1,000 ng/dot | |
| Dna | 470 ng | 940 ng | 2,350 ng |
| 2 M NaOH | 2.81 μL | 2.81 μL | 2.81 μL |
| 트리스-HCl 버퍼, pH 7.5 | 최대 14.06μL의 볼륨 을 유지 |
표 1: 도트 블롯에 대한 샘플 의 준비.
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Discussion
후성 유전학 수정은 뇌 발달, 성숙 및 기능 중에 필수적인 역할을합니다. DNA 변형을 위한 안정한 마커로서, 동적 5-hmC는 행동 적응, 신경 활성에 반응하고, 유전자 발현과 긍정적으로 상관관계가 있다; 따라서, 뇌 및 신경 장애의 정상적인 기능에 관여4. 세포와 조직에서 의 기능을 탐구하려면 5-hmC의 존재를 감지하고 치료 전후의 수준을 비교해야합니다. 여기에서, 우리는 실험실에 있는 일반적인 장비로 수행될 수 있던 세포 와 조직에서 5-hmC를 검출하는 2개의 편리한 방법을 설명했습니다.
면역형광 염색 및 DNA 도트 블롯을 통해 5-hmC 검출의 주요 시약은 5-hmC 항체이다. 이 방법에 사용된 5-hmC 항체는 높은 감도를 가지며 매우 특이하다는 것이 입증되었다. 5-hmC 염색을 위해, 그것은 HCl를 가진 DNA 변성 필요. HCl을 가진 조직 그리고 세포의 적당한 처리는 완전한 DNA 변성을 위해 중요하고 결과에 영향을 미칩니다. DNA 도트 블롯은 5-hmC의 양을 정량화하는 민감한 방법이며 질량 분광법보다 훨씬 편리합니다. 성공적인 도트 블롯을 위해서는 막에 DNA 샘플을 정밀하게 퍼뜨리는 것이 필요합니다. 또한, 메틸렌 블루 염색은 DNA 샘플이 동등하게 로드되었는지 여부를 결정하는 데 도움이됩니다. 참고로, 여기에 기술된 방법은 여러 유형의 세포 및 조직에서 5-hmC의 글로벌 수준을 검출한다. 다른 염기와 비교하여 5-hmC의 양을 측정하고 게놈에서 분포 특징을 구별하려면 LC-MS/MS 및 차세대 염기서열 분석이 필요합니다.
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Disclosures
경쟁적인 재정적 이해관계는 존재하지 않습니다.
Acknowledgments
XL은 중국의 국가 핵심 R&D 프로그램(2017YFE0196600)과 중국 국립자연과학재단(Grant Nos. 31771395, 31571518)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. Q.S.는 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램(2017YFC1001703)과 절강성의 주요 연구 개발 프로그램(2017C03009)의 지원을 받았습니다. W.X.는 절강성 자연과학 재단(LY18H020002)과 절강성 과학기술부(2017C37057)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| Adobe Photoshop software | Adobe Inc. | / | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A11008 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A11001 | |
| anti-5-hydroxymethylcytosine | Active Motif | 39769 | |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| B27 supplement | Gibco | 12587-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 12580-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cryostat microtome | Leica | CM1950 | |
| DMEM/F-12 medium | OmegaScientific | DM25 | |
| Epidermal growth factor | PeproTech | 100-15 | |
| Fibroblast growth factor-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| GlutaMax | Thermo | 35050061 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-149 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | Z0325 | |
| Nylon membrane (Hybond™-N+ ) | Amersham Biosciences | RPN303B | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899-10 | |
| Proteinase K | VVR | 39450-01-6 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8210 |
References
- Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
- Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
- Day, J. J., Sweatt, J. D. DNA methylation and memory formation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).
- Wu, X. J., Zhang, Y. TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond. Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).
- Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. 5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development. Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).
- Li, S., Mason, C. E. The pivotal regulatory landscape of RNA modifications. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).
- Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection. Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- Guo, J. U., et al. Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain. Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).
- Feng, J., et al. Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Geneticset. , Suppl 33. 245-254 (2003).
- Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).
- Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
- Shu, L. Q., et al. Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease. BMC Genomics. 17, (2016).
- Cruvinel, E., et al. Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs. Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).
- Bernstein, A. I., et al. 5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity. Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).
- Wang, F. L., et al. Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).
- Yu, H., et al. Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair. Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).
- Wu, H., Zhang, Y. Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
- Inoue, A., Zhang, Y. Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
- Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
- Ito, S., et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466 (7310), (2010).
- Wang, T., et al. Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum. Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).
- Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
- Wang, T., et al. Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency. Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).
- Li, X., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, 15903 (2017).
- Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).
- Tao, H., et al. The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).
- Li, X. K., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, (2017).
- Li, X., et al. Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
