Summary
Her presenterer vi en protokoll for å oppdage 5-hydroxymethylcytosine i celler og hjernen vev, utnytte immunofluorescence farging og DNA dot-blot metoder.
Abstract
Flere DNA modifikasjoner har blitt identifisert i pattedyr Genova. Av det, 5-methylcytosine og 5-hydroxymethylcytosine-mediert epigenetic mekanismer har vært intensivt studert. 5-hydroxymethylcytosine viser dynamiske funksjoner under embryonale og postnatal utviklingen av hjernen, spiller en regulerende funksjon i genuttrykk, og er involvert i flere nevrologiske lidelser. Her beskriver vi detaljerte metoder inkludert immunofluorescence farging og DNA dot-blot å oppdage 5-hydroxymethylcytosine i kulturperler celler og hjernen vev av mus.
Introduction
Epigenetic modifikasjoner, inkludert DNA modifikasjon, histone modifisering og RNA modifisering, har vist å spille viktige funksjoner i ulike biologiske prosesser og sykdommer1,2,3, 4 andre priser , 5 andre priser , 6 andre priser , 7. i lang tid, DNA metylering (dvs. 5-methylcytosine (5-mC)) har blitt sett på som en svært stabil epigenetic markør og kan ikke bli ytterligere endret i Genova. Nylig har det blitt funnet at 5-mC kan være oksidert til 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) av tet (Ten-eleven translokasjoner) familie proteiner inkludert TET1, TET2, og TET38,9. Videre studier viser at 5-hmC kan tjene som en stabil markør og spille biologiske roller gjennom å regulere genuttrykk4,10,11,12.
Den nåværende bevisene tyder på at 5-hmC er svært beriket i neuronal vev/celler i forhold til andre typer vev i pattedyr, og utstillinger dynamiske funksjoner under neuronal utvikling13,14. I neuronal systemet, 5-hmC mediert epigenetic modifikasjoner spiller en viktig rolle i å regulere nevrale stamceller, neuronal aktivitet, læring og hukommelse, og er involvert i flere nevrologiske lidelser, inkludert rett syndrom, autisme, Alzheimers sykdom, Huntington sykdom, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.
Det er flere tilnærminger for å oppdage 5-hmC i celler og vev14,21,22,23,24. Her beskriver vi to metoder for å oppdage eksistensen av 5-hmC og Kvantifisere det globale nivået av 5-hmC: immunofluorescence farging og DNA dot-blot. Disse to metodene er praktiske og følsomme, og har blitt brukt i tidligere studier25,26,27,28,29,30. De viktigste trinnene i disse to metodene er DNA-denaturering. For immunofluorescence farging av 5-hmC er forhåndsbehandling av prøver med 1 M HCl nødvendig. For 5-hmC dot-blot utføres DNA-denaturering med NaOH-løsning. Disse to metodene sammen med neste generasjons sekvensering er svært nyttig verktøy for å undersøke funksjonen til 5-hmC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrene er godkjent av Animal etikk Committee of Zhejiang University.
1. kulturen i voksen nevrale stamceller og neurons
- Isolere voksen nevrale stamceller fra forebrain av en voksen (8-10 uke gammel) C57/BL6 mannlig mus som beskrevet tidligere31,32.
- Kultur voksen nevrale stamceller i DMEM/F-12 medium som inneholder 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 supplement, 1% antibiotika-antimykotisk, og 2 mM L-glutamin i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° c. Indusere differensiering av voksne nevrale stamceller med 1 μM retinoic syre og 5 μM Forskolin for 48 h som beskrevet tidligere31,32.
- Isoler neurons fra den embryonale dagen 17 (E17) hippocampi av mus og kultur med neurobasal medium inneholder av 0,25% L-glutamin, 0,125% GlutaMax og 2% B27 supplement i en 5% CO2 inkubator på 37 ° c som tidligere beskrevet33.
2. Transcardial av musen
- Klargjør 10% kloralhydrat hydrat, 4% paraformaldehyde (PFA) og fosfat bufret saltvann (PBS) én dag før eksperimentet, og oppbevar ved 4 ° c.
- Bedøve en voksen mannlig eller kvinnelig C57 BL/6J mus med 10% kloralhydrat hydrat (50 mg/kg, IP), og sikre at dyret er dypt anesthetized ved å sjekke kroppen reaksjonen. Fix hvert lem med klebrig tape på en plast bord (i en forside opp posisjon).
- Skjær huden og deretter muskelen med kirurgi saks. Åpne bryst hulen med en kirurgisk saks. Utsett hjertet og kuttet av en liten del av det rette atriet med en fin kirurgisk saks.
- Perfuse musen med en 10 mL en gangs sterilisert sprøyte fra venstre ventrikkel med kald PBS (rundt 30 mL per voksen mus).
- Perfuse musen med 4% PFA (rundt 30 mL i 10 min per voksen mus) til den er stiv.
- Åpne skallen på musen med bein tang. Ta av hjernen og sett den inn i 5 mL 4% PFA i et 15 mL sentrifugerør til etter fiksering ved 4 ° c.
Merk: Rengjør operasjonsområdet etter at operasjonen er ferdig. - Minst 24 h senere overfører du hjerne prøvene til en 30% sukrose løsning for fullstendig dehydrering ved 4 ° c.
3. Brain snitting
- Legg inn hjerne prøvene i optimal skjære temperatur forbindelse (OCT) i en liten beholder, og Kjøl ned ved-20 ° c i minst 1 time.
- § Hjernen prøver med en tykkelse på 20-40 μm med en kryostaten mikrotomen.
- Samle seksjoner i PBS og lagre ved 4 ° c.
4. Immunofluorescence farging
- Plukk opp seksjoner med målrettede hjernen regioner og sette dem inn i en 24-brønn plate med PBS. For kultivert celler på en dekkglass, gå direkte til trinn 4,2.
- Vask med PBS på shaker ved romtemperatur i 10 min. Gjenta dette to ganger til.
- Fjern PBS, og behandle med forvarmet 1 M HCl i 30 min ved 37 ° c.
Merk: Forbered 1 M HCl ved å tilsette 1 mL saltsyre (36-38%) i 10 mL vann i en kjemisk hette. Forvarming 1 M HCl i inkubator ved 37 ° c. - Vask prøvene med PBS i 5 min. Gjenta dette to ganger til.
- Blokker prøver med PBS som inneholder 3% normal geit serum og 0,1% Triton X-100 for 1 time på shaker ved romtemperatur.
- Ruge seksjoner med spesifikke primære antistoffer over natten ved 4 ° c på shaker.
Merk: Bruk følgende primære antistoffer: polyklonale kanin antistoffer anti-5-hydroxymethylcytosine (1:5000), mus monoklonale antistoff anti-NeuN (1:500). - Ta ut prøvene, og ytterligere ruge ved romtemperatur for 1 time.
- Vask prøvene med PBS i 10 min. Gjenta dette to ganger til.
- Ruge med sekundære antistoffer som tilsvarer den primære antistoffer ved romtemperatur i 1 time på shaker. Dekkplaten med aluminium.
Merk: Bruk følgende sekundære antistoffer: Alexa fluor 488 geit anti-kanin IgG (1:500), Alexa fluor 568 geit anti-mus IgG (1:500). Counterstain kjerner med 4 ′ -6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). - Vask prøvene med PBS i 10 minutter på shaker. Gjenta dette to ganger til.
- Monter hjernens seksjoner på lysbildene, Legg riktig mengde Antifade festemiddel (rundt 100-150 μL), og dekk med Premium deksel glass. Seal med neglelakk.
- Ta bilder med et vanlig eller konfokalmikroskopi fluorescens mikroskop.
5. genomisk DNA-isolasjon
- Euthanize en voksen C57 BL/6J mus (mann eller kvinne) ved cervical forvridning og fjerne hjernen.
- Analysere hippocampus, cortex og lillehjernen vev på en is-avkjølt parabolen. Grind vev med en vev jeksel i 1 mL DNA lyseringsbuffer og overføre til ren mikrosentrifugen tube. Tilsett 250 mikrogram proteinase K per 600 μL av lyseringsbuffer. For celle pellets, Legg til lyseringsbuffer direkte, proteinase K og bland godt.
Merk: Klargjør DNA lyseringsbuffer: 5 mM EDTA, 0,2% SDS, 200 mM NaCl i 100 mM Tris-HCl, pH 8,5. Vask og autoklav vev jeksel før eksperimentet. - Den andre dagen, tilsett ca 50 mikrogram RNase A per prøve i minst 12 timer ved 37 ° c.
- Legg til et likt volum av fenol: kloroform: isoamylacetat alkohol (25:24:1) og bland helt.
- Sentrifuger på 20 817 x g i 15 min, og fjerne supernatanten i en ny mikrosentrifugen tube.
- Tilsett 600 μL av kloroform til supernatanten for å utløse DNA, og bland godt.
- Sentrifuger på 20 817 x g i 15 min, og fjerne supernatanten i et annet nytt rør.
- Tilsett 500 μL av isopropanol til supernatanten, og bland godt.
- Sentrifuger på 20 817 x g i 15 min, og fjern supernatanten helt.
- Vask nedbøren med 1 mL 70% etanol, sentrifuger ved 20 817 x g i 1 min, og fjern supernatanten helt. Gjenta én gang.
- Tørk DNA pellet helt.
- Løs opp DNA-pellet med Tris-HCl buffer (pH 8,5) til riktig konsentrasjon.
6. DNA prikk blot
- Klargjør løsningene: 2 M NaOH, Tris-HCl buffer (pH 8,5), 6 ganger saltvann (SSC).
- Lag prøve blandingen som tabell 1.
- Denaturere DNA-prøver ved 100 ° c i 10 min, og Avkjøl på is.
- Skjær riktig størrelse på nylon membran (f. eks, Hybond-N +) og skyll med 6 ganger SSC.
- Sett membranen på dot-blot apparat og koble til vakuumpumpen. Punkt 6 μL av blanding per prikk på membranen.
- Hybridize i 30 min ved 80 ° c, og blokker prøve membranen med fettfri melk i Tris-bufret saltvann (TBS) for 1 time.
- Ruge med primært antistoff ved 4 ° c over natten.
Merk: følgende primære antistoff: polyklonale kanin anti-5-hydroxymethylcytosine (1:5000). - På den andre dagen ruge prøve membraner ved romtemperatur i 1 time. vask med TBS i 10 min. Gjenta denne vasken to ganger til.
- Ruge membranen med anti-kanin sekundær antistoff (1:5000) i 30 min ved romtemperatur.
- Vask med TBS i 10 min. Gjenta denne vasken to ganger til.
- Visualiser kjemiluminescens signaler og kvantifisere signal intensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å avdekke fordelingen av 5-hmC i hippocampus hos voksne mus, utførte vi immunofluorescence med antistoffer mot neuronal celler (NeuN) og 5-hmC. I hippocampus, 5-hmC co-lokaliserte godt med neuronal celle markør NeuN (figur 1a-H), antyder en berikelse av 5-hmC i neurons.
For å bestemme dynamikken i 5-hmC under neuronal utvikling, en dot-blot ble først utført med DNA-prøver isolert fra voksende og differensiert voksen nevrale stamceller (NSCs). Dot-blot resultater viste at det globale nivået på 5-hmC betydelig økt under differensiering av NSC (figur 2a-B). Videre viste dot-blot resultater at nivået på 5-hmC i neurons var signifikant høyere enn for NSCs (figur 2C-D), noe som tyder på en dynamisk 5-hmC modifikasjon under neuronal utvikling.
Figur 1: Immunofluorescence farging av 5-hmC i hippocampus hos voksne mus. 5-hmC co-lokaliserte godt med neuronal celle markør NeuN. Scale bar = 100 μm (A-D); 50 μm (E-F). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: DNA dot-blot deteksjon av 5-hmC i voksen nevrale stamceller og neurons. (A) 5-hmC prikk-blot av NSCs under spredning (Proli) og differensiering (forskjeller) forhold. (C) 5-hmC prikk-blot av NSCs og primære neurons. Metylen blå farging (B, D) indikerer en lik lasting av genomisk DNA ved hver konsentrasjon i (A) og (C), henholdsvis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| 200 ng/prikk | 400 ng/prikk | 1 000 ng/prikk | |
| Dna | 470 av ng | 940 av ng | 2 350 av ng |
| 2 M NaOH | 2,81 μL | 2,81 μL | 2,81 μL |
| Tris-HCl-buffer, pH 7,5 | Gjør volumet opptil 14,06 μL |
Tabell 1: utarbeidelse av prøver for dot-blot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epigenetic modifikasjoner spiller viktige roller under hjernens utvikling, modning og funksjon. Som en stabil markør for DNA modifisering, dynamisk 5-hmC reagerer på atferdsmessige tilpasning, neuronal aktivitet, og er positivt korrelert med genuttrykk; Dermed er det involvert i normal funksjon av hjernen og nevrologisk lidelse4. For å utforske sin funksjon i celler og vev, er det nødvendig å oppdage eksistensen av 5-hmC og sammenligne nivået før og etter behandling. Her demonstrerte vi to praktiske metoder for å oppdage 5-hmC i celler og vev, som kan utføres med vanlig utstyr i laboratoriet.
Nøkkelen reagens for å oppdage 5-hmC med immunofluorescence farging og DNA dot-Blot er 5-hmC antistoff. Den 5-hmC antistoff som brukes i metoden har vist seg å ha høy følsomhet og er svært spesifikk. For 5-hmC farging, krever det DNA denaturering med HCl. Riktig behandling av vev og celler med HCl er avgjørende for fullstendig DNA-denaturering og påvirker resultatene. DNA dot-Blot er en følsom metode for å kvantifisere mengden av 5-hmC, og er mye mer praktisk enn masse spektroskopi. For en vellykket prikk-blot, er presis spredning av DNA-prøver på membranen nødvendig. Videre bidrar metylen blå farging til å avgjøre om DNA-prøvene var like lastet inn. Av notatet, metodene som er beskrevet her oppdage det globale nivået av 5-hmC i flere typer celler og vev. Å målbeløpet av 5-hmC i forhold til annet baser og skjelne dens distribusjon ansiktstrekk inne Genova, den behøver LC-MULTIPLE SCLEROSIS/MULTIPLE SCLEROSIS og neste-generasjon sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen konkurrerende økonomiske interesser eksisterer.
Acknowledgments
XL ble støttet delvis av den nasjonale nøkkel R & D-programmet i Kina (2017YFE0196600), og National Natural Science Foundation i Kina (Grant NOS. 31771395, 31571518). QS var understøttet av det nasjonal nøkkel forskning og utviklingen program av porselen (2017YFC1001703) og nøkkelen forskning og utviklingen program av Zhejiang område (2017C03009). W.X. ble støttet av Natural Science Foundation i Zhejiang-provinsen (LY18H020002) og Science Technology Department of Zhejiang-provinsen (2017C37057).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| Adobe Photoshop software | Adobe Inc. | / | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A11008 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A11001 | |
| anti-5-hydroxymethylcytosine | Active Motif | 39769 | |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| B27 supplement | Gibco | 12587-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 12580-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cryostat microtome | Leica | CM1950 | |
| DMEM/F-12 medium | OmegaScientific | DM25 | |
| Epidermal growth factor | PeproTech | 100-15 | |
| Fibroblast growth factor-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| GlutaMax | Thermo | 35050061 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-149 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | Z0325 | |
| Nylon membrane (Hybond™-N+ ) | Amersham Biosciences | RPN303B | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899-10 | |
| Proteinase K | VVR | 39450-01-6 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8210 |
References
- Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
- Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
- Day, J. J., Sweatt, J. D. DNA methylation and memory formation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).
- Wu, X. J., Zhang, Y. TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond. Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).
- Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. 5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development. Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).
- Li, S., Mason, C. E. The pivotal regulatory landscape of RNA modifications. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).
- Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection. Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- Guo, J. U., et al. Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain. Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).
- Feng, J., et al. Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Geneticset. , Suppl 33. 245-254 (2003).
- Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).
- Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
- Shu, L. Q., et al. Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease. BMC Genomics. 17, (2016).
- Cruvinel, E., et al. Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs. Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).
- Bernstein, A. I., et al. 5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity. Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).
- Wang, F. L., et al. Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).
- Yu, H., et al. Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair. Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).
- Wu, H., Zhang, Y. Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
- Inoue, A., Zhang, Y. Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
- Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
- Ito, S., et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466 (7310), (2010).
- Wang, T., et al. Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum. Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).
- Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
- Wang, T., et al. Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency. Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).
- Li, X., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, 15903 (2017).
- Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).
- Tao, H., et al. The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).
- Li, X. K., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, (2017).
- Li, X., et al. Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
