Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar 5 hydroxymethylcytosine nas pilhas e nos tecidos do cérebro, utilizando a mancha da imunofluorescência e os métodos do dot-borrão do ADN.
Abstract
As modificações múltiplas do ADN foram identificadas no genoma mamífero. Deste, 5-methylcytosine e 5-hydroxymethylcytosine-mediam mecanismos epigenéticas foram estudados intensivamente. 5-Hidroximetilcitosina apresenta características dinâmicas durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal do cérebro, desempenha uma função reguladora na expressão gênica, e está envolvida em múltiplas desordens neurológicas. Aqui, nós descrevemos os métodos detalhados que incluem a coloração da imunofluorescência e o dot-borrão do ADN para detectar 5 hydroxymethylcytosine em pilhas cultivadas e em tecidos do cérebro do rato.
Introduction
As modificações epigenéticas, incluindo a modificação do ADN, a modificação do histona e a modificação do RNA, foram mostradas para jogar funções essenciais em processos e em doenças biológicos diversos1,2,3, 4. º , 5. º , 6 anos de , 7. por um longo tempo, METILAÇÃO de DNA (ou seja, 5-metilcitosina (5-MC)) tem sido visto como um marcador epigenético altamente estável e não pode ser mais modificado no genoma. Recentemente, verificou-se que 5-MC poderia ser oxidado a 5-Hidroximetilcitosina (5-hmC) por Tet (dez-onze translocações) proteínas dafamília, incluindoTET1, TET2, e TET38,9. Estudos adicionais mostram que 5-hmC poderia servir como um marcador estável e desempenhar papéis biológicos através da regulação da expressão gênica4,10,11,12.
As evidências atuais indicam que 5-hmC é altamente enriquecido em tecidos/células neuronais em relação a outros tipos de tecidos em mamíferos, e apresenta características dinâmicas durante o desenvolvimento neuronal13,14. No sistema neuronal, as modificações epigenéticas mediadas por 5 hmC desempenham um papel importante na regulação das células-tronco neurais, atividade neuronal, aprendizagem e memória, e está envolvida em múltiplas desordens neurológicas, incluindo Síndrome de Rett, autismo, Alzheimer doença de Huntington, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.
Existem várias abordagens para a detecção de 5-hmC em células e tecidos14,21,22,23,24. Aqui, nós descrevemos dois métodos para detectar a existência de 5-hmC e quantificamos o nível global de 5-hmC: a coloração da imunofluorescência e o dot-borrão do ADN. Estes dois métodos são convenientes e sensíveis, e foram usados com sucesso em estudos precedentes25,26,27,28,29,30. Os passos-chave destes dois métodos são a desnaturação do DNA. Para a coloração da imunofluorescência de 5-hmC, o pré-tratamento das amostras com 1 M HCl é exigido. Para o ponto-borrão de 5 hmC, a desnaturação do ADN é executada com solução de NaOH. Esses dois métodos, juntamente com o sequenciamento de próxima geração, são ferramentas muito úteis para investigar a função do 5-hmC.
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Protocol
Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê de ética animal da Universidade de Zhejiang.
1. a cultura de células-tronco neurais adultas e neurônios
- Isole pilhas de haste neural adultas do prosencéfalo de um adulto (8-10 semanas velho) C57/BL6 macho rato como descrito previamente31,32.
- Cultura células tronco neurais adultas em DMEM/F-12 médio contendo 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 suplemento, 1% antibiótico-antimicótico, e 2 mM L-glutamina em uma incubadora de 5% CO2 em 37 ° c. Induzir a diferenciação de células-tronco neurais adultas com 1 μm de ácido retinóico e 5 μm de forskolina para 48 h, conforme descrito anteriormente31,32.
- Isolar os neurônios do dia embrionário 17 (E17) hipocampo do rato e cultura com meio neurobasal contendo de 0,25% L-glutamina, 0,125% glutamax e 2% B27 suplemento em uma incubadora de co2 de 5% a 37 ° c como descrito anteriormente33.
2. perfusão transcardial do rato
- Prepare 10% de hidrato de cloral, 4% paraformaldeído (PFA) e tampão fosfato salina (PBS) um dia antes do experimento, e armazene a 4 ° c.
- Anestesiar um adulto macho ou fêmea C57 BL/6J rato com 10% hidrato de cloral (50 mg/kg, i.p.), e certifique-se de que o animal está profundamente anestesiado, verificando a reação do corpo. Fixar cada membro com fita adesiva em uma placa de plástico (em uma posição de face para cima).
- Corte a pele e, em seguida, o músculo com tesoura cirurgia. Abra a cavidade torácica com uma tesoura cirúrgica. Expor o coração e cortar uma pequena parte do átrio direito com uma tesoura cirúrgica multa.
- Perfuse o rato com uma seringa esterilizada descartável de 10 mL do ventrículo esquerdo com PBS frio (ao redor 30 mL por o rato adulto).
- Perfuse o rato com o PFA de 4% (ao redor 30 mL em 10 minutos por ratos adultos) até que esteja duro.
- Abra o crânio do mouse com fórceps ósseo. Retire o cérebro e coloque em 5 mL de PFA de 4% em um tubo de centrífuga de 15 mL para a pós-fixação a 4 ° c.
Nota: Limpe a área cirúrgica após a cirurgia ter terminado. - Pelo menos 24 h mais tarde, transfira as amostras do cérebro em uma solução da sacarose de 30% para a desidratação completa em 4 ° c.
3. seccionamento cerebral
- Incorpore as amostras cerebrais em um composto de temperatura de corte ideal (OCT) em um pequeno recipiente e esfrie a-20 ° c por pelo menos 1 h.
- Amostras do cérebro da seção em uma espessura de 20-40 μm com um micrótomo do criostato.
- Colete seções em PBS e armazene a 4 ° c.
4. coloração da imunofluorescência
- Pegue as seções com as regiões cerebrais alvo e colocá-los em uma placa de 24 poços com PBS. Para células cultivadas em uma lamínula, vá diretamente para a etapa 4,2.
- Lave com PBS na coqueteleira à temperatura ambiente durante 10 min. Repita isto duas vezes mais.
- Remova o PBS e trate com HCl pré-aquecido de 1 M por 30 min a 37 ° c.
Nota: Prepare 1 M HCl adicionando 1 mL de ácido clorídrico (36-38%) em 10 mL de água em um capuz químico. Pré-aqueça 1 M HCl na incubadora a 37 ° c. - Lave as amostras com PBS durante 5 min. Repita isso duas vezes mais.
- Amostras de bloco com PBS contendo 3% de soro de cabra normal e 0,1% Triton X-100 por 1 h na coqueteleira à temperatura ambiente.
- Incubar secções com anticorpos primários específicos durante a noite a 4 ° c na coqueteleira.
Nota: Use os seguintes anticorpos preliminares: anticorpos Polyclonal do coelho anti-5-hydroxymethylcytosine (1:5000), anticorpo monoclonal anti-NeuN do rato (1:500). - Tire as amostras e incubar ainda à temperatura ambiente durante 1 h.
- Lave as amostras com PBS durante 10 min. Repita isso duas vezes mais.
- Incubar com anticorpos secundários correspondentes aos anticorpos primários à temperatura ambiente durante 1 h na coqueteleira. Cubra a placa com alumínio.
Nota: Use os seguintes anticorpos secundários: Alexa fluor 488 cabra anti-coelho IgG (1:500), Alexa fluor 568 cabra anti-mouse IgG (1:500). Núcleos de contratura com 4 ′-2-diamidino-phenylindole (DAPI). - Lave as amostras com PBS durante 10 min na coqueteleira. Repita isso duas vezes mais.
- Monte seções cerebrais sobre as lâminas, adicione uma quantidade adequada de meio de montagem Antifade (cerca de 100-150 μL), e cubra com vidro de cobertura Premium. Selo com lustrador de prego.
- Tome imagens com um microscópio de fluorescência regular ou confocal.
5. isolação do ADN de Genomic
- Eutanizar um adulto C57 BL/6J mouse (masculino ou feminino) por luxação cervical e remover o cérebro.
- Dissecar os tecidos do hipocampo, córtex e cerebelo em um prato refrigerado a gelo. Esfregue os tecidos com um moedor de tecido em 1 mL de tampão de lise de DNA e transfira para o tubo de microcentrífuga limpo. Adicionar 250 μg de proteinase K por 600 μL de tampão de Lise. Para pelotas da pilha, adicione diretamente o amortecedor do lysis, proteinase K, e misture-o completamente.
Nota: Prepare o tampão do lysis do ADN: EDTA de 5 milímetros, 0,2% SDS, 200 milímetros NaCl em 100 milímetros Tris-HCl, pH 8,5. Lave e autoclave o moedor de tecido antes do experimento. - No segundo dia, acrescentar cerca de 50 μg de RNase A por amostra de pelo menos 12 h a 37 ° c.
- Adicione um volume igual de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1) e misture completamente.
- Centrifugue a 20.817 x g durante 15 min e retire o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga.
- Adicionar 600 μL de clorofórmio ao sobrenadante para precipizar o ADN e misturar completamente.
- Centrifugue a 20.817 x g durante 15 min e retire o sobrenadante para outro tubo novo.
- Adicionar 500 μL de isopropanol ao sobrenadante e misturar cuidadosamente.
- Centrifugue em 20.817 x g por 15 min, e retire o sobrenadante completamente.
- Lave a precipitação com 1 mL de 70% de etanol, Centrifugue a 20.817 x g durante 1 min e retire o sobrenadante completamente. Repita uma vez.
- Seque completamente o pellet de DNA.
- Dissolva a pelota do ADN com amortecedor de Tris-HCl (pH 8,5) à concentração apropriada.
6. borrão do ponto do ADN
- Preparar as soluções: 2 M NaOH, tampão Tris-HCl (pH 8,5), 6x citrato de sódio salino (SSC).
- Faça a mistura da amostra como tabela 1.
- Amostras de DNA de denature a 100 ° c por 10 min, e resfriar no gelo.
- Corte o tamanho adequado da membrana de nylon (por exemplo, HYBOND-N +) e enxague com 6x SSC.
- Põr a membrana sobre o instrumento do ponto-Borrão e conecte-a à bomba de vácuo. Ponto 6 μL de mistura por ponto na membrana.
- Hibridizar por 30 min a 80 ° c e bloquear a membrana da amostra com leite sem gordura em soro fisiológico com tampão Tris (TBS) por 1 h.
- Incubar com anticorpo primário a 4 ° c durante a noite.
Nota: o seguinte anticorpo preliminar: coelho Polyclonal anti-5-hydroxymethylcytosine (1:5000). - No segundo dia, incubar as membranas da amostra à temperatura ambiente durante 1 h. Lave com TBS durante 10 min. Repita esta lavagem mais duas vezes.
- Incubar a membrana com anticorpo secundário anticoelho (1:5000) durante 30 min à temperatura ambiente.
- Lave com TBS durante 10 min. Repita esta lavagem mais duas vezes.
- Visualize os sinais de quimioluminescência e quantifique intensidades de sinal.
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Representative Results
Para revelar a distribuição de 5-hmC no hipocampo de camundongos adultos, realizamos imunofluorescência com anticorpos contra células neuronais (NeuN) e 5-hmC. No hipocampo, o 5-hmC colocalizada bem com marcador de células neuronais NeuN (Figura 1a-H), sugerindo um enriquecimento de 5-HMC em neurônios.
Para determinar a dinâmica de 5-hmC durante o desenvolvimento neuronal, um dot-blot foi realizado pela primeira vez com amostras de DNA isoladas de proliferating e diferenciado adulto células-tronco neurais (NSCs). Os resultados do dot-blot mostraram que o nível global de 5-hmC aumentou significativamente durante a diferenciação do NSC (Figura 2a-B). Mais, os resultados do dot-borrão mostraram que o nível de 5-hmC nos neurônios era significativamente mais elevado do que aquele de NSCs (Figura 2C-D), sugerindo uma modificação dinâmica de 5 HMC durante o desenvolvimento neuronal.
Figura 1: coloração de imunofluorescência de 5-hmC no hipocampo de camundongos adultos. 5-hmC colocalizada bem com marcador de células neuronais NeuN. Barra de escala = 100 μm (A-D); 50 μm (E-F). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: detecção de Dot-blot de DNA de 5-hmC em células-tronco neurais adultas e neurônios. (A) 5-hmC dot-blot de NSCS condições de proliferação (proli) e diferenciação (diffe). (C) 5-hmC dot-blot de NSCS e neurônios primários. Coloração azul de metileno (B, D) indicando um carregamento igual de DNA genómico em cada concentração em (A) e (C), respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
200 ng/dot | 400 ng/dot | 1.000 ng/dot | |
Dna | 470 ng | 940 ng | 2.350 ng |
2 M NaOH | 2,81 μL | 2,81 μL | 2,81 μL |
Tampão Tris-HCl, pH 7,5 | Faça o volume até 14, 6 μL |
Tabela 1: a preparação de amostras para Dot-Blot.
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Discussion
Modificações epigenéticas desempenham papéis essenciais durante o desenvolvimento do cérebro, maturação e função. Como um marcador estável para a modificação do ADN, o 5-hmC dinâmico responde à adaptação comportamental, à atividade neuronal, e é correlacionado positivamente com a expressão de gene; assim, está envolvida na função normal do cérebro e da desordem neurológica4. Para explorar sua função em células e tecidos, é necessário detectar a existência de 5-hmC e comparar o nível antes e após o tratamento. Aqui, Nós demonstramos dois métodos convenientes para detectar 5-hmC nas pilhas e nos tecidos, que poderiam ser executados com equipamento comum no laboratório.
O reagente chave de detectar 5-hmC com coloração da imunofluorescência e ponto-borrão do ADN é o anticorpo 5-hmC. O anticorpo 5-hmC usado no método foi provado ter a sensibilidade elevada e é muito específico. Para a coloração de 5-hmC, exige a desnaturação do ADN com HCl. O tratamento adequado dos tecidos e células com HCl é crítico para a desnaturação completa do DNA e afeta os resultados. O DNA dot-blot é um método sensível para quantificar a quantidade de 5-hmC, e é muito mais conveniente do que a espectroscopia de massa. Para um ponto-borrão bem sucedido, espalhar preciso de amostras do ADN na membrana é exigido. Além disso, a coloração azul de metileno ajuda a determinar se as amostras de DNA foram igualmente carregadas. De notar, os métodos descritos aqui detectam o nível global de 5-hmC em vários tipos de células e tecidos. Para medir a quantidade de 5-hmC em relação a outras bases e distinguir seu recurso de distribuição no genoma, ele requer LC-MS/MS e seqüenciamento de próxima geração.
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Disclosures
Não existem interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
O XL foi apoiado na parte pelo programa nacional da chave R & D de China (2017YFE0196600), e pela Fundação Nacional da ciência natural de China (Grant nos. 31771395, 31571518). VEÍCULO especial Q.S.P. foi apoiado pelo programa de pesquisa e desenvolvimento chave nacional da China (2017YFC1001703) e o programa-chave de pesquisa e desenvolvimento da província de Zhejiang (2017C03009). W.X. foi apoiado pela Fundação de ciência natural da província de Zhejiang (LY18H020002) e departamento de tecnologia da ciência da província de Zhejiang (2017C37057).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) | Sigma-Aldrich | D8417 | |
Adobe Photoshop software | Adobe Inc. | / | |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A11008 | |
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A11001 | |
anti-5-hydroxymethylcytosine | Active Motif | 39769 | |
anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
B27 supplement | Gibco | 12587-010 | |
B27 supplement | Gibco | 12580-010 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Cryostat microtome | Leica | CM1950 | |
DMEM/F-12 medium | OmegaScientific | DM25 | |
Epidermal growth factor | PeproTech | 100-15 | |
Fibroblast growth factor-basic | PeproTech | 100-18B | |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
GlutaMax | Thermo | 35050061 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030-149 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
Normal goat serum | Vector Laboratories | Z0325 | |
Nylon membrane (Hybond™-N+ ) | Amersham Biosciences | RPN303B | |
OCT | Leica | 14020108926 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P0899-10 | |
Proteinase K | VVR | 39450-01-6 | |
Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
Triton X-100 | Solarbio | T8210 |
References
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