Summary
Burada, immünororesans boyama ve DNA nokta-leke yöntemleri kullanarak, hücre ve beyin dokularında 5-hidroksimetilitozin tespit etmek için bir protokol salıyoruz.
Abstract
Memeli genomunda birden fazla DNA modifikasyonu tespit edilmiştir. Bunun 5-metilsitozin ve 5-hidroksimetilsitozin aracılı epigenetik mekanizmaları yoğun olarak çalışılmıştır. 5-hidroksimetilsitozin beynin embriyonik ve doğum sonrası gelişimi sırasında dinamik özellikler gösterir, gen ekspresyonunda düzenleyici bir işlev oynar ve birden fazla nörolojik bozukluklar yer almaktadır. Burada, kültürlü hücrelerde ve farenin beyin dokularında 5-hidroksimetilitozini saptamak için immünoresans boyama ve DNA nokta-leke dahil olmak üzere ayrıntılı yöntemleri açıklıyoruz.
Introduction
DNA modifikasyonu, histon modifikasyonu ve RNA modifikasyonu da dahil olmak üzere epigenetik modifikasyonlar, çeşitli biyolojik süreçler vehastalıklardatemel işlevleri oynamak için gösterilmiştir 1,2,3, 4.2.2 , 5.000 , 6.000 , 7. Uzun bir süre için, DNA metilasyon (yani, 5-metisitozin (5-mC)) son derece istikrarlı bir epigenetik belirteç olarak görülüyor ve daha fazla genom değiştirilemez. Son zamanlarda, 5-mC TET1, TET2 ve TET38,9dahil olmak üzere TET (Ten-onbir translokasyonlar) aile proteinleri tarafından 5-hidroksimetilsitozin (5-hmC) oksitlenmiş olabilir bulunmuştur. Daha ileri çalışmalar 5-hmC istikrarlı bir belirteç olarak hizmet verebilir ve gen ekspresyonudüzenleyen4,10,11,12ile biyolojik roller oynayabilir göstermektedir.
Mevcut kanıtlar 5-hmC yüksek memelilerde dokuların diğer türlerine göre nöronal dokularda / hücrelerde zenginleştirilmiş olduğunu göstermektedir, ve nöronal gelişim sırasında dinamik özellikler sergiler13,14. Nöronal sistemde, 5-hmC aracılı epigenetik değişiklikler nöral kök hücrelerin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar, nöronal aktivite, öğrenme ve bellek, ve Rett sendromu dahil olmak üzere birden fazla nörolojik bozukluklar yer almaktadır, otizm, Alzheimer hastalık, Huntington hastalığı, vb2,13,15,16,17,18,19,20.
Hücre ve dokularda 5-hmC tespit etmek için çeşitli yaklaşımlar vardır14,21,22,23,24. Burada, 5-hmC varlığını tespit etmek ve 5-hmC küresel düzeyini ölçmek için iki yöntem açıklar: immünoresans boyama ve DNA nokta-blot. Bu iki yöntem uygun ve duyarlı, ve başarıyla önceki çalışmalarda kullanılmıştır25,26,27,28,29,30. Bu iki yöntemin temel adımları DNA denatürasyonuvardır. 5-hmC immünoresans boyama için 1 M HCl'li numunelerin ön tedavisi gereklidir. 5-hmC nokta-blot için DNA denatürasyonu NaOH çözeltisi ile yapılır. Yeni nesil sıralama ile birlikte bu iki yöntem 5-hmC işlevini araştırmak için çok yararlı araçlardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri Zhejiang Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Yetişkin Nöral Kök Hücre ve Nöronların Kültürü
- Daha önce açıklandığı gibi bir yetişkin (8-10 haftalık) C57/BL6 erkek fare ön beyin yetişkin nöral kök hücreleri izole31,32.
- DMEM/F-12 ortamlarında 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, %2 B27 takviyesi, %1 antibiyotik antimikotik ve %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de 2 mM L-Glutamin içeren yetişkin nöral kök hücreler. Daha önce açıklandığı gibi 1 μM retinoik asit ve 5 μM forskolin ile yetişkin nöral kök hücrelerin farklılaşması nı neden 48 h,32.
- Embriyonik gün 17 nöronlar izole (E17) fare ve kültür hipokampi nörobazal orta içeren 0.25% L-Glutamin, 0.125% GlutaMax ve% 2 B27 ek 5% CO2 kuvöz 37 ° C daha önce açıklandığı gibi33.
2. Farenin Transkardiyal Perfüzyonu
- Deneyden bir gün önce %10 kloral hidrat, %4 paraformaldehit (PFA) ve fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
- Yetişkin bir erkek veya dişi C57 BL/6J fareyi %10 kloral hidrat (50 mg/kg, i.p.) ile anesteize edin ve hayvanın vücut reaksiyonu kontrol edilerek derinden anestezi altında olduğundan emin olun. Plastik bir tahta üzerinde yapışkan bant ile her uzuv düzeltin (bir yüz-up pozisyonda).
- Ameliyat makası ile deri ve sonra kas kesin. Göğüs boşluğunu cerrahi bir makasla açın. Kalbi ortaya çıkar ve sağ atriyumun küçük bir kısmını ince bir cerrahi makasla kes.
- Fareyi sol ventrikülden 10 mL tek kullanımlık sterilize şırınga ile soğuk PBS (yetişkin fare başına yaklaşık 30 mL) ile perfüzyon.
- Fareyi sert olana kadar %4 PFA (yetişkin fare başına 10 dakikada yaklaşık 30 mL) ile perfüzyon edin.
- Farenin kafatasını kemik çerteleriyle açın. Beyni çıkarın ve 4 °C'de fiksasyon sonrası için 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde %4 PFA'nın 5 mL'sine yerleştirin.
NOT: Ameliyat bittikten sonra cerrahi alanı temizleyin. - En az 24 saat sonra, beyin örneklerini 4 °C'de tam dehidratasyon için %30 sakaroz çözeltisine aktarın.
3. Beyin Kesiti
- Beyin örneklerini en uygun kesme sıcaklık bileşimesini (OCT) küçük bir kapta yerleştirin ve -20 °C'de en az 1 saat soğutun.
- Bir kriyostat mikrotom ile 20-40 μm kalınlığında kesit beyin örnekleri.
- Bölümleri PBS'ye toplayın ve 4 °C'de saklayın.
4. İmmünofluoresan Boyama
- Hedeflenen beyin bölgeleri ile bölümleri almak ve PBS ile 24-iyi plaka içine koyun. Bir kapak üzerinde kültürlü hücreler için, doğrudan adım 4.2 gidin.
- 10 dakika oda sıcaklığında çalkalayıcı üzerinde PBS ile yıkayın.
- PBS'yi çıkarın ve önceden ısıtılmış 1 M HCl ile 37 °C'de 30 dakika tedavi edin.
NOT: 1 mL hidroklorik asit (%36-38) ekleyerek 1 M HCl hazırlayın kimyasal bir başlık içinde su 10 mL içine. 37 °C'de kuvözde 1 M HCl önceden ısıtın. - Örnekleri PBS ile 5 dk boyunca yıkayın.
- Oda sıcaklığında shaker üzerinde % 3 normal keçi serumu ve %0.1 Triton X-100 içeren PBS içeren blok numuneler.
- Shaker üzerinde 4 °C'de bir gecede belirli primer antikorlar içeren kuluçka bölümleri.
NOT: Aşağıdaki primer antikorları kullanın: poliklonal tavşan antikorları anti-5-hidroksimetilsitozin (1:5,000), fare monoklonal antikor anti-NeuN (1:500). - Örnekleri alın ve 1 saat oda sıcaklığında daha fazla kuluçka.
- Numuneleri PBS ile 10 dakika yıkayın.
- Çalkalama da oda sıcaklığında primer antikorlara karşılık gelen ikincil antikorlarla kuluçkaya yatırın. Alüminyum ile plaka kapağı.
NOT: Aşağıdaki ikincil antikorları kullanın: Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG (1:500), Alexa Fluor 568 keçi anti-fare IgG (1:500). 4′-6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) ile karşı leke çekirdekleri. - Numuneleri 10 dakika boyunca PBS ile çalkalayıcıüzerinde yıkayın. Bunu iki kez daha tekrarlayın.
- Slaytların üzerine beyin bölümlerini monte edin, uygun miktarda antifade montaj ortamı (yaklaşık 100-150 μL) ekleyin ve birinci sınıf camla kaplayın. Ojeli fok.
- Düzenli veya konfokal floresan mikroskobu ile fotoğraf çek.
5. Genomik DNA İzolasyon
- Servikal çıkış tarafından yetişkin bir C57 BL/6J fare (erkek veya kadın) ötenazi ve beyin kaldırın.
- Buz soğutmalı bir çanak üzerinde hipokampus, korteks ve beyincik dokuları incelemek. 1 mL DNA lisis tamponunda doku öğütücü ile dokuları öğütün ve temiz mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 600 μL lysis tampon başına 250 μg proteinaz K ekleyin. Hücre peletleri için, doğrudan lysis tampon ekleyin, proteinaz K, ve iyice karıştırın.
NOT: DNA lysis tamponu hazırlayın: 5 mM EDTA, %0.2 SDS, 100 mM Tris-HCl'de 200 mM NaCl, pH 8.5. Deneyden önce doku öğütücüse otoklavı. - İkinci gün, 37 °C'de en az 12 saat boyunca numune başına yaklaşık 50 μg RNase A ekleyin.
- Fenol eşit hacimli ekleyin:kloroform:isoamyl alkol (25:24:1) ve tamamen karıştırın.
- 15 dakika boyunca 20.817 x g santrifüj ve yeni bir mikrosantrifüj tüp içine supernatant çıkarın.
- DNA'yı çökeltmek için süpernatant'a 600 μL kloroform ekleyin ve iyice karıştırın.
- 15 dakika boyunca 20.817 x g santrifüj ve başka bir yeni tüp içine supernatant çıkarın.
- Supernatant'a 500 μL isopropanol ekleyin ve iyice karıştırın.
- 15 dakika boyunca 20.817 x g santrifüj ve supernatant tamamen çıkarın.
- 1 mL%70 etanol, santrifüj 20.817 x g 1 dk ile yıkayın ve supernatant tamamen çıkarın. Bir kez tekrarlayın.
- DNA peletini tamamen kurutun.
- Tris-HCl tamponu (pH 8.5) ile DNA peletini uygun konsantrasyona kadar çözün.
6. DNA Nokta Blot
- Çözeltileri hazırlayın: 2 M NaOH, Tris-HCl tampon (pH 8.5), 6x tuzlu sodyum sitrat (SSC).
- Örnek karışımı Tablo 1olarak yapın.
- 10 0 0 00 dakika boyunca 100 °C'de DNA örneklerini denatüre edin ve buzüzerinde soğutun.
- Naylon membranın uygun boyutunu kesin (örn. Hybond-N+) ve 6x SSC ile durula.
- Membranı nokta-leke aparatına koyun ve vakum pompasına bağlayın. Membran üzerine nokta başına karışım Nokta 6 μL.
- 80 °C'de 30 dakika hibritleştirin ve tris-tamponlu tuzlu (TBS) içinde yağsız süt ile örnek membran blok 1 saat.
- Bir gecede 4 °C'de birincil antikor ile inkübat.
NOT: Aşağıdaki primer antikor: poliklonal tavşan anti-5-hidroksimetilsitozin (1:5,000). - İkinci gün, numune membranlarını oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca anti-tavşan ikincil antikor (1:5,000) ile membran kuluçka.
- 10 dk. TBS ile yıkayın.
- Kemilüminesans sinyallerini görselleştirin ve sinyal yoğunluklarını ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Erişkin farelerin hipokampusundaki 5-hmC dağılımını ortaya çıkarmak için nöronal hücrelere (NeuN) ve 5-hmC'ye karşı antikorlarla immünorfloresans uyguladık. Hipokampus, 5-hmC nöronal hücre belirteci NeuN ile iyi lokalize (Şekil 1A-H), nöronlarda 5-hmC bir zenginleştirme düşündüren.
Nöronal gelişim sırasında 5-hmC'nin dinamiklerini belirlemek için ilk olarak çoğalan ve farklılaşmış erişkin nöral kök hücrelerden (NSC) izole edilmiş DNA örnekleri ile nokta-blot yapıldı. Nokta-blot sonuçları, NSC'nin farklılaşması sırasında 5-hmC'nin küresel düzeyinin önemli ölçüde arttığını göstermiştir(Şekil 2A-B). Ayrıca, nokta-blot sonuçları nöronlarda 5-hmC düzeyi nin nscs(Şekil 2C-D)daha önemli ölçüde daha yüksek olduğunu gösterdi , nöronal gelişim sırasında dinamik bir 5-hmC değişiklik düşündüren.
Şekil 1: Erişkin farelerin hipokampusunda 5-hmC immünoresans boyama. 5-hmC nöronal hücre belirteci NeuN ile iyi lokalize. Ölçek çubuğu = 100 μm (A-D); 50 μm (E-F). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Erişkin nöral kök hücrelerde ve nöronlarda 5-hmC'nin DNA nokta-leke tespiti. (A) 5-hmC nokta-blot NSC'lerin proliferasyon (Proli) ve farklılaşma (Diffe) koşulları altında. (C) 5-hmC nokta-blot NSCs ve primer nöronlar. Metilen mavisi boyama(B, D)sırasıyla her konsantrasyonda genomik DNA'nın eşit yüklendiğini gösterir (A) ve (C). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| 200 ng/nokta | 400 ng/nokta | 1.000 ng/nokta | |
| Dna | 470 ng | 940 ng | 2.350 ng |
| 2 M NaOH | 2.81 μL | 2.81 μL | 2.81 μL |
| Tris-HCl tampon, pH 7.5 | Hacmi 14,06 μL'ye kadar yapma |
Tablo 1: Nokta-blot için örneklerin hazırlanması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epigenetik modifikasyonlar beyin gelişimi, olgunlaşma ve fonksiyon sırasında önemli roller oynar. DNA modifikasyonu için kararlı bir belirteç olarak, dinamik 5-hmC davranışsal adaptasyon, nöronal aktivite yanıt verir ve pozitif gen ekspresyonu ile ilişkilidir; böylece, beyin ve nörolojik bozukluk4normal fonksiyonu nda yer almaktadır. Hücre ve dokularda işlevini keşfetmek için, 5-hmC varlığını tespit etmek ve tedavi öncesi ve sonrası düzeyini karşılaştırmak için gereklidir. Burada, laboratuvarda ortak ekipmanile yapılabileceği hücre ve dokularda 5-hmC'yi tespit etmek için iki uygun yöntem gösterdik.
5-hmC'yi immünoresans boyama ve DNA nokta-blot ile saptayan anahtar reaktif 5-hmC antikordur. Yöntemde kullanılan 5-hmC antikor yüksek duyarlılık olduğu kanıtlanmıştır ve çok spesifiktir. 5-hmC boyama için, HCl ile DNA denatürasyonu gerektirir. Doku ve hücrelerin HCl ile uygun tedavisi tam DNA denatürasyonu için önemlidir ve sonuçları etkiler. DNA nokta-blot 5-hmC miktarını ölçmek için hassas bir yöntemdir, ve kütle spektroskopiçok daha uygundur. Başarılı bir nokta-blot için DNA örneklerinin zara hassas bir şekilde yayılması gerekir. Ayrıca, metilen mavisi boyama DNA örneklerinin eşit yüklü olup olmadığını belirlemeye yardımcı olur. Not, burada açıklanan yöntemler hücre ve dokuların birden fazla tipte 5-hmC küresel düzeyini tespit. Diğer bazlara göre 5-hmC miktarını ölçmek ve genomdaki dağılım özelliğini ayırt etmek için LC-MS/MS ve yeni nesil sıralama gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Rakip finansal çıkarlar yok.
Acknowledgments
XL kısmen Çin Ulusal Temel Ar-Ge Programı (2017YFE0196600) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 31771395, 31571518) tarafından desteklenmiştir. S.S. Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2017YFC1001703) ve Zhejiang Eyaleti Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2017C03009) tarafından desteklenmiştir. W.X. Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (LY18H020002) ve Zhejiang Eyaleti Bilim Teknolojisi Bölümü (2017C37057) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| Adobe Photoshop software | Adobe Inc. | / | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A11008 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A11001 | |
| anti-5-hydroxymethylcytosine | Active Motif | 39769 | |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| B27 supplement | Gibco | 12587-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 12580-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cryostat microtome | Leica | CM1950 | |
| DMEM/F-12 medium | OmegaScientific | DM25 | |
| Epidermal growth factor | PeproTech | 100-15 | |
| Fibroblast growth factor-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| GlutaMax | Thermo | 35050061 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-149 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | Z0325 | |
| Nylon membrane (Hybond™-N+ ) | Amersham Biosciences | RPN303B | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899-10 | |
| Proteinase K | VVR | 39450-01-6 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8210 |
References
- Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
- Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
- Day, J. J., Sweatt, J. D. DNA methylation and memory formation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).
- Wu, X. J., Zhang, Y. TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond. Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).
- Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. 5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development. Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).
- Li, S., Mason, C. E. The pivotal regulatory landscape of RNA modifications. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).
- Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection. Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- Guo, J. U., et al. Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain. Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).
- Feng, J., et al. Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Geneticset. , Suppl 33. 245-254 (2003).
- Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).
- Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
- Shu, L. Q., et al. Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease. BMC Genomics. 17, (2016).
- Cruvinel, E., et al. Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs. Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).
- Bernstein, A. I., et al. 5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity. Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).
- Wang, F. L., et al. Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).
- Yu, H., et al. Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair. Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).
- Wu, H., Zhang, Y. Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
- Inoue, A., Zhang, Y. Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
- Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
- Ito, S., et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466 (7310), (2010).
- Wang, T., et al. Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum. Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).
- Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
- Wang, T., et al. Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency. Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).
- Li, X., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, 15903 (2017).
- Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).
- Tao, H., et al. The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).
- Li, X. K., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, (2017).
- Li, X., et al. Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
