Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ליבה/פגז הדפסה פיגומים קפלים להנדסת רקמות של מבנים צינורי

Published: September 27, 2019 doi: 10.3791/59951
Automatic Translation
1, 1,2, 2, 2, 1, 1, 1,3
1Institute of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, University of Maribor, 2Institute for Development of Advanced Applied Systems (IRNAS), 3Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, University of Maribor

Summary

מוצג כאן הוא פשוט לשימוש, ליבה/פגז, תלת מימדי ביוריטינג הגדרת עבור הייצור צעד אחד של הפיגומים החלול, מתאים הנדסת רקמות של כלי דם ומבנים צינורי אחרים.

Abstract

הדפסה תלת ממדית (3D) של חוטי ליבה/פגז מאפשרת ייצור ישיר של מבני הערוץ עם פגז יציב כי הוא מקושר בממשק עם ליבה נוזלית. האחרון מוסר לאחר ההדפסה, משאיר מאחורי צינור חלול. שילוב טכניקת ייצור מוספים (כמו האחד שמתואר כאן עם צבעי הדפוס [ביו] הדיו, אשר מבנית וביוכימית לחקות את מטריצה החילוץ יליד [ECM]) הוא צעד חשוב לקראת הנדסת רקמות מתקדמות. עם זאת, ייצור מדויק של מבנים מוגדרים היטב דורש אסטרטגיות ייצור מותאמות אופטימיזציה עבור החומר בשימוש. לכן, הגיוני להתחיל בהגדרה הניתנת להתאמה אישית, פשוטה לשימוש ותואמת לספקטרום רחב של חומרים ויישומים. עבודה זו מציגה קל לייצר ליבה/פגז מעטפת עם-luer-תאימות לחקור ליבה/פגז הדפסה של מבנים ערימת העצים, נבדק עם מוגדר היטב, alginate מבוסס הגרדום החומר הפיגומים ניסוח.

Introduction

ניתן לטעון, המטרה האולטימטיבית של הנדסת רקמות (TE) היא לייצר רקמות פונקציונלי או איברים בתחום החוץ, אשר יכול לשמש להתחדש או להחליף חלקים פצועים או נגועים של גוף האדם1,2,3. מחקר נוכחי בהנדסת רקמות (TE) מתמקד בהיבטים בודדים של התחום (חומרי פיגומים, תהליכי ייצור, מקורות תאים וכו '). 4,5, כמו גם פיתוח פשוט מודלים מחוץ גופית של רקמות ואיברים המחקים היבטים בסיסיים של שלהם vivo עמיתיהם. מודלים כאלה הם כבר שימושיים עבור יישומים רבים, כגון הקרנת סמים ולימודי רעילות, במיוחד במקרים שבהם התרבויות הקונבנציונליות של תא 2d אינן מחקות את התגובות הדינמיות של רקמות מקוריות6,7, 8,9. תלת מימדי במודלים של מבחנה בנויים בדרך כלל על ידי שילוב תאים10, פיזיקאלית-כימיים סימנים11, ו פעילים ביולוגית מולקולות12,13 על הפיגומים, אשר מתקבלים מ decellularized רקמות או בנוי דה נובו מחומרים ביולוגיים או ביותואמים14,15,16,17,18.

זה חיוני כי הפיגומים מקפלים את המיקרוארכיטקטורה תלת-ממדית מורכבת ומבנה הירארכי של רקמות יליד כדי לאפשר פונקציונליות של רקמות הנדסה, נציג של vivo רקמות19. למרות ההתקדמות הטכנולוגית המשמעותית ב-TE, התפתחות המבנה הרלבנטי לרקמות מלאכותיות, נותרה אתגר. רקמות עבות (> 200 יקרומטר עובי) הם בעייתיים במיוחד, בשל מגבלות כגון חמצן ו דיפוזיה מזינים20. ההתקדמות לכיוון מבנים רקמות גדול נעשה; עם זאת, הקירבה הגבוהה הנדרשת של תאים לכלי הדם כדי להעביר חמצן וחומרים מזינים ולקדם את הסרת הפסולת חייב להיות לכידה. Vascularization של רקמות (או לחילופין, ייצור של המחוברים ביניהם ברשתות כלי דם תלת-ממד בתוך מבנים רקמות) ממלא תפקיד קריטי בשמירה על הכדאיות של התא וקידום פונקציות של רקמות הנדסה חוץ גופית, אשר קשה יותר עבור מודלים בניסויים ממושכים21,22. יתרה מזאת, הרזולוציה הנדרשת, השלמות המבנית והתאימות הביובזמנית טרם הושגה23.

כמה גישות TE הוצעו בניסיון לבנות כלי דם כמו מבנים ולאפשר vascularization בתוך מבחנה. דוגמאות מסוימות כוללות שימוש בתאי האנתל (גם שיתוף תרבותי עם סוגי תאים אחרים כגון פיברותקיעות) שלהרכיב את העצמי כדי ליצור רשתות מיקרוכלי דם24, השימוש בתאי כלי דם ובקרום הלב המעודדים תא אנדותל צמיחה21,25, המסירה של גורמי גדילה אנגיוגנטיים לגרום vascularization20,26, באמצעות הטכנולוגיה גיליון תא המאפשר שליטה על בשכבות כלי דם20, וייצור של מבנים נקבובי מאוד הגרדום המעודדים אנגיוגנזה27. הגישות הנזכרות מתמקדות בהאנצימות האנגיוגנזה, הדורשות בדרך כלל כמויות גדולות של גורמי גדילה נוספים (למשל, "ה-") והזמן ליצור. עם זאת, החסרונות הגדולים ביותר הם שלהם שלהם מוגבלת מחדש ושליטה מרחבית מוגבלת על הפרנינג כלי דם, וכתוצאה מכך בדרך כלל התפלגות ואצלב אקראי בתוך המבנה רקמות כי לא בהכרח להקל perfusion.

ייצור מוספים (AM, כגון ביוריטינג תלת-ממדי) מעורב יותר ויותר בייצור של בנייה תלת-ממדית בחומרים ביולוגיים או ביו-תואמים ליצירת פיגומים המתאימים ל-TE. מספר גישות ב-AM משמשות ומפותחות במקביל (לדוגמה, שיטות המבוססות על הזרקת דיו ומיקרושחול, סוגים שונים של טכניקות ליטוגרפיות) להפקת פיגומים המחקים רקמות מקוריות בארכיטקטורה שלהם, ביוכימיה ופונקציונליות . הטכניקות הבודדות מפגינות יתרונות וחסרונות מסוימים28, ולכן שינויים שונים מתבצע בחקר (לדוגמה, מיקרו-מגבר, אנגיוגנזה, המושרה וכדומה) כדי להגדיל את המידה שבה כלי דם גדולים, מורכבים ויציבים רשתות יכול להיות מפוברק22,29,30.

בין אלה, ביוסטרוטינג שחול היא השיטה הנפוצה ביותר, במיוחד בשל המגוון הרחב של חומרים תואמים (תהליך בדרך כלל ידידותית לתא28,31,32) וכן רב-תכליתיות יוצאת דופן ב תנאי היישום (למשל, הדפסה מוטבעת והקרבה23,33, ייצור של מבנים חלול34,35, וכו '). האתגרים העיקריים מראש מחקרים הנוכחי כוללים את העברת מ 2D כדי 3D מבנים, היווצרות של רשת צפופה של צינורות חלול עם רזולוציה מרחבית גבוהה, ושלמות מכנית הכולל נאמנות הצורה במהלך זרימת הנוזלים בתרבות התא תנאים30.

הגישה הפשוטה ביותר לרקמת מעשה היא הייצור של רשת ערוצים מחוברים בתוך המבנה. היווצרות של ערוצים כאלה בתוך הפיגום רקמות צפוי לפתור רבות של בעיות הנ ל, כפי שהיא מאפשרת באופן מיידי דיפוזיה מזינים וחמצן תוך הסרת מוצרי פסולת. לכן, היווצרות הפוטנציאל של אזורים נקרופטיים בתוך המבנה הוא נמנע36. ערוצים כאלה עשויים בנוסף להיות הזרע עם תאי האנדותל (ECs) ולשמש כלי דם מלאכותיים בדגמי רקמה תלת-ממדית37. במובן היסודי ביותר, כלי קיבול יכול להכיל ערוץ חלול, שכבה רכה של ECs, ומעטפת נוקשה. לאחרונה, 3d ההבלטה של שני חומרים שונים באופנה הליבה/פגז ניצול מחטים שכונתיות עבור שחול צברה הרבה עניין38,39,40,41, כפי שהוא מאפשר ייצור של צינורות חלול.

בדומה הדפסה מיקרו תלת-ממד קונבנציונאלי, הדפסה ליבה/פגז מבוצעת עם זרבובית שכונתיות (למשל, שתי מחטים עם קטרים שונים מיושרים על אותו ציר באופן, כך המחט הרחבה תוחם את האחד הצר). לפיכך, ניתן להגבר שני חומרים בו, כאשר האחד הוא החוט המרכזי או הגרעין הפנימי ושנית "המעטפת" החיצונית41. עד כה, שיתוף ביובריטינג מנוצל להרכיבו מבנים עם מוצק42, ליבה/פגז43, ו קווצות חלול40,44; עם זאת, החומרים בהם נעשה שימוש לא היו ממוטבים הן לכדאיות מיטבית של תאים והן לחוסן מכני של המבנים המודפסים. כפי שהוזכר, הטכניקה מספקת את האפשרות לשלב מאפיינים מכניים שונים עם תכונות מכניות שונות, בהן התפר תומך באחד הרך יותר. חשוב יותר, אם חומר הגרדום (למשל, alginate, carboxyמתיל תאית) הוא הבלטת כמו המעטפת, בעוד הליבה המורכבת של החוצה המקשר סוכן (למשל, סידן כלוריד) הוא ויתרו מן הנימים הפנימיים ולאחר מכן שטף הדפסה לאחר, זה ניתן להמציא צינורית חלולה רציפה בצעד אחד45.

עם זאת בראש, שיטת צעד אחד פשוט ומלא מחזור פותחה כדי לבנות פיגומים מוגדרים היטב ומאפשר להנדסה של מבני כלי דם ורקמות הכרישים אחרים. כדי לפתח טכנולוגיה חסכונית, הייצור צריך להיות באופן אידיאלי תהליך של צעד אחד. לכן, הגדרת ליבה/פגז היה מותאם ומשולב לתוך הביוריקטר 3D. העיצוב הבסיסי מורכב זרבובית מרכזית עשוי מתכת כדי למנוע דפורמציה במהלך ההזרקה, סביבו זרבובית השני של קוטר גדול ממוקם. הגדרת זרבובית שכונתיות מאפשרת שיתוף משותף של שני הזרמים וקישור מיידי המקשר בין ערוץ ההידרוג'ל ההבלטה. זה מאפשר הייצור הישיר של חוטים שכבתית מרובת שכבות, בעוד החוצה בעקבות קישורים עם ריכוזים גבוהים יותר של סידן כלוריד (CaCl2) להבטיח ייצוב קבוע יותר מבחוץ.

בתור שכזה, שיטה זו מאפשרת הדפסה בו של הפיגומים ומיקרוערוצים, שבהם משמש ההידרוג'ל החלול כפיגום לתמיכה בשלמות המכנית של בנייה תלת-ממדית ובמקביל לפעול כמיקרוערוצים מוכללים כדי לספק חומרים מזינים לצמיחת תאים. פרוטוקול זה מספק הליך מפורט של האסטרטגיה ליבה/פגז תלת-ממד ביוריטינג מבוסס על שימוש של זרבובית מותאמת אישית שכונתיות, שבו מבנים תלת-ממד הידרוג'ל עם ערוצים מוכללים מיוצרים על ידי שליטה חוצה קישור לייצר חוטים חלול, שנותרו במהלך התרבות התאית.

הגדרת ההדפסה התלת-ממדית המשמשת בעבודה זו מוגדרת כפי שתוארה בעבר באמצעות בננוביץ ' ו-vihar46 וניתן לחלק אותם לשלושה רכיבים עיקריים: a) שלושה צירים מכניים CNC הגדר עם 50 יקרומטר מיקום הדיוק בכיוונים X, Y ו-Z; ב) שני מתקני הבלטת ממד, המותאמים לשימוש חד-פעמי, 5 מ ל-נעל מזרקים, עם רזולוציה של 1.2 μL voxel; ו-C) שליטה באלקטרוניקה ובתוכנה.

כדי להקל על הדפסת ליבה/פגז, פותחה זרבובית מתאימה שניתן לרכוב על אחד מהמעטפת (מכבש ראשי, הדפסת הליבה) והיא תואמת G27 בוטה-קצה מחטים. יש לו גם תאימות נעילת luer כדי להתחבר עם המעטפת השנייה (הדפסת מעטפת). אבי הטיפוס הראשונים הפוברק על ידי החדרת מחט G27 קהה (בקוטר הפנימי = 210 μm, בקוטר החיצוני = 410 μm) לתוך מחט G21 (בקוטר הפנימי = 510 μm, בקוטר החיצוני = 820 μm) או G20 חרוט (בקוטר הפנימי = 600 μm), ולאחר מכן הוספת n משנית eedle לספק את חומר המעטפת. עם זאת, בשל כיפוף קל של פיר המחט, לא ניתן לייצר קצה זרבובית עם יישור קונצנטריים של המחטים הפנימיים והחיצוניים.

כדי לפתור בעיה זו, המציאו עיצוב חרירים חדש שמילא את הקריטריונים הבאים: 1) ניתן לייצר אותו באמצעות טחנת CNC בת 3 צירים, 2) היא עשויה להתבצע מחומרים שונים (פלסטיקה בעלי ביצועים גבוהים, כגון הצצה או מתכות), 3) יש לו תאימות לנעילת המנעול עבור החלת חומר מעטפת, ו 4) תואם מחט G27 בוטה ומחזיקה אותו במקום בשני מיקומים כדי ליישר את הקצה עם הציר המרכזי. תרשים של אב-טיפוס של החרירים מוצג באיור 1.

Protocol

1. הכנת מוצרים הידרוג'לים ופתרונות מקושרים

  1. בקצרה, על ידי ערבוב במרץ, לפזר ALG ו CMC אבקות במים אולטרה טהורים כדי לקבל סך 3 wt% ALG ו 3 wt% CMC פתרון.
    הערה: בעבודה זו, 5 מזרקים mL משמשים להדפסה; לפיכך, כמות החומר הסופית מותאמת לאותו אמצעי אחסון. עם זאת, עבור מחסניות שחול אחרות וגדלים לדוגמה מודפסים, יש לשנות את גודל החומר המוכן בהתאם.
  2. הוסף 1.5 wt x תאית nanofibers לתערובת ALG-CMC עבור חיזוק מכני נוסף כדי להגיע צמיגות הרצויה, מתאים להדפסה.
  3. מתפרעים הבולם ההידרוג'ל עד הומוגנית באמצעות מערבל תקורה.
    הערה: אין להציג סיבים או בועות בהידרוג'ל.
  4. הכינו 10 מ ל של 100 מילימטר סידן כלוריד (CaCl2) הפתרון במים טהורים במיוחד, המשמש כפתרון החוצה העיקרי המקשר להדפסה.
  5. הכן 10 מ ל 5 wt .% CaCl2 פתרון במים טהורים במיוחד, המשמש כפתרון חוצה-קישורים משני בעיבוד של הפיגומים.
    הערה: בדרך כלל, כל הניסוחים הידרוג'ל, אשר מתאימים מיידית החוצה קישור כימי, לאפשר ייצור של צעד אחד של צינורות חלול ניתן להשתמש עם סוג זה של ליבה/פגז הגדרת. מנגנוני ההדפסה והקישור החוצה צריכים להיות ממוטבים בהתאם. צמיגות של ההידרוג'ל תשתנה בהתאם לקומפוזיציה הרצויה; עם זאת, זה יכול להיות מותאם עם ריכוזי פולימר ותוספת של חומרים עיבוי (למשל, ננוסיבים). צמיגות אידיאלית עבור הדפסה תלת-ממד של מבנים יציבים הוא גבוה מספיק את החוט הנמתח כדי לשמור על צורתו ועל הפיגום להחזיק משקל משלה לפני הקישור החוצה.

2. ליבה/פגז הדפסה של מבשם פיגומים

  1. לפני ההדפסה, לחטא את הביוריקטר על ידי ריסוס 70% אתנול ביסודיות ולחשוף אותו לאור UV עבור 1 h.
  2. הפעל את הביופוטטר והפעל את התוכנה השולטת, המגיעה בצרור עם המדפסת התלת-ממדית.
  3. בצע את הליך הביות על-ידי לחיצה על סמל הבית .
  4. שימוש בקובץ הפקודה של סרגל הכלים | יבא קוד G, לייבא את הגרדום שנוצר g-קוד.
  5. העבר את ההידרוג'ל למזרק של 5 מ ל סטרילי ומניחים אותו באחד הטעינות של המדפסת התלת-ממדית. באמצעות מנעול המנעול וצינור קצר, לחבר אותו לקלט מצח בצד של זרבובית הליבה/פגז.
  6. להעביר את הפתרון חוצה קישור (100 mM CaCl2) אחר סטרילי 5 mL מזרק עם המחט G27 קהה-end מצורף ולהכניס אותו לתוך מחזיק המחט העליון של זרבובית הליבה/פגז. המחט הפנימי צריך מעט בולטות (~ 1 מ"מ) מן הליבה החיצונית/זרבובית המעטפת. כוונן את היישור באופן ידני. הכנס את המזרק השני לתוך הר ההבלטה.
  7. כדי להכניס כראוי את המוזרקים לתוך הטעינות (ההגדרה המוצגת באיור 2), שלוט באופן ידני בטעינות ההבלטה על-ידי לחיצה על החצים A ו-B ולמעלה ולמטה .
  8. לפני תחילת ההדפסה, הבלטת ההידרוג'ל בנפרד והפתרון החוצה המקשר כדי לנקות את כל בועות האוויר העודפות בזרבובית הליבה/פגז ולהבטיח זרימת הידרוג'ל רציפה.
  9. באמצעות החצים Z ולמעלה ולמטה , התאם ידנית את המרחק בין החרירים לבין מצע ההדפסה. מומלץ להשתמש שטוח, הדפסה זכוכית המצע, אשר יש הדבקה טובה. הזרבובית ההבלטה לא צריכה להיות בקשר עם המצע כדי לאפשר זרימה רציפה של ההידרוג'ל. המרחק האופטימלי בין החרירים לבין המצע (גובה השכבה) זהה בדרך כלל לרוחב של קוטר הזרבובית החיצוני, אך הוא מכוונן את החומר המשמש ופרמטרי הדפסה נפרדים. התאימו את גובה ההדפסה ההתחלתי בהתאם לצרכים הפרטניים.
  10. לחץ על לחצן ההפעלה כדי להתחיל את תהליך ההדפסה.
    הערה: מומלץ לכלול את ההדפסה של חצאית (איור 3) סביב הפיגום כדי להבטיח את הנחת החוט האחיד החלול לפני שהדפסת הגרדום בפועל מתחילה. כדי להשיג זרימה אופטימלית הידרוג'ל עם כוונה להדפיס מקפלים פיגומים אופטימלית, לשנות את הקומפוזיציה ניסוח, חוצה קישור הרכב הפתרון, ופרמטרים הדפסה (כלומר, מהירות ההדפסה, לחץ ההבלטה, טמפרטורת ההדפסה, מרחק בין ה מצע ו זרבובית ההבלטה, וכו ').
  11. לאחר ההדפסה, הסר בזהירות את המצע עם הפיגום המודפס ויוצקים את הפתרון הצולב המשני (5 wt .% CaCl2) על הפיגומים כולו כדי להבטיח את ההצמדה המקושרת על הגרדום כולו. מודטה עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    הערה: ודא שהפיגום כולו שקוע בתוך התמיסה המקושרת בין קישורים. שלב זה חיוני להשגת תכונות כוח מסוימות של הפיגום, אך ישתנו בהתאם לחומר ולשיטת הקישור החוצה שבשימוש.
  12. באמצעות אזמל לחתוך ידנית את החומר עודף חצאית.
  13. מעקר את הפיגומים תחת אור אולטרא סגול במשך 30 דקות. הפוך בזהירות את הפיגום וחזור על תהליך העיקור.
  14. נתק בזהירות את הפיגום מהמצע על ידי משיכת הצידה בעדינות. אם הפיגום מחזק את המצע, הפרד אותו על-ידי הוספת קצה חד ביניהם.
  15. העבר את הפיגום לתוך מדיה תרבותית של תאים ללא צבע (DMEM שיושלם עם 5 wt .% FBS, 100 U/mL פניצילין ו 1 מ"ג/mL סטרפטומיצין), ו דגירה אותם ב 37 ° c באווירה המכילה 5 wt .% CO2 עבור לפחות 24 h.

3. הכנת תאי האנדותל ופתרון שיטת החיים/המוות

  1. עבור תא culturing, להכין את המדיה המתקדמת של התרבות התאית DMEM עם הוסיף פנול אדום ולהוסיף אותו עם 5 wt .% FBS ו-2 מ"מ L-גלוטמין. הוסף 100 U/mL פניצילין 1 mg/mL סטרפטומיצין.
  2. הפעל את תא הטבור האנושי (HUVEC) קו ומעבר אותם בהתאם לפרוטוקולים HUVEC culturing כמתואר47.
    הערה: מומלץ להתרבות בין התאים במדיית התרבות התאית לבין הוספת פנול בצבע אדום להדמיה פשוטה במהלך הזרקת התאים לתוך הכיסויים הלבנים השקופים כמתואר להלן.
  3. עבור ספירת תאים, פיפטה 100 μL של תאים הושעו במדיה של תרבות התא ולהכתים אותם עם 900 μL של 0.1 wt .% טרימין כחול פתרון.
  4. השתמש במונה תאים אוטומטיים או בפעולת השהיה ידנית כדי לספור ולהשיג את המספר המשוער של תאים בהשעיה.
  5. עבור שיטת חי/מת, להכין פתרון של 4 מ"מ Calcein-AM ו 2 מ"מ propidium יודיד ב-PBS סטרילי.
    הערה: הפתרון החי/מת צריך להיות מוכן ישירות לפני ניהול התשובה.

4. העברת תאים לפיגומים

  1. הסירו את הפיגומים ממדיית התרבות התאית והעבירו אותם לצלוחית זכוכית גדולה מספיק.
  2. מיד לפני הזרקת התאים לתוך הפיגומים, הנתק את HUVECs מן מבחנות באמצעות הטיפול על ידי 0.25 wt .% טריפסין.
    1. בקצרה, להיפטר מדיה תרבות התא ו מודחלת את התאים עם 0.25 wt .% טריפסין (~ 2 mL) עבור 5 דקות ב 37 ° c.
    2. לאחר הדגירה להוסיף ~ 3 מ ל של מדיה תרבות התא לתאי טריזיזציה ולהעביר את כל התאים המנותקים צינור צנטריפוגה.
    3. צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 5 דקות ולהיפטר supernatant.
    4. השהה מחדש את התאים במדיה של תרבות התא הטרייה.
  3. ספור את התאים כפי שמתואר קודם לכן. כוונן את הריכוז הכולל של התא בהתאם לצרכים הבודדים. בעבודה זו, נעשה שימוש בריכוז התחלתי של 340,000 תאים/mL.
  4. השהה מחדש את התאים במזרק סטרילי עם מחט G27 קהה מחוברת.
  5. מצא נקודת כניסה והתחל הזרקת תאים בזהירות לתוך הפיגומים. יש לראות את זרימת ההשעיה של התא דרך פיגום שקוף. ודא שהפיגום כולו יתמלא בהשעיה של התאים.
  6. יש לטבול את הפיגומים במדיית התרבות התאית ולהדגירה ב-37 ° c באווירה המכילה 5 wt .% CO2 למשך עד 10 ימים.
  7. לחדש את המדיה של תרבות התא על פי הצרכים הניסיוניים.

5. חיים/שיטת מוות והדמיה של תאים

  1. לאחר דגירה, לשטוף את הפיגומים עם הPBS.
  2. עם מחט קהה-end, להזריק בזהירות את הפתרון החי/מת הקודם שהוכן (4 מ"מ calcein-AM ו 2 מ"מ propidium יודיד ב-PBS) לתוך הפיגומים והדגירה אותם ב-PBS עבור 30 דקות ב 37 ° c. ודא שהפתרון זורם לאורך כל הגרדום.
  3. שטפו את הפיגומים עם הPBS.
  4. העבר בזהירות את הפיגומים למגלכי זכוכית.
  5. שימו לב לתאים הצבועים ישירות בתוך הפיגומים שמתחת למיקרוסקופ הזריחה.
    הערה: תאים קיימא לייצר פלואורסצנטית ירוק ותאים מתים פולטים אור זריחה אדומה.

Representative Results

מטרת העבודה הזאת הייתה לפתח ליבה קלה לייצור/זרבובית עם לואר-תאימות עבור הדפסת ליבה/מעטפת של מבנים ערימת העצים. כמו-כן, תוארה פרוטוקול הדפסה חד-שלבים ישיר ומנוהל, שהוא פשוט לשנות ולהכיל מגוון רחב של חומרים ומנגנונים כימיים שונים המקשרים ביניהם לבניית פיגומים מוגדרים היטב ומכנידים ל הנדסה של כלי דם ומבנים אחרים רקמות הכרישים.

זרבובית ליבה/פגז
הזרבובית מורכבת ממחט G27 קהה (להדפסת הפילמנט הפנימי) וגוף החרירים, המחזיק במחט במקומה ויוצר זרבובית חיצונית לחוט הלהט של המעטפת עם יציאת חיבור לקלט חומרי. תרשים מוצג באיור 1. שני 5 מזרקים mL, אשר ממוקמים לתוך הבלטת מכבש הפרט ולספק את הליבה ואת חומרי פגז. אבובים מחבר את גוף הזרבובית עם המזרק, ומספק את חומר המעטפת.

ההרכבה המלאה של זרבובית הליבה/מעטפת והגדרת המזרק מוצגת באיור 2. אב-הטיפוס הפונקציונלי הראשון של גוף הזרבובית יוצרו על ידי CNC הטחינה בלוק של polyoxymethylene (פום). תאימות ואטימה בין האלמנט, מחט G27 ואבובים נבדק על ידי התקנת ויטאפריל. אין דליפה של חומר המעטפת נצפתה בזרבובית, מחבר luer-lock, או בין גוף ומחט. גוף החרירים מתאים בחוזקה לרכזת המחט (מחבר luer), ומבטיח תנועה מסונכרנת של הזרבובית כולה עם הבלטת ממד.

בניין גרדום
הגישה הישירה ביותר לבדיית הפיגומים היא על-ידי שכבת הפקדת חומרים על-ידי שכבה שבה כיוון ההדפסה משתנה בכל שכבה עוקבת, בדרך כלל בזווית של 90 °. בשל מאפייני visco אלסטי והידרוסקופי של ההידרוג, שמירה על נאמנות הצורה של המבנים המודפסים נשאר מאתגרת. המטרה העיקרית של סעיף זה הפרוטוקול הוא הדפסה תלת-ממדית של ליבת מבשם/פגז פיגומים באמצעות שני פולימרים, אשר הראו בעבר תוצאות מבטיחות עבור הגרדום בניין (ALG ו CMC) עם תוספת של ננו סיבי תאית (NFC) עבור הגדלת יציבות מכנית. שני alg ו CMC הם טעונים שלילית, מסיסים במים סופולימרים ליניאריים48 ושניהם מכילים קבוצות קרבוקסילי, אשר יכול להיות מקושרת באמצעות תוספת של הקטנים של דידיונטי. Ca2 + חלקיקים טופס קשרים יוניים עם שתי קבוצות פונקציונליות בו זמנית, יוצרים קשרים בין שרשראות פולימר, הגדלת קשיחות ג'ל.

הדפסת מבשם פיגומים
המטרה של תהליך זה היא 3D-להדפיס מבנים פשוטים ערימת הפיגום, אשר המשתרעים על פני מספר שכבות ולשמור על נאמנות הצורה שלהם, כמו גם מבשם עד להיות מקושרות באופן מלא. זה דורש אפילו הבלטה של הליבה ומעטפת ללא תנועות מוצלב או נסיגה, אשר יכול לקטוע את הזרימה. לכן, דגמי CAD טיפוסיים ושיטות פריסה מתאימים פחות. בעבודה זו, מעוצב באופן ידני g-code משמש, וגנרטור פיתון מבוססי g-קוד פותחה עבור הכנה מהירה g-code.

הפיגומים נבנו בצורת רשת של ערימת עצים ונבנתה על משטח זכוכית שטוח. הייצור בוצע שכבה-על-ידי-שכבה, הפקדת קווי המעבר של כל שכבה להצליח זווית 90 ° עד הקודם. בנוסף, כל שכבה מצליחה היתה 2% צרה יותר בכיוונים X ו-Y ומבטיחים תמיכת פילמנט רציפה על-ידי שכבות קודמות. המרחק בין הסיבים (גודל המקריפור) יכול להיות מעוצב בדיוק בקוד-g על-ידי לקיחת בחשבון את הקוטר החיצוני של הפילמנט (0.8 מ"מ) ואת המרחק בין קווי רשת (3 מ"מ).

הפיגומים נדרשו למלא קריטריונים לכלילה מרכזיים לצורך שיקול נוסף. ראשית, הפיגומים עם לפחות 4 שכבות בגובה נדרשו כדי לשמור על שלמות מבנית וגיאומטריה (למשל, גודל macropore) במהלך ההדפסה, כדי להיות זכאי לפיתוח נוסף. שנית, הפיגומים הדרושים כדי להישאר מוקבל (מיקרוערוצים יציבים) גם לאחר שעברו שבעה ימים במדיית התרבות התאית ב-37 ° c. במרווחי זמן מתאימים (1, 2, 5, ו -7 ימים) השתלטו הפיגומים מתוך מדיית התרבות ונבדקו כדי לבדוק אם הם עדיין ממשיכים לעשות זאת. באיור 4A, החתך הרוחב של הפיגום המודפס והמעובד לאחר העיבוד מציג ערוץ חלול ברור לעין בתוך החוט. באיור 4B, ברור כי גם אחרי 72 h דגירה במדיה של תרבות התא ב 37 ° c, החוט שומר על המבנה החלול דרך אורך הגרדום כולו.

כמה ניסוחים הודפסו, נותרו יציבים בצורה מבנית, שמרו את הגיאומטריה המודפסת, ונשארו מודבל; עם זאת, אחד בודד נבחר לבדיקה נוספת (כלומר, 3 wt .% ALG + 3 wt .% CMC + 1.5 wt .% NFC), אשר איפשר הדפסה של פיגומים עם מבשם של עד 10 שכבות. תהליך ההדפסה עם הזרבובית המותאמת אישית מוצג באיור 5A. הדפסה ליבה/פגז התאפשר עם ניסוחים פחות צמיגה; עם זאת, ג ' לים עם ריכוזים גבוהים לא אפשרו זרימה רציפה דרך הזרבובית. עבור קישור החוצה העיקרי (חומר ליבה, נמסר במהלך ההדפסה) 100 mM CaCl2 היה מנוצל, אשר ייצוב כראוי את היווצרות רציפה של חוט חלול, ללא גרימת מיצוק ג'ל בתוך הזרבובית. לאחר ההדפסה, הפיגומים היו ספוגים ב 5 wt .% CaCl2 פתרון כדי להצליב לחלוטין את ההידרוג'ל לאיכות הצורה לטווח ארוך. דוגמת הגרדום המוגמר מתואר באיור 5B. במהלך האופטימיזציה, תהליך הניסוח השתמש בצבע מלאכותי בפתרון הליבה, כדי לאפשר הערכה חזותית ולבחון את איכות החוט הנמתח. הצבע לא שימש לייצור הפיגומים הסופיים, שהוכנו לזריעת תאים וטיפוח.

שיטת חי/מת
לאחר הדגירה, שימש שיטת חיים/מת כדי להמחיש את ECs ולהבדיל בין החיים (ירוק) לבין התאים המתים (אדום) בתוך הגרדום המבצגר. הדבר שימש שתי מטרות עיקריות: A) כדי לקבוע אם הפיגומים מספקים סביבה ביולוגית לקידום הצמיחה והדבקה מבלי להציג השפעות מזיקות על התא, ו-B) כדי להמחיש את השלמות המבנית של מבני הכרישים וה מערכת הערוץ הפנימי ביתר פירוט.

תוצאות השיטת החי/מת מוצגות באיור 6. בנוכחות של מוחק תאיים, קרום פלזמה חדיר Calcein-AM מומר Calcein, פליטת אור זריחה ירוק בתאים חיים. מצד שני, תאים אפוטוטיים הם דמיינו על ידי propidium יודיד ממברנה, אשר זוהר באדום כאשר אתונה ב-DNA סליל כפול. תמונות חיות/מתות ותמונות שדה בהיר של הפיגומים שולבו כדי לעזור להמחיש את התאים בתוך הערוצים החלולים. פתרון הצביעת הוזרק, והתשובה שבוצעה ישירות בתלת-ממד המודפס פיגומים לאחר הדגירה של תא הגרדום עבור 48 h.

יצוין כי צפיפות הזריעה קטן יחסית של ECs היה בשימוש (340,000 תאים/mL), כמו מחקר זה שימש רק הוכחה של קונספט עבור הדפסה ליבה/פגז של החומר פיגומים. המסקנה המשמעותית ביותר של שיטת החיים/המת היא שאפילו לאחר 48 h, לא נצפו תאים מתים (אדום), המוכיחים כי לא חומר הגרדום עצמו, ולא מוצרי השפלה שלו הציגו אפקטים רעילים. יתרה מזאת, ה-ECs אכן נצמד ונשארו מחוברים בתוך הפיגומים ודומה שהוא גדל בתוך התעלות בצורה שווה. זה מרמז על שיטת הייצור המתוארת וניסוח הפיגום מספקים מסגרת מתאימה לבנייה בvivo, רלוונטיות, מורפולוגיות רקמה צינורי. מלבד חיקוי של תאים ECM אינטראקציה ותקשורת תא התא הדוק בכל שלושת הממדים המרחבית, הנדסת רקמות מורכבות גם דורש חשיפה תא קבוע למדיום טרי כדי לקיים את הכדאיות שלהם. זה בתורו יכול להיות מושגת על ידי רשת הערוץ צפוף תחת perfusion רציפה, אשר מורה על חקירה נוספת בעבודה העתידית, וידרוש אופטימיזציה של החומרים והצמיחה להקל על הנדסת רקמות ארוכות טווח של ואסילטורה.

Figure 1
איור 1: אב טיפוס של זרבובית ליבה/פגז. (א) העיצוב הכולל והרכיבים העיקריים של אב הטיפוס של גוף החרירים מוצגים. הזרבובית הושלמה על ידי החדרת מחט G27 בוטה בקצה העליון. מחזיקי המחט העליון והתחתון משתק ומיישר את המחט עם ציר החרירים, ומבטיח שהקצה משתרע מהזרבובית דרך המרכז.  כדי לחבר את הזרבובית עם "פגז" הבלטת חומר מן המזרק המשני, אבובים עם מחבר luer מנעול מצורף לקלט לרוחב. מכאן, החומר מועבר אל הזרבובית דרך ערוץ צר. הייצור של הערוץ המוזכר דורש קידוח בשתי תנוחות, הפקת חורים צריך להיות הכתיר לאחר הייצור). (ב) המוצג הוא תקריב של הזרבובית עם מחט G27 מוכנס, המשתרעת מתוך הזרבובית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הגדרת ליבה/פגז סופית. (א) המוצג הוא ליבה הושלמה/מעטפת זרבובית עם מזרקים כראוי המכיל את ההידרוג'ל (מימין), בניית "פגז" ואת הפתרון החוצה קישור (משמאל) כמו "ליבה". (ב) המוצג הוא מערכת הליבה/פגז המותקנת במערכת ויטאפריל עם שני מחזיקי המעטפת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: G-קוד של הגרדום הכרישים. כאן צילום מסך של תוכנת המדפסת מוצג, במיוחד את התצוגה המקדימה של הנתיב (a) ו-g-קוד raw של השכבה הראשונה (ב). קוד ה-g הוא מערכת של הוראות עם קואורדינטות היעד בכיוונים מרחביים מוחלטים (X, Y, Z), כמו גם שחול (A, B) בכיוונים יחסיים. הפקודה G קובעת את סוג ההוראה, בעוד ש-G1 מייצגת תנועה ליניארית לכיוון קואורדינטות היעד וG92 קובעת את מיקום ההתחלה הראשוני. בנוסף, קצב ההזנה של הפקודות הבאות נקבע עם הוראת F ב-mm/min. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: חתך רוחב של פיגום עם פנים חלול. (א) מוצג הפרוסה הצולבת של הפיגום המודפס והמעובד הטרי שלאחר העיבוד. (ב) המוצג הוא הפרוסה חוצה החתך של הפיגום לאחר הדגירה במדיה של תרבות התא עבור 72 h. בעוד שצורת החרירים מגדירה את שחול הצינור בחתך עגול, נראה שהחוט העדין משוטח בהצהרה. אולם, הערוץ הפנימי נשאר שלם ושומר על צורתו במהלך הדגירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: הדפסת ליבה/פגז של הפיגומים. כאן, הייצור (א) של שלושה שכבות פיגום חלול והטופס הסופי שלה (ב) מוצגים. עבור הדמיה משופרת, הפתרון החוצה המקשר בליבת היה מוכתם בצבע אדום. ניסוח מציג יציבות מכנית מספיק כדי לשמור על יציבות הגרדום, גם אם מבנים עבים יותר (עד 10 שכבות, נתונים לא מוצגים) מיוצרים. הממדים החיצוניים של המבנה הסופי היו כ 27 מ"מ x 27 מ"מ x 3.5 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: שיטת החיים/המתים המבוצעת ישירות בתוך הפיגומים. השעיה של HUVECs הוזרק לתוך ערוץ הגרדום הפנימי, מודב עבור 48 h, וטיפל עם צבע חי/מת. HUVECs קיימא פולטים אור זריחה ירוק, אשר מיוצגת בנקודות הבהירות של התמונה. תאים מתים פולטים אור זריחה ירוק; אולם אף אחד מהם אינו גלוי בגרדום הנצפה. חלוקת התאים מרמזת גם על הצורה ויכולות הפרזיה של הערוצים. במידה מסוימת, פתרון העיבוד החי/מת גם מוכתם בחומר הפיגומים, ומייצר אור פלואורסצנטית קל מתחת למיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

עיצוב חרירים
באמצעות הליבה המפותחת/זרבובית מעטפת, משולב לתוך מערכת שני הבלטת ויטראז ', חלול, מקפלים פיגומים צינורי הפוברק בתהליך בודד צעד. כדי להשיג עובי אפילו של הקיר הצינור דרך רוב הפיגומים שהוכנו, המחט צריך להיות ממוקם במיקום מרכזי על ציר של טבעת ההבלטה החיצונית. מחטי מראה סטנדרטיים מציגים לעתים קרובות מוזרות קטנה, אך משמעותית מהציר. לפיכך, גוף הזרבובית תוכנן להחזיק את המחט בשני מקומות, פעם אחת בראש (לתקן את הרכזת) ופעם אחת לפני תא הליבה/פגז הסופי (תיקון הצינורית עצמה), תיקון היישור הצירי שלה. הדיוק של היישור הצירי מגדיל את המרחק בין נקודת הקיבוע. יש, עם זאת, משנה בין אורך המחט לבין נפח תא הזרבובית הזמין. כדי לשפר את הפונקציונליות של הגדרת עוד, ניתן ליישם שינויים מסוימים של הזרבובית: A) הר זרבובית עם יציבות משופרת, B) חרירי נוספות עבור מגוון רחב יותר של תאימות מחט, C) מנגנון התאמה מדויק עבור המחט כדי ל מיצוב חרירים ו-D) שילוב כניסות נוספות והתקני microfluidic לקראת הכנת חומרי הזבוב.

אופטימיזציה של הידרוג'ל
כדי לקבוע את היחס האופטימלי של ALG: CMC, מספר איטראציות על חומרים הוערכו. באופן כללי, הדפסה ליבה/פגז עם ריכוזים מעל 3 wt .% משני המרכיבים ניתנו בלתי אפשריים, משום שהוא לא התיר זרימת הידרוג'ל רציפה או הביא לסתימת הזרבובית. באופן ספציפי, ריכוז ALG מעל 3 wt .% הגביר את צמיגות מוגזמת והביא סתימת חרירים, בעוד ריכוזי ALG נמוך יותר CMC (> 3 wt .%) הואט לאורך הקישורים הצולבים ולכן נכשל לספק מספיק תמיכה מבנית של הגרדום. הדפסה ליבה/פגז התאפשר עם ניסוחים פחות צמיגה; עם זאת, צמיגות ג'ל המובלטת חייב להיות מספיק כדי לקיים אמינות צורה ארוכת טווח. בסופו של דבר, a 1:1 ALG: יחס CMC הוכח להיות הבחירה המתאימה ביותר אשר מאשרת מחקר הקודם על ידי Maver et al.49. התוספת של NFC משופר באופן משמעותי הדפסה וקשיחות מבנית של ליבה/פגז המודפס פיגומים, אך לא היתה השפעה משמעותית על הקישורים החוצה מאפיינים של החומר.

יישומים מותאמים אישית, המותאמים לסוגי תאים ספציפיים ומערכת ניסיונית מחייבים חומרי פיגומים מותאמים היטב, אשר ישתנו באמצעות הרכב ומנגנוני הקישור החוצה. השיטה המתוארת בעבודה זו מבוססת על פתרון פולימר מעורב אלגיאט-תאית, המקושר בצורה מקושרת באמצעות Ca2 + יונים. Alginate עצמו הוא פולימר ליניארי של בלוקים של (1, 4)-β-d-mannuronate (M) ו-α-l-guluronate (G) שאריות שיכול להיות החוצה באופן הפיך הדו באופן מקושר על ידי יישום של Ca2 + ו אחרים דיאותיים כגון Sr2 +, Br2 +, 2 +. עם זאת, היון הנפוץ ביותר עבור הקישור החוצה של קילוף פלסטיצידיות נשאר Ca2 + בצורה של cacl2. Ca2 + יכול לשמש גם בצורה של caso4 או caco3; עם זאת, מסיסות נמוכה של CaSO4 יחסית ל-cacl2 פירושו הגגנציה איטית יותר. CaCO3 תשואות אפילו בזמני הגגנציה איטית יותר אשר יכולים לגרום לתכונות מכניות חלשות ובלתי עקביות.

פעמים הגגנציה ארוכה יותר בדרך כלל לייצר מבנה הומוגנית יותר, עם זאת, יישומים מסוימים, כגון הדפסה ליבה/פגז מחייב שיעורי gelation מהירה50. מ ג2 + יונים גם לגרום לגלציה; עם זאת, היעילות חוצה הקישורים שלהם הוא על 5x-10x נמוך יותר, לעומת Ca2 +, עם הקישורים הצולבים של 2-3 h. בנוסף, יוני מגנזיום הם סלקטיבית יותר כלפי יחידות guluronic, ומכאן החוצה קישור תלוי יותר על ההרכב הכימי של ALG51. במקרה זה, שיעור gelation מהיר חיוני כדי להבטיח מתמשך היווצרות ערוץ חלול לפני המבנה החלול יכול להתמוטט. CaCl2 מניב את שיעור הגלוציה המהיר ביותר, שהוא חיוני להצהרה ישירה של חוטים חלולים. 100 mM CaCl2 היה מנוצל, אשר התייצב כראוי את היווצרות רציפה של חוט חלול מבלי לגרום מיצוק ג'ל בתוך הזרבובית.

הדפסה ועיבוד לאחר הכיסויים של הפיגומים
הצעדים הבאים צריכים להיחשב בחלק זה של התהליך, כולל 1) להבטיח כי כל הפתרונות והחומרים כולל ביוריקטר תלת-ממד הם מעוקרים כראוי לפני ההדפסה. 2) בעת הכנת ההידרוג'ל, הומוגניות של החומר חיונית להדפסה רציפה. הקדמה של זיהומים או בועות אוויר יש להימנע, כפי שהם יכולים לסתום את הזרבובית ו/או לשבש את שחול. 3) המוזרקים צריכים להיות מחוברים כראוי לזרבובית הליבה/פגז באמצעות מנגנון ה-luer-lock והוכנס כראוי לתוך המעטפת המרכזית כפי שניתן לראות באיור 2A, B. 4) לפני הדפסת מבנה מורכב, מומלץ ליצור מראש חלק קטן מהג'ל והפתרון החוצה, כדי לנקות את בועות האוויר העודפות בזרבובית הליבה/פגז ולהבטיח זרימת הידרוג'ל רציפה. זה יכול להיות משולב ישירות לתוך קוד g כדי לשפר את היכולת לעבור חזרה. 5) מועיל להוסיף חצאית המקיפה את הפיגום על מנת להבטיח את הנחת החוט האחיד החלול לפני שהדפסת הפיגום עצמה מתחילה.

בנוסף, 6) כדי לשפר את הדבקה בין החוט הדפוס ואת מצע, מומלץ להשתמש במשטח שטוח עם הדבקה טובה (כלומר, שקופית זכוכית או צלחת פטרי). 7) הזרבובית ההבלטה לא צריכה להיות במגע ישיר עם המצע כדי לאפשר זרימה רציפה של ההידרוג'ל. המרחק ההתחלתי ישפיע בחוזקה על איכות ההדפסה, אך עובי החוט הנמתח הוא הערכה טובה של ההגדרה ההתחלתית. 8) גובה ההדפסה ההתחלתי בקוד-g מותאם בהתאם לצרכים הפרטניים. לאחר שפרמטרי ההדפסה ממוטבים, יש לייבא את קוד ה-g של הפיגום לתוכנת כוכב CNC ותהליך ההדפסה התחיל כמתואר בפרוטוקול. 9) כדי לשלוט ולייעל את זרימת ההידרוג'ל בכוונה להדפיס את הפיגומים האופטימליים, גם הרכב הניסוח ופרמטרי ההדפסה צריכים להיות מגוונים (כלומר, מהירות הדפסה, לחץ הבלטה, טמפרטורת הדפסה, מרחק בין המצע ל זרבובית הבלטה, גובה השכבה, גודל הגרדום, וכו ').

באופן כללי, שיעורי זרימה גבוהים יותר נדרשים כדי להדפיס ניסוחים עם צמיגות גבוהה יותר. כפי שהוזכר, כל הניסוחים הידרוג'ל, אשר מתאימים מיידית החוצה קישור כימי, לאפשר ייצור של צעד אחד של צינורות חלול ניתן להשתמש עם הליבה המתואר/הגדרת פגז. מנגנוני ההדפסה והקישור החוצה צריכים להיות ממוטבים בהתאם. לאחר ההדפסה, כל הפיגומים היו לאחר עיבוד על ידי משני קישורים משניים עם 5 wt .% CaCl2 פתרון, אשר הבטיחו להשלים את הקישור החוצה של רכיב alg-CMC ו מעוקר משני הצדדים תחת אור UV לפחות 30 דקות. יש להבטיח לחלוטין לממש את הפיגום עם הפתרון החוצה המקשר והדגירה מספיק זמן כדי להשלים את התהליך החוצה המקשר. עיבוד לאחר התהליך יהיה שונה בהתאם למנגנון החומרי והמקשר שבשימוש, שאמור להיחשב מראש. לאחר עיבוד לאחר, קפלי פיגומים יש להסיר בזהירות מן המצע, הועברו לתקשורת התרבות תאים, ו מודבטים באווירה מבוקרת לפחות 24 לפני זריעת התאים. שימוש במדיום חסר צבע ישפר את ניראות ההשעיה של התא במהלך ההזרקה לתוך הפיגומים.

שיטת חי/מת
הפתרון החי/מת צריך להיות מוכן ישירות לפני שהוא מנהל את התשובה ונשמר בחשכה לפני שהוא מנהל את הבעיה, כפי שהוא מכיל צבעי קרינה שנוטים להלבלב. לאחר זמן הדגירה הרצוי, יש למחוק בזהירות את מדיית התרבות של התאים סביב הפיגומים ולשטוף את הערוץ. באופן אידיאלי, יש להשתמש באותה נקודת כניסה לזריעת תאים ולאחריו הנתונים החיים/מתים המוזרקים לתוך הפיגומים.

חשיבות התוצאות
הן ALG ו CMC כבר שימשו כדי לקדם אנגיוגנזה בתוך מבחנה. בהתבסס על תכונות ECM-מימטי, הקישור הפיזי והביו-תאימות, ALG כבר מועסק בדרך כלל כרכיב למסירה ושחרור מבוקר של גורמי גדילה אנגיוגנטיים (g., bFGF, HGF, VEGF164, ו-Ang-1 * בהתאמה)52 ,53,54. יתר על כן, בשילוב עם טין, CMC יש גם שימש לתאים encapsulating כלי הדם האנטי וסקולרית בשל יכולות החוצה במהירות שלה חוצה בתנאים פיסיולוגיים55. NFC נוספו להגדיל עוד יותר את יציבות מכנית נאמנות הצורה של הפיגומים. יש להדגיש כי המטרה היתה לא לשפר את vascularization אלא כדי להדגים את האפשרות של ייצור מבשם, חלול ALG-CMC פיגומים, מודפס בצורה ליבה/פגז, אשר גם מקלה על ההחזקה והתפשטות של . בסדר, הווצ הבחירה של שימוש בתערובת alg-CMC היה מבוסס על ממצאים של שימוש נפוץ, נגיש בקלות, ו סתיימים בסיס חומרים שיכולים לאפשר הדפסה ליבה/פגז של ערוצים חלול. חומרים רבים אחרים עשויים להיות אפשרויות קיימא יותר לשיפור האנגיוגנזה; עם זאת, חלק אינם מתאימים הדפסה ליבה/פגז, כאשר הם אינם מאפשרים ליצור מהיר/קישור חוצה, אשר חיוני בגישה זו.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים רוצים להכיר בתמיכה הכספית בפרויקט זה שהתקבל מסוכנות המחקר הסלובנית (הענקת מספרים: P3-0036, I0-0029), ומשרד המדע, החינוך והספורט (מספר מענק: 5442-1/2018/59).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alginic acid sodium salt Sigma-Aldrich (Germany) 180947 powder; Mw ~80,000
ATTC HUV-EC-C [HUVEC] LGC Standards (UK) ATCC-CRL-1730 Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) and unidentified factors from bovine pituitary, hypothalamus or whole brain extracts are mitogenic for this line; the cells have a life expectancy of 50 to 60 population doublings.
Axiovert 40 inverted optical microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH (Germany) three contrastingtechniques in one objective – e.g. brightfield,phase contrast and PlasDIC
Calcium chloride Sigma-Aldrich (Germany) C1016 anhydrou; granular; ≤7.0 mm; ≥93.0%
Cellulose nanofibrils suspension (NFC, 3% (w/v)) The Process Development Center, University of Maine (Maine, USA) nominal fiber width of 50 nm; lengths of up to several hundred microns
ELGA Purelab water purification system Veolia Water Technologies (UK)
EVOS FL Cell Imaging System ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) AMF4300 a fully integrated, digital, inverted imaging system for four-color fluorescence and transmitted-light applications
Gibco Advanced Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Advance DMEM) ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 12491015 high glucose; no glutamine; phenol red
Gibco Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 21063029 high glucose; L-glutamine; HEPES; no phenol red
Gibco Fetal Bovine Serum (FBS), qualified ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 10270106 FBS origin: Brazil; 5 % (w/v) FBS
Hypodermic Sterican needle B. Braun Melsungen AG (Germany) 9180117 0.40 x 25mm, 27G x 1''
L-glutamine Sigma-Aldrich (Germany) G3126 ReagentPlus®, ≥99% (HPLC)
Live/Dead Cell Double Staining Kit Sigma-Aldrich (Germany) 4511 contains calcein-AM and propidium iodide (PI) solutions; suitable for fluorescence
Nunc EasYFlask cell culture flasks ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 156367 Nunclon Delta certified for monolayer formation, cloning efficiency, non-cytotoxic, non-pyrogenic, and sterility; filter caps; culture area of 25 cm2
Omnifix syringe B. Braun Melsungen AG (Germany) 4617053V 5 mL Luer Lock
Penicillin G sodium salt Sigma-Aldrich (Germany) P3032 powder; BioReagent; suitable for cell culture
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich (Germany) P4417 tablet; one tablet dissolved in 200 mL of deionized water yields 0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4, at 25 °C
Sodium carboxymethyl cellulose Sigma-Aldrich (Germany) 419338 powder; average Mw ~700,000
Streptomycin sulfate salt Sigma-Aldrich (Germany) S9137 powder; BioReagent; suitable for cell culture
Ultra-pure water Veolia Water Technologies (UK) 18.2 m? cm at 25?C
VitaPrint 3D bio-printer IRNAS (Slovenia)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langer, R., Vacanti, J. Advances in tissue engineering. Journal of pediatric surgery. 51 (1), 8-12 (2016).
  2. Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Engineering complex tissues. Science Translational Medicine. 4 (160), (2012).
  3. Khademhosseini, A., Vacanti, J. P., Langer, R. Progress in tissue engineering. Scientific American. 300 (5), 64-71 (2009).
  4. Wobma, H., Vunjak-Novakovic, G. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review. Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (2), 101-113 (2016).
  5. Park, K. M., Shin, Y. M., Kim, K., Shin, H. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2017: A Year in Review. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (5), 327-344 (2018).
  6. Mattei, G., Giusti, S., Ahluwalia, A. Design criteria for generating physiologically relevant in vitro models in bioreactors. Processes. 2 (3), 548-569 (2014).
  7. Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three‐dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
  8. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  9. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  10. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
  11. Di Nardo, P., Minieri, M., Ahluwalia, A. Stem Cell Engineering. , Springer. 41-59 (2011).
  12. Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. Journal of the Royal Society Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
  13. Tayalia, P., Mooney, D. J. Controlled growth factor delivery for tissue engineering. Advanced Materials. 21 (3233), 3269-3285 (2009).
  14. Caddeo, S., Boffito, M., Sartori, S. Tissue Engineering Approaches in the Design of Healthy and Pathological In Vitro Tissue Models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 40 (2017).
  15. Chang, H. -I., Wang, Y. Regenerative medicine and tissue engineering-cells and biomaterials. , InTech. (2011).
  16. Rice, J. J., et al. Engineering the regenerative microenvironment with biomaterials. Advanced Healthcare Materials. 2 (1), 57-71 (2013).
  17. Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocols. 11 (10), 1775-1781 (2016).
  18. Yu, Y., Alkhawaji, A., Ding, Y., Mei, J. Decellularized scaffolds in regenerative medicine. Oncotarget. 7 (36), 58671-58683 (2016).
  19. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  20. Lovett, M., Lee, K., Edwards, A., Kaplan, D. L. Vascularization strategies for tissue engineering. Tissue Engineering Part B: Reviews. 15 (3), 353-370 (2009).
  21. Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
  22. Bae, H., et al. Building vascular networks. Sci Transl Med. 4 (160), (2012).
  23. Štumberger, G., Vihar, B. Freeform Perfusable Microfluidics Embedded in Hydrogel Matrices. Materials. 11 (12), 2529 (2018).
  24. Ibrahim, M., Richardson, M. K. Beyond organoids: In vitro vasculogenesis and angiogenesis using cells from mammals and zebrafish. Reproductive Toxicology. 73, 292-311 (2017).
  25. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Influence of adult mesenchymal stem cells on in vitro vascular formation. Tissue Engineering Part A. 15 (7), 1751-1761 (2009).
  26. Davies, N. H., Schmidt, C., Bezuidenhout, D., Zilla, P. Sustaining neovascularization of a scaffold through staged release of vascular endothelial growth factor-A and platelet-derived growth factor-BB. Tissue Engineering Part A. 18 (1-2), 26-34 (2012).
  27. Li, X., He, J., Zhang, W., Jiang, N., Li, D. Additive manufacturing of biomedical constructs with biomimetic structural organizations. Materials. 9 (11), 909 (2016).
  28. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773 (2014).
  29. Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
  30. Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Advanced Materials. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  31. Huang, Y., Zhang, X. F., Gao, G., Yonezawa, T., Cui, X. 3D bioprinting and the current applications in tissue engineering. Biotechnology Journal. , (2017).
  32. Wang, X., et al. 3D bioprinting technologies for hard tissue and organ engineering. Materials. 9 (10), 802 (2016).
  33. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
  34. Rocca, M., Fragasso, A., Liu, W., Heinrich, M. A., Zhang, Y. S. Embedded Multimaterial Extrusion Bioprinting. SLAS Technology. 23 (2), 154-163 (2018).
  35. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
  36. Huang, S., Yang, Y., Yang, Q., Zhao, Q., Ye, X. Engineered circulatory scaffolds for building cardiac tissue. Journal of Thoracic Disease. 10 (Suppl 20), S2312-S2328 (2018).
  37. Hoch, E., Tovar, G. E., Borchers, K. Bioprinting of artificial blood vessels: current approaches towards a demanding goal. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 46 (5), 767-778 (2014).
  38. Yeo, M., Lee, J. S., Chun, W., Kim, G. H. An Innovative Collagen-Based Cell-Printing Method for Obtaining Human Adipose Stem Cell-Laden Structures Consisting of Core-Sheath Structures for Tissue Engineering. Biomacromolecules. 17 (4), 1365-1375 (2016).
  39. Liu, W., et al. Coaxial extrusion bioprinting of 3D microfibrous constructs with cell-favorable gelatin methacryloyl microenvironments. Biofabrication. 10 (2), 024102 (2018).
  40. Gao, Q., He, Y., Fu, J. Z., Liu, A., Ma, L. Coaxial nozzle-assisted 3D bioprinting with built-in microchannels for nutrients delivery. Biomaterials. 61, 203-215 (2015).
  41. Akkineni, A. R., Ahlfeld, T., Lode, A., Gelinsky, M. A versatile method for combining different biopolymers in a core/shell fashion by 3D plotting to achieve mechanically robust constructs. Biofabrication. 8 (4), 045001 (2016).
  42. Colosi, C., et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink. Advanced Materials. 28 (4), 677-684 (2016).
  43. Kim, G., Ahn, S., Kim, Y., Cho, Y., Chun, W. Coaxial structured collagen–alginate scaffolds: fabrication, physical properties, and biomedical application for skin tissue regeneration. Journal of Materials Chemistry. 21 (17), 6165-6172 (2011).
  44. Luo, Y., Lode, A., Gelinsky, M. Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 2 (6), 777-783 (2013).
  45. Mistry, P., et al. Bioprinting Using Mechanically Robust Core-Shell Cell-Laden Hydrogel Strands. Macromolecular Bioscience. 17 (6), (2017).
  46. Banović, L., Vihar, B. Development of an extruder for open source 3D bioprinting. Journal of Open Hardware. 2 (1), (2018).
  47. HUV-EC-C [HUVEC] (ATCC® CRL-1730™) Homo sapiens umbilical vein. , Available from: http://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/CRL-1730.aspx?geo_country=si#documentation (2019).
  48. Habib, A., Sathish, V., Mallik, S., Khoda, B. 3D printability of alginate-carboxymethyl cellulose hydrogel. Materials. 11 (3), 454 (2018).
  49. Maver, T., et al. Combining 3D printing and electrospinning for preparation of pain-relieving wound-dressing materials. Journal of Sol-Gel Science and Technology. , 1-16 (2018).
  50. Kuo, C. K., Ma, P. X. Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: Part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties. Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).
  51. Topuz, F., Henke, A., Richtering, W., Groll, J. Magnesium ions and alginate do form hydrogels: a rheological study. Soft Matter. 8 (18), 4877-4881 (2012).
  52. Perets, A., et al. Enhancing the vascularization of three-dimensional porous alginate scaffolds by incorporating controlled release basic fibroblast growth factor microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 65 (4), 489-497 (2003).
  53. Ruvinov, E., Leor, J., Cohen, S. The effects of controlled HGF delivery from an affinity-binding alginate biomaterial on angiogenesis and blood perfusion in a hindlimb ischemia model. Biomaterials. 31 (16), 4573-4582 (2010).
  54. Peirce, S. M., Price, R. J., Skalak, T. C. Spatial and temporal control of angiogenesis and arterialization using focal applications of VEGF164 and Ang-1. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), H918-H925 (2004).
  55. Kageyama, T., et al. In situ cross-linkable gelatin-CMC hydrogels designed for rapid engineering of perfusable vasculatures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (6), 1059-1066 (2016).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 151 ליבה/פגז קואקסיאליים ביוריטינג ביו-הנדסה הנדסת רקמות CMC alginate צינורי רקמה הנדסה ואסילריזציה
ליבה/פגז הדפסה פיגומים קפלים להנדסת רקמות של מבנים צינורי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Milojević, M., Vihar, B.,… More

Milojević, M., Vihar, B., Banović, L., Miško, M., Gradišnik, L., Zidarič, T., Maver, U. Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures. J. Vis. Exp. (151), e59951, doi:10.3791/59951 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter