Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Ядро / оболочка Печать Scaffolds для ткани инженерных трубчатых структур

Published: September 27, 2019 doi: 10.3791/59951
Automatic Translation
1, 1,2, 2, 2, 1, 1, 1,3
1Institute of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, University of Maribor, 2Institute for Development of Advanced Applied Systems (IRNAS), 3Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, University of Maribor

Summary

Здесь представлена простая в использовании, ядро / оболочка, трехмерная биопечать настройки для одноступенчатой изготовления полых лесов, подходит для тканевой инженерии сосудистых и других трубчатых структур.

Abstract

Трехмерная (3D) печать ядр/оболочки позволяет прямо едить структуры канала со стабильной оболочкой, которая взаимосвязана на интерфейсе с жидким ядром. Последний удаляется после печати, оставляя полую трубку. Интеграция техники аддитивного производства (как описанная здесь с индивидуальными «био- инкетами», которые структурно и биохимически имитируют родную внеклеточную матрицу (ECM)) является важным шагом на пути к передовой тканевой инженерии. Однако для точного изготовления четко определенных структур требуется специализированные стратегии изготовления, оптимизированные для использоватого материала. Поэтому имеет смысл начать с настройки, которая настраивается, проста в использовании и совместима с широким спектром материалов и приложений. Эта работа представляет собой простой в производстве ядра / оболочки сопла с luer-совместимости для изучения ядра / оболочки печати деревянных структур, испытания с четко определенными, альгината основе эшафот материала формулировки.

Introduction

Возможно, конечной целью тканевой инженерии (TE) является производство функциональных тканей или органов in vitro, которые могут быть использованы для регенерации или замены поврежденных или больных частей человеческого тела1,2,3. Текущие исследования в области тканевой инженерии (TE) сосредоточены на отдельных аспектах области (строительные материалы, процедуры изготовления, источники клеток и т.д.) 4,5, а также разработка простых моделей in vitro тканей и органов, которые имитируют фундаментальные аспекты их аналогов in vivo. Такие модели уже полезны для многих применений, таких как скрининг наркотиков и исследования токсичности, особенно в тех случаях, когда обычные 2D-клеточные культуры не могут имитировать динамические реакции родныхтканей 6,7, 8,9. Трехмерные модели in vitro обычно строятся путем объединения клеток10,физико-химических сигналов11и биологически активных молекул12,13 на эшафотах, которые получены из децеллюляризованных тканей или построен de novo из биологических или биосовместимых материалов14,15,16,17,18.

Очень важно, чтобы леса резюмировать сложные 3D микроархитектуры и иерархической структуры родных тканей, чтобы функциональность инженерных тканей, представитель in vivo тканей19. Несмотря на значительный технологический прогресс в TE, развитие физиологически значимых конструкций искусственных тканей остается сложной задачей. Толстые ткани ( йgt;200 мкм в толщине) особенно проблематичны, из-за ограничений, таких как кислород и диффузии питательных веществ20. Достигнут прогресс в направлении более крупных тканевых конструкций; однако необходимо резюмировать необходимую высокую близость клеток к кровеносным сосудам для транспортировки кислорода и питательных веществ и содействия удалению отходов. Васкуляризация тканей (или, наоборот, изготовление взаимосвязанных 3D сосудистых сетей в структурных конструкциях тканей) играет важную роль в поддержании жизнеспособности клеток и продвижении функций тканей in vitro, что более сложно для модели в длительных экспериментах21,22. Кроме того, требуемое разрешение, структурная целостность и одновременная биосовместимость еще не достигнуто23.

Несколько te подходов были предложены в попытке построить кровеносные сосуды, как структуры и облегчить васкуляризации в пробирке. Некоторые примеры включают посев эндотелиальных клеток (также совместно культурных с другими типами клеток, таких как фибробласты), которые самостоятельно собирать для создания микрососудистых сетей24, использование сосудистых клеток-прародителей и перицитов, которые способствуют эндотелиальных клеток рост21,25, доставка ангиогенных факторов роста, которые вызывают васкуляризации20,26, с использованием технологии клеточного листа, что позволяет контролировать сосудистого слоя20, и изготовление очень пористые структуры эшафот, которые способствуют ангиогенез27. Упомянутые подходы сосредоточены на индукции ангиогенеза, которая, как правило, требует значительного количества дополнительных факторов роста (например, VEGF) и времени для формирования. Однако самыми большими недостатками являются их ограниченная воспроизводимость и ограниченный пространственный контроль над сосудистым узором, что обычно приводит к случайному распределению сосудов в структуре ткани, что не обязательно облегчает перфузию.

Аддитивное производство (AM, например 3D-биопечать) все чаще участвует в изготовлении 3D конструкций с использованием биологических или биосовместимых материалов для создания лесов, пригодных для TE. Параллельно используется и разрабатывается несколько подходов AM (например, методы на основе струйных и микроэкструзии, различные типы литографических методов) для создания эшафотов, имитирующих местные ткани в их архитектуре, биохимии и функциональности . Индивидуальные методы обладают определенными преимуществами и недостатками28, поэтому различные изменения изучаются (например, микро-узор, индуцированный ангиогенез и т.д.), чтобы увеличить степень, в которой большие, сложные и стабильные сосудистые сети могут быть изготовлены22,29,30.

Среди них, экструзионная биопечать является наиболее часто используемым методом, особенно из-за широкого спектра совместимых материалов (обычно сотовый процесс28,31,32), а также исключительная универсальность в условия применения (например, встроенная и жертвенная печать23,33,изготовление полых структур34,35и т.д.). Основные проблемы, волнующие нынешние исследования, включают перенос от 2D к 3D структурам, формирование плотной сети полых труб оковых труб с высоким пространственным разрешением, а также общую механическую целостность и точность формы во время потока жидкости в клеточной культуре условия30.

Самый простой подход к изнасылкой ткани – это изготовление взаимосвязанной сети каналов внутри конструкции. Создание таких перфусируемых каналов в эшафот ткани, как ожидается, решить многие из вышеупомянутых проблем, так как он сразу же позволяет для распространения питательных веществ и кислорода при удалении отходов. Таким образом, потенциального образования некротических регионов в конструкции можно избежать36. Такие каналы могут дополнительно быть посеяны эндотелиальными клетками (ECs) и служить в качестве искусственных кровеносных сосудов в 3D-модели ткани37. В самом элементарном смысле, сосуд может состоять из полого канала, мягкого слоя ЭК и жесткой оболочки. В последнее время 3D экструзия двух различных материалов в ядре / оболочки моды с использованием соосных игл для экструзии приобрел большой интерес38,39,40,41, как это позволяет для изготовления полые трубы.

Подобно обычной микроэкструзионной 3D-печати, печать ядра/оболочки выполняется с помощью соосевой сопла (например, две иглы с разными диаметрами, выровненные на одной и той же оси таким образом, чтобы более широкая игла окутала более узкую). Таким образом, два материала могут быть экструдированы одновременно, с одним в качестве центральной нити или "внутреннего" ядра, а второй, как "внешняя" оболочка41. На сегодняшний день, соосиной биопечати была использована для изготовления структур с твердыми42, ядро / оболочка43, и полые нити40,44; однако используемые материалы не были оптимизированы как для оптимальной жизнеспособности клеток, так и для механической прочности печатных конструкций. Как уже упоминалось, методика дает возможность сочетать биоматериалы с различными механическими свойствами, в которых более жесткий поддерживает более мягкое. Что еще более важно, если эшафот материал (например, альгинат, карбоксиметил целлюлозы) экструдируется как оболочка, в то время как ядро состоит из перекрестного агента (например, хлорид кальция) отпускается из внутреннего капилляра, то вымывается после печати, это можно изготовить непрерывную полую трубку в одном шаге45.

Имея это в виду, простой и повторяемый одношаговый метод был разработан для создания четко определенных и трудноподдавливания леса для проектирования сосудистых структур и других трубчатых тканей. Для разработки экономически эффективной технологии изготовление в идеале должно быть одноэтапным процессом. Таким образом, установка ядра/оболочки была адаптирована и интегрирована в 3D биопринтер. Основная конструкция состоит из центрального сопла из металла, чтобы избежать деформации во время инъекции, вокруг которой помещается вторая сопло большего диаметра. Такая соосная установка сопла позволяет совместно экструзию двух потоков и немедленно перекрестное соединение экструдированного канала гидрогеля. Это позволяет прямое изготовление многослойных полых нитей, в то время как последующее перекрестное соединение с более высокими концентрациями хлорида кальция (CaCl2)обеспечивает более постоянную стабилизацию извне.

Таким образом, этот метод позволяет одновременно печатать эшафоты и микроканалы, в которых полые гидрогелевые нити служат в качестве эшафота для поддержки механической целостности 3D конструкций и одновременно выступать в качестве встроенных микроканалов для доставки питательные вещества для роста клеток. Этот протокол обеспечивает детальную процедуру стратегии биопечати ядра/оболочки 3D, основанной на использовании специально созданного коосиального сопла, в котором гидрогелевые 3D-структуры со встроенными каналами изготавливаются путем контроля перекрестного соединения для производства полых нитей, которые остаются неотрадостными во время клеточной культуры.

Настройка 3D-печати, используемая в этой работе, настроена, как ранее описано Бановичем и Вихаром46, и может быть разделена на три основных компонента: A) трехосную механическую установку CNC с точностью позиционирования 50 мкм в направлениях X, Y и Q; B) два экструдера, приспособленные для одноразовых шприцев с 6 мл люр-замка, с разрешением вокселя 1,2 л; и C) управление электроникой и программным обеспечением.

Для облегчения печати ядра/оболочки была разработана соответствующая сопла, которая может быть установлена на одном из экструдеров (первичный экструдер, печать ядра) и совместима с тупыми иглами G27. Он также имеет люр-блокировку совместимости для подключения со вторым экструдером (печать оболочки). Первые прототипы были изготовлены путем вставки тупой конец G27 иглы (внутренний диаметр 210 мкм, внешний диаметр 410 мкм) либо в G21 иглы (внутренний диаметр 510 мкм, внешний диаметр 820 мкм) или G20 конический наконечник (внутренний диаметр 600 мкм), а затем вставить вторичный n eedle боковой для поставки материала оболочки. Однако, из-за небольшого изгиба вала иглы, невозможно произвести наконечник сопла с концентрическим выравниванием внутренней и внешней иглы.

Для решения этой проблемы была разработана новая конструкция сопла, которая соответствовала следующим критериям: 1) она может быть изготовлена с использованием 3-осевой мельницы Чок, 2) она может быть изготовлена из различных материалов (высокопроизводительные пластмассы, такие как PEEK или металлы), 3) она имеет люэр-блокировку совместимости для нанесения оболочки материала, и 4) совместим агольсицируется для тупой иглы G27 и удерживает ее на месте в двух позициях, чтобы выровнять кончик с центральной осью. Схема прототипа сопла показана на рисунке 1.

Protocol

1. Подготовка гидрогелей и кросс-связывающих растворов

  1. Кратко, энергично смешивания, растворить ALG и CMC порошков в ультра-чистой воды, чтобы получить в общей сложности 3 Wt% ALG и 3 WT% CMC решение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этой работе для печати используются шприцы 5 мл; таким образом, конечный объем материала корректируется с учетом этого объема. Однако для других экструзионных картриджей и размеров печатных образцов количество подготовленного материала должно быть соответствующим образом масштабировано.
  2. Добавьте 1,5 вт целлюлозы нановолокна в смесь ALG-CMC для дополнительного механического усиления для достижения желаемой вязкости, пригодной для печати.
  3. Агитировать гидрогель подвески до однородной с помощью накладных смесителей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нет волокон или пузырьков должны присутствовать в гидрогеле.
  4. Приготовьте 10 мл хлорида кальция 100 мМ (CaCl2)в ультра-чистой воде, которая используется в качестве основного перекрестного раствора для печати.
  5. Приготовьте 10 мл 5 wt.% CaCl2 раствор в ультра-чистой воде, которая используется в качестве вторичного кросс-связывающего решения в пост-обработке эшафотов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, все гидрогелевые составы, которые подходят для немедленного химического перекрестного соединения, позволяют одноступенчатое изготовление полых труб и могут быть использованы с этим типом ядра/оболочки настройки. Механизмы печати и перекрестного соединения должны быть оптимизированы соответствующим образом. Вискозность гидрогеля будет варьироваться в зависимости от желаемого состава; однако его можно регулировать с помощью концентраций полимеров и добавления утолщений (например, нановолокна). Идеальная вязкость для 3D-печати стабильных структур достаточно высока для экструдированной нити, чтобы сохранить свою форму и для эшафота, чтобы держать свой собственный вес до перекрестного соединения.

2. Печать основных/оболочки из перфусируемых лесов

  1. Перед печатью, стерилизовать биопринтер путем распыления 70% этанола тщательно и подвергать его ультрафиолетового света в течение 1 ч.
  2. Включите биопринтер и запустите программное обеспечение для управления, которое поставляется в комплекте с 3D-принтером.
  3. Выполните процедуру самонаведения, нажав на значок Home.
  4. Использование панели инструментов в файле управления файлом Импорт G-код, импортировать генерируемые леса g-код.
  5. Перенесите гидрогель в стерильный шприц 5 мл и поместите его в одну из экструдеров 3D-принтера. Через luer-замок и короткую трубку, подключите его к боковой входним ввода ядра / оболочки сопла.
  6. Перенесите кросс-связывающее решение (100 мМ CaCl2) в другой стерильный шприц 5 мл с прикрепленной тупой иглой G27 и вставьте его в верхний держатель иглы ядра/оболочки сопла. Внутренняя игла должна слегка выступать (1 мм) от внешнего ядра/ сопла оболочки. Отрегулируйте выравнивание вручную. Вставьте второй шприц в экструзионное крепление.
  7. Чтобы правильно вставить шприцы в крепления (настройка показана на рисунке 2),вручную управляйте как экструзионными креплениями, нажав на стрелки A и B и Up and Down.
  8. Перед началом печати отдельно выдавливать гидрогель и перекрестное решение для очистки всех избыточных пузырьков воздуха в сопло ядра/оболочки и обеспечения непрерывного потока гидрогеля.
  9. Используя стрелки «Кью», «вверх» и «Вниз», вручную отрегулируйте расстояние между соплом и печатным субстратом. Рекомендуется использовать плоский, стеклопечатание субстрат, который имеет хорошую сливку. Экструзионная сопло не должна соприкасаться с субстратом, чтобы обеспечить непрерывный поток гидрогеля. Оптимальное расстояние между соплом и субстратом (высота слоя) обычно совпадает с шириной диаметра наружного сопла, но оно корректируется с учетом используемого материала и индивидуальных параметров печати. Отрегулируйте начальную высоту печати в соответствии с индивидуальными потребностями.
  10. Нажмите кнопку Воспроизведения, чтобы начать процесс печати.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется включить печать юбки (Рисунок 3) окружающих эшафот, чтобы обеспечить укладку однородной полой нити до печати фактического эшафот начинается. Для достижения оптимального потока гидрогеля с намерением печатать оптимальные леса, варьировать состав формулировки, поперечной состав раствора и параметры печати (т.е. скорость печати, экструзионное давление, температуру печати, расстояние между субстрат и экструзионный сопло и т.д.).
  11. После печати, тщательно удалить субстрат с печатной эшафот и залить вторичного кросс-ссылок решение (5 wt.% CaCl2) по всей эшафот для обеспечения перекрестного соединения по всей эшафот. Инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре (RT).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что весь эшафот погружен в кросс-связывание решения. Этот шаг имеет решающее значение для достижения желаемых свойств прочности эшафот, но будет варьироваться в зависимости от материала и кросс-связывания метода, используемого.
  12. С помощью скальпеля вручную вырезать избыток материала юбки.
  13. Стерилизовать эшафот под ультрафиолетовым светом в течение 30 минут. Осторожно переверните эшафот и повторите процесс стерилизации.
  14. Аккуратно отсоедините эшафот от подложки, осторожно потянув его в сторону. Если эшафот сильно прилипает к подложке, разделите его, вставив между ними острый край.
  15. Передача эшафот в бесцветные средства массовой информации культуры клеток (DMEM дополнен5 wt.% FBS, 100 U/mL пенициллин и 1 мг /мл стрептомицин), и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в атмосфере, содержащей 5 wt.% CO2, по крайней мере 24 ч.

3. Подготовка эндотелиальных клеток и решения для живого/мертвого асссиона

  1. Для культивирования клеток, подготовить передовые DMEM клеточной культуры среды с добавлением фенола красный и дополнить его 5 wt.% FBS и 2 мМ L-глютамин. Добавьте 100 u/mL пенициллин и 1 мг/мл стрептомицина.
  2. Инициировать человека пупочной вены эндотелиальной клетки (HUVEC) линии и прохождения их в соответствии с протоколами culturing HUVEC, как описано47.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется культуры клеток в среде клеточной культуры с добавлением фенола красный для простой визуализации во время инъекции клеток в белые полупрозрачные леса, как описано ниже.
  3. Для подсчета клеток, пипетка 100 л клеток приостановлено в среде клеточной культуры и пятно их с 900 Зл Л 0,1 Вт.% trypan синий раствор.
  4. Используйте автоматизированный счетчик клеток или ручной гемоцитометр для подсчета и получения предполагаемого количества клеток в подвеске.
  5. Для живого/мертвого ассса подготовьте раствор 4 мМ Calcein-AM и 2 mM пропидиййййййййййййййй йодид в стерильных PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: решение для живых/мертвых должно быть подготовлено непосредственно перед проведением асссеа.

4. Передача клеток в леса

  1. Удалите леса из клеточной культуры средств массовой информации и передать их в достаточно большой стакан Петри блюдо.
  2. Непосредственно перед введением клеток в леса, разъединить HUVECs от колбы с помощью лечения 0,25 wt.% трипсин.
    1. Кратко, распоряжаться среды культуры клеток и инкубировать клетки с 0,25 Wt.% трипсин (2 мл) в течение 5 мин при 37 градусов по Цельсию.
    2. После инкубации добавьте 3 мл средств массовой информации клеточной культуры в трипсинизированные клетки и перенесите все отдельные клетки в центрифужную трубку.
    3. Центрифуги клетки на 200 х г в течение 5 мин и распоряжаться супернатантом.
    4. Resuspend клетки в свежих средствах культуры клетки.
  3. Подсчитайте ячейки, как описано ранее. Отрегулируйте общую концентрацию клеток в соответствии с индивидуальными потребностями. В этой работе используется начальная концентрация 340 000 ячеек/мл.
  4. Переприимка клеток в стерильный шприц с прикрепленной тупой иглой G27.
  5. Найти точку входа и начать тщательно инъекционных клеток в лесах. Клеточная подвеска течет через полупрозрачный эшафот должны быть видны. Убедитесь, что весь эшафот заполняется клеточной подвеской.
  6. Погрузите леса в среду, чтобы продержаться в среде клеточной культуры, и инкубировать их при 37 градусах Цельсия в атмосфере, содержащей 5 вт.% CO2 в течение 10 дней.
  7. Пополнить среды клеточной культуры в соответствии с экспериментальными потребностями.

5. Анализ в реальном маштабе времени/мертвый и изображение клетки

  1. После инкубации, промыть леса с PBS.
  2. С тупой иглой, тщательно вводить ранее подготовленный живой / мертвый раствор (4 мМ calcein-AM и 2 мМ пропидий йодид в PBS) в лесах и инкубировать их в PBS в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию. Убедитесь, что раствор течет по длине всего эшафота.
  3. Промыть леса с помощью PBS.
  4. Аккуратно перенесите эшафот на стеклянную горку.
  5. Наблюдайте за окрашенными клетками непосредственно в лесах под флуоресцентным микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: жизнеспособные клетки производят зеленую флуоресценцию и мертвые клетки излучают красный свет флуоресценции.

Representative Results

Цель этой работы заключалась в разработке простого в производстве ядра/оболочки сопла с люр-совместимости для ядра / оболочки печати деревянных структур. Кроме того, был описан простой и повторяемый одноступенчатый протокол печати, который прост в модификации и вмещает широкий спектр материалов и различные химические механизмы перекрестного соединения для создания четко определенных и трудноподдающихся лесов для инжиниринг сосудистых и других структур трубной ткани.

Сопло ядра/оболочки
Сопло состоит из тупой иглы G27 (для печати внутренней осевой нити) и тела сопла, который удерживает иглу на месте и создает внешнюю насадку для нити оболочки с портом соединения для ввода материала. Схема показана на рисунке 1. Два шприца 5 мл, которые помещаются в отдельные экструдеры и обеспечивают основные и оболочки материалов. Тюбинг соединяет тело сопла со шприцем, обеспечивая материал оболочки.

Полная сборка сопла ядра/оболочки и настройки шприца показана на рисунке 2. Первый функциональный прототип корпуса сопла был изготовлен CNC фрезерования блок полиоксиметилена (POM). Совместимость и уплотнение между элементом, иглой G27 и трубкой была протестирована путем установки в Vitaprint. В сопло, разъеме луера-замка или между телом и иглой не наблюдалось утечки материала оболочки. Тело сопла плотно прилегает к концентратору иглы (разъем люэра), обеспечивая синхронизированное движение всего сопла с экструдером.

Здание scaffold
Самый простой подход к изготовлению эшафотов заключается в том, чтобы отложить материалы слой за слоем, где направление печати изменяется каждый последовательный слой, как правило, под углом 90 ". Из-за виско-эластичных и гигроскопических свойств гидрогелей, сохраняя форму верности печатных структур остается сложной задачей. Основной целью данного раздела протокола является 3D-печать перфусируемых ядер/подсашенных подсаской с использованием двух полимеров, которые ранее показали многообещающие результаты для строительства эшафотов (ALG и CMC) с добавлением целлюлозных нановолокон (NFC) для увеличения механической устойчивости. Оба ALG и CMC отрицательно заряжены, водорастворимые линейные кополимеры48 и оба содержат карбоксиловые группы, которые могут быть связаны с добавлением divalent катионов. Частицы Ca2'образуют ионные связи с двумя функциональными группами одновременно, образуя связи между полимерными цепями, увеличивая жесткость геля.

Печать перфусируемых лесов
Цель этого процесса состоит в том, чтобы 3D-печать простых деревянных эшафот структур, которые охватывают более нескольких слоев и сохранить свою форму верности, а также perfusability до тех пор, пока становится полностью кросс-связаны. Это требует даже соступии ядра и оболочки без кроссовера или опрокидки движений, которые могут прервать поток. Поэтому типичные методы моделирования CAD и нарезки менее подходят. В этой работе используется g-код, разработанный вручную, и для быстрой подготовки g-кода был разработан генератор g-кода на основе питона.

Леса были построены в форме деревянной сетки и построены на плоской стеклянной поверхности. Изготовление было выполнено слой за слоем, откладывая пересечения линий каждого последующего слоя в угол 90 "к предыдущему. Кроме того, каждый последующий слой был на 2% более узким в направлениях X и Y, обеспечивая непрерывную поддержку нити предыдущими слоями. Расстояние между нитями (размер макропор) можно точно спроектировать в g-коде, принимая во внимание внешний диаметр экструдированной нити (0,8 мм) и расстояние между сетками (3 мм).

Для дальнейшего рассмотрения леса должны были соответствовать ключевым критериям включения. Во-первых, для сохранения структурной целостности и геометрии (например, размер макропор) во время печати требовались леса, высота юнисты высотой не менее 4 слоев, чтобы иметь право на дальнейшее развитие. Во-вторых, леса должны оставаться perfusable (стабильные микроканалы) даже после инкубации в течение 7 дней в средствах массовой информации клеточной культуры при 37 градусах Цельсия. При соответствующих временных интервалах (1, 2, 5 и 7 дней) леса были вывезены из культурных носителей и проверены, чтобы увидеть, если они по-прежнему perfusable. На рисунке 4Aпоперечное сечение свеженапечатанной и постобработанной эшафота отображает четко видимый полый канал внутри нити. На рисунке 4B, ясно, что даже после 72 ч инкубации в среде клеточной культуры при 37 градусов по Цельсию, нить сохраняет полую структуру через всю длину эшафота.

Несколько составов были распечатаны, оставались структурно стабильными, сохраняли печатную геометрию и оставались неизменяемыми; однако, один был выбран для дальнейшего тестирования (т.е. 3 wt.% ALG 3 wt.% CMC и 1,5 вт.% NFC), что позволило печатать перфусируемые леса с до 10 слоев. Процесс печати с пользовательским соплом отображается на рисунке 5A. Печать ядра/оболочки возможна с менее вязкими составами; однако гели с более высокой концентрацией не позволяли непрерывного потока через сопло. Для первичного перекрестного соединения (основного материала, поставляемого во время печати) было использовано 100 мМ CaCl2, что адекватно стабилизировало непрерывное образование полой нити, не вызывая затвердевания геля в сопло. После печати, леса были пропитаны в 5 wt.% CaCl2 решение полностью перекрестный ссылку гидрогеля для долгосрочной формы верности. Готовый образец леса изображен на рисунке 5B. В ходе оптимизации в основной растворе использовался искусственный краситель, позволяющий проводить визуальную оценку и анализировать качество экструдированной нити. Краситель не был использован для изготовления окончательных лесов, которые были подготовлены для посева клеток и выращивания.

Live/мертвый асссс
После инкубации, живой / мертвый ассс был использован для визуализации ECs и различать живые (зеленые) и мертвых (красных) клеток в инкубированных эшафот. Это служило двум основным целям: A) определить, обеспечивают ли леса биосовместимую среду для содействия росту и сливу без воздействия вредного воздействия на клетку, и B) для визуализации структурной целостности трубчатых структур и их внутренней системы каналов более подробно.

Результаты живого/мертвого исследования показаны на рисунке 6. При наличии внутриклеточных эстеразов плазменная мембрана, проницаемая Calcein-AM, преобразуется в Calcein, испуская зеленый флуоресценционный свет в живых клетках. С другой стороны, апоптотические клетки визуализированы мембранным непроницаемым йодидом пропидия, который флуоресцирует красным цветом при интеркалировании в ДНК двойную спирали. Live / мертвые изображения и яркие поля фотографии эшафот были объединены, чтобы помочь визуализировать клетки внутри полых каналов. Раствор окрашивания был введен, и асссе выполняется непосредственно в 3D печатных лесах после эшафот-клеточной инкубации для 48 ч.

Следует отметить, что использовалась относительно небольшая плотность посева ОР (340 000 ячеек/мл), поскольку это исследование служило лишь доказательством концепции для печати основных/оболочки опасных эшафотов. Наиболее важным выводом живого/ мертвого анализа является то, что даже после 48 ч, не мертвые клетки (красные) были замечены, доказывая, что ни эшафот сам материал, ни его продукты деградации выставлены токсические эффекты. Кроме того, ECs на самом деле придерживаться и оставаться прилагается внутри леса и, казалось, образуют равномерно распределенных агломератов, когда выросли внутри каналов. Это говорит о том, что описанный метод изготовления и формулировка эшафота обеспечивают подходящую основу для построения виво, актуальные, трубчатые морфологии тканей. Помимо имитации взаимодействия клеток и ECM и жесткой связи клеток во всех трех пространственных измерениях, сложные тканевые инженерные также требует постоянного воздействия клеток на свежую среду для поддержания их жизнеспособности. Это, в свою очередь, может быть достигнуто за счет плотной сети каналов под непрерывной перфузией, которая требует дальнейшего изучения в будущей работе, и потребует оптимизации материала и параметров роста для облегчения долгосрочного тканевого проектирования сосуды.

Figure 1
Рисунок 1: прототип сопла core/shell. (A) Показана общая конструкция и основные компоненты прототипа корпуса сопла. Сопло завершается путем вставки тупой конец G27 иглы через верхнюю. Верхняя и нижняя держатели иглы обездвиживают и перерисовывает иглу с осью сопла, гарантируя, что кончик простирается от сопла через центр.  Для соединения сопла с "оболочкой" материал, выдавленный из вторичного шприца, трубки с разъемом luer-lock прикрепляются к боковому вхотворному. Отсюда материал переправляется к сопло через узкий канал. Изготовление упомянутого канала требует бурения в двух позициях, производя отверстия, которые должны быть ограничены после производства). (B) Показано крупным планом сопла с вставленной иглой G27, простирающейся из сопла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Окончательная установка ядра/оболочки. (A) Показана завершенная сопла ядра/оболочки с правильно прикрепленными шприцев, содержащими гидрогель (справа), построение "оболочки" и кросс-связывающее решение (слева) экструдированное как "ядро". (B) Показана установка ядра/оболочки, установленная в систему Vitaprint с двумя экструдерами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: G-код трубчатых эшафотов. Здесь показано скриншот программного обеспечения принтера, в частности, предварительный просмотр пути (A) и сырой g-код первого слоя (B). G-код представляет собой набор инструкций с целевыми координатами в абсолютных пространственных направлениях (X, Y, Y), а также экструзией (A,B) в относительных направлениях. Команда G определяет тип инструкции, в то время как G1 представляет линейное движение к координатам цели, а G92 определяет исходное исходное положение. Кроме того, подача следующих команд определяется с инструкцией F в мм/мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Поперечное сечение эшафота с полым интерьером. (A) Показан поперечный срез свеженапечатанных и пост-обработанных эшафот. (B) Показано поперечное срез эшафота после инкубации в среде культуры клеток в течение 72 ч. В то время как форма сопла определяет экструзию трубки с круглым поперечным сечением, нить, кажется, несколько сплющена на осаждении. Внутренний канал, однако, остается нетронутым и сохраняет свою форму во время инкубации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Печать основных/оболочк и строительных лесов. Здесь показано изготовление(A) трехслойной подмостки с полой трубкой и его окончательная форма(B) . Для улучшения визуализации, кросс-связывание решение в ядре был окрашен красным краситель. Формула обладает достаточной механической устойчивостью для сохранения устойчивости эшафота, даже если более толстые структуры (до 10 слоев, данные не показаны) изготовлены. Внешние размеры конечной структуры составляли примерно 27 мм х 27 мм х 3,5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более крупную версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: Live / мертвый ассс, выполняемый непосредственно в лесах. Подвеска HUVECs была введена во внутренний канал эшафот, инкубируется в течение 48 ч, и лечение живым / мертвым красителя. Жизнеспособные HUVECs излучают зеленый флуоресценции свет, который представлен в ярких пятнах изображения. Мертвые клетки излучают зеленый свет флуоресценции; однако, ни один из них не видны в наблюдаемых эшафот. Распределение клеток также означает форму и сохраненные возможности перфузии каналов. В незначительной степени, жить / мертвых анализ решение также окрашенных строительных лесов материала, производя свет флуоресценции под микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Конструкция сопла
Используя разработанную сопло ядра/оболочки, интегрированную в двухэкструдовую систему Vitaprint, полые, трубчатые леса были изготовлены в одноступенчатом процессе. Для достижения ровной толщины трубчатой стенки через большинство подготовленных эшафотов, игла должна быть расположена централизованно на оси внешнего экструзионного кольца. Стандартные калибровочные иглы часто демонстрируют небольшую, но значительную эксцентриситет от оси. Таким образом, тело сопла было разработано для удержания иглы в двух местах, один раз в верхней части (фиксация концентратора) и один раз перед окончательным ядром / оболочкой камеры (фиксация самой канюли), исправление его осевой выравнивания. Точность выравнивания осевых увеличивается с расстоянием между точкой фиксации. Существует, однако, компромисс между длиной иглы и доступным объемом камеры сопла. Для дальнейшего улучшения функциональности настройки могут быть реализованы определенные модификации сопла: A) насадка с улучшенной стабильностью, B) дополнительные сопла для более широкого диапазона совместимости игл, C) точный механизм регулировки иглы к позиционирование сопла и D) интеграция дополнительных входов и микрофлюидных устройств для подготовки материала мухи.

Оптимизация гидрогеля
Для определения оптимального соотношения ALG:CMC было оценено несколько итераций материала. Как правило, печать ядра/оболочки с концентрациями выше 3 wt.% обоих компонентов была невозможна, поскольку она не позволяла непрерывный поток гидрогеля или приводила к засорению сопла. В частности, концентрация АЛГ выше 3 wt.% увеличила вязкость чрезмерно и привела к засорению сопла, в то время как более низкие концентрации АЛГ и более высокие концентрации CMC (Зтт;3 wt.%) концентрации замедлили перекрестное время и, таким образом, не смогли обеспечить достаточное количество структурная поддержка эшафота. Печать ядра/оболочки возможна с менее вязкими составами; однако, экструдированная вязкость геля должна быть достаточной для поддержания долгосрочной формы верности. В конце концов, соотношение 1:1 ALG:CMC оказалось наиболее подходящим выбором, который подтверждает предыдущее исследование Maver et al.49. Добавление NFC значительно улучшило гравюру и структурную жесткость основных/оболочки печатных лесов, но не оказало существенного влияния на перекрестные свойства материала.

Пользовательские приложения, оптимизированные для конкретных типов клеток и экспериментальных настроек, потребуют хорошо скроенных строительных материалов, которые будут варьироваться по составу и механизмам перекрестного соединения. Метод, описанный в этой работе, основан на альгинатно-целлюлозном смешанном полимерном растворе, который связан между собой ионически с использованием ионов Ca2. Alginate сам по себе представляет собой линейный полимер блоков (1,4)-связанных й-d-маннуронат (M) и l-guluronate (G) остатки, которые могут быть обратимым ионически перекрестных путем применения Ca2 "и других divalent катионов, таких как Sr2 ", Br2 "Mg 2 ". Тем не менее, наиболее широко используемым ионом для перекрестного соединения альгината остается Ca2 в виде CaCl2. Ca2 "также может быть использован в виде CaSO4 или CaCO3; однако низкая растворимость CaSO4 по отношению к CaCl2 означает более медленное гелирование. CaCO3 дает еще более медленное время гелирования, что может привести к слабым и непоследовательным механическим свойствам.

Более длинные сроки гелирования обычно производят более однородную конструкцию, однако, некоторые приложения, такие как печать ядра/оболочки требует быстрых скоростей гелирования50. Ионы Mg2 'также вызывают гелевание; однако, их кросс-связь эффективность составляет около 5x-10x ниже, по сравнению с Ca2 ",с перекрестным связыванием раз 2-3 ч. Кроме того, ионы магния более избирательны по отношению к гулуроническим установкам, поэтому перекрестное соединение больше зависит от химического состава ALG51. В этом случае, быстрая скорость гелирования имеет важное значение для обеспечения непрерывного образования полых каналов, прежде чем полая структура может рухнуть. CaCl2 дает самый быстрый уровень гелирования, что имеет решающее значение для прямого осаждения полых нитей. 100 мМ CaCl2 был использован, который адекватно стабилизировал непрерывное образование полой нити, не вызывая гель затвердевания в сопло.

Печать и постобработка эшафотов
Следующие шаги должны быть рассмотрены в ходе этой части процесса, в том числе 1) обеспечение того, чтобы все решения и материалы, включая 3D биопринтер должным образом стерилизованы перед печатью. 2) При подготовке гидрогеля, однородность материала имеет решающее значение для непрерывной печати. Введение примесей или пузырьков воздуха следует избегать, так как они могут засорить сопло и / или нарушить экструзию. 3) Шприцы должны быть должным образом подключены к соду ядра/ оболочки через механизм luer-lock и правильно вставлены в экструдеркрепления, как видно на рисунке 2A,B. 4) Перед печатью сложной структуры, рекомендуется предварительно экструдировать небольшую часть геля и поперечной связи решение для очистки избыточных пузырьков воздуха в ядре / оболочки сопла и обеспечить непрерывный поток гидрогеля. Это может быть включено непосредственно в g-код для улучшения повторяемости. 5) Полезно добавить юбку, окружающую эшафот, чтобы обеспечить укладку однородной полой нити до печати эшафот сам начинается.

Кроме того, 6) для улучшения стыковки между типовидной нитью и субстратом рекомендуется использовать плоскую поверхность с хорошей сливкой (т.е. стеклянной горкой или чашкой Петри). 7) Экструзионная сопло не должна находиться в непосредственном контакте с субстратом, чтобы обеспечить непрерывный поток гидрогеля. Начальное расстояние сильно повлияет на качество печати, но толщина экструдированной нити является хорошим приближением первоначальной настройки. 8) Начальная высота печати в g-коде должна быть скорректирована в соответствии с индивидуальными потребностями. После оптимизации параметров печати g-код леса должен быть импортирован в программное обеспечение Planet CNC, и процесс печати начался, как описано в протоколе. 9) Для контроля и оптимизации потока гидрогеля с намерением печатать оптимальные леса, как состав состава, так и параметры печати должны быть разнообразны (т.е. скорость печати, экструзионное давление, температура печати, расстояние между субстратом и экструзионный сопла, высота слоя, размер эшафота и т.д.).

Как правило, для печати составов с более высокой вязкостью требуется более высокая скорость потока. Как уже упоминалось, все гидрогелевые составы, которые подходят для немедленного химического перекрестного соединения, позволяют одноступенчатое изготовление полых труб и могут использоваться при описанной установке ядра/оболочки. Механизмы печати и перекрестного соединения должны быть оптимизированы соответствующим образом. После печати, все леса были после обработки вторичной перекрестной связи с 5 wt.% CaCl2 решение, которое обеспечивает полное перекрестное соединение компонента ALG-CMC и стерилизовать с обеих сторон под ультрафиолетовым светом, по крайней мере 30 минут. Она должна быть обеспечена, чтобы полностью поглотить эшафот с перекрестным соединением решения и инкубировать достаточно долго, чтобы завершить процесс перекрестного соединения. Постобработка будет отличаться в зависимости от используемого материала и механизма перекрестного соединения, который следует рассматривать заранее. После пост-обработки, леса должны быть удалены тщательно из подложки, переданы в среду среды культуры клеток, и инкубируется в контролируемой атмосфере, по крайней мере 24 ч до посева клеток. Использование бесцветной среды улучшит видимость клеточной подвески во время инъекций в леса.

Live/мертвый асссс
Решение для живых/мертвых должно быть подготовлено непосредственно перед проведением асссеа и храниться в темноте перед проведением асссе, так как оно содержит красители флуоресценции, которые склонны к отбеливанию. После желаемого времени инкубации, средства массовой информации клеточной культуры должны быть тщательно отбрасываются окружающих леса и промыть PBS. В идеале, та же точка входа должна быть использована для посева клеток, а затем живой / мертвый ассс вводят в лесах.

Важность результатов
Оба ALG и CMC уже были использованы для содействия ангиогенеза в пробирке. Основываясь на своих ECM-миметических особенностях, физической перекрестной связи и биосовместимости, ALG обычно используется в качестве компонента для доставки и контролируемого выпуска ангиогенных факторов роста (например, bFGF, HGF, VEGF164 и Ang-1)respective ,53,54. Кроме того, в сочетании с желатином, CMC также используется для инкапсуляции сосудистых эндотелиальных клеток из-за его быстро перекрестного соединения возможностей в физиологических условиях55. NFC были добавлены для дальнейшего повышения механической стабильности и формы верности эшафот. Следует подчеркнуть, что цель заключалась не в повышении васкуляризации, а в том, чтобы продемонстрировать возможность производства перфусируемых, полых эшафотов ALG-CMC, напечатанных в основной форме, что также облегчает привязку и распространение HUVECs. Выбор использования смеси ALG-CMC основывался на выводах широко используемых, легкодоступных и биосовместимых базовых материалов, которые могли бы обеспечить печать ядра/оболочки полых каналов. Многие другие материалы могут быть более жизнеспособными вариантами для повышения ангиогенеза; однако некоторые из них не подходят для печати ядра/оболочки, поскольку они не способствуют быстрому гелянию/перекрестной связи, что имеет решающее значение в этом подходе.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы отметить финансовую поддержку этого проекта, полученную от Словенского исследовательского агентства (гранты: P3-0036 и I0-0029) и Министерства науки, образования и спорта (номер гранта: 5442-1/2018/59).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alginic acid sodium salt Sigma-Aldrich (Germany) 180947 powder; Mw ~80,000
ATTC HUV-EC-C [HUVEC] LGC Standards (UK) ATCC-CRL-1730 Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) and unidentified factors from bovine pituitary, hypothalamus or whole brain extracts are mitogenic for this line; the cells have a life expectancy of 50 to 60 population doublings.
Axiovert 40 inverted optical microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH (Germany) three contrastingtechniques in one objective – e.g. brightfield,phase contrast and PlasDIC
Calcium chloride Sigma-Aldrich (Germany) C1016 anhydrou; granular; ≤7.0 mm; ≥93.0%
Cellulose nanofibrils suspension (NFC, 3% (w/v)) The Process Development Center, University of Maine (Maine, USA) nominal fiber width of 50 nm; lengths of up to several hundred microns
ELGA Purelab water purification system Veolia Water Technologies (UK)
EVOS FL Cell Imaging System ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) AMF4300 a fully integrated, digital, inverted imaging system for four-color fluorescence and transmitted-light applications
Gibco Advanced Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Advance DMEM) ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 12491015 high glucose; no glutamine; phenol red
Gibco Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 21063029 high glucose; L-glutamine; HEPES; no phenol red
Gibco Fetal Bovine Serum (FBS), qualified ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 10270106 FBS origin: Brazil; 5 % (w/v) FBS
Hypodermic Sterican needle B. Braun Melsungen AG (Germany) 9180117 0.40 x 25mm, 27G x 1''
L-glutamine Sigma-Aldrich (Germany) G3126 ReagentPlus®, ≥99% (HPLC)
Live/Dead Cell Double Staining Kit Sigma-Aldrich (Germany) 4511 contains calcein-AM and propidium iodide (PI) solutions; suitable for fluorescence
Nunc EasYFlask cell culture flasks ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 156367 Nunclon Delta certified for monolayer formation, cloning efficiency, non-cytotoxic, non-pyrogenic, and sterility; filter caps; culture area of 25 cm2
Omnifix syringe B. Braun Melsungen AG (Germany) 4617053V 5 mL Luer Lock
Penicillin G sodium salt Sigma-Aldrich (Germany) P3032 powder; BioReagent; suitable for cell culture
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich (Germany) P4417 tablet; one tablet dissolved in 200 mL of deionized water yields 0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4, at 25 °C
Sodium carboxymethyl cellulose Sigma-Aldrich (Germany) 419338 powder; average Mw ~700,000
Streptomycin sulfate salt Sigma-Aldrich (Germany) S9137 powder; BioReagent; suitable for cell culture
Ultra-pure water Veolia Water Technologies (UK) 18.2 m? cm at 25?C
VitaPrint 3D bio-printer IRNAS (Slovenia)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langer, R., Vacanti, J. Advances in tissue engineering. Journal of pediatric surgery. 51 (1), 8-12 (2016).
  2. Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Engineering complex tissues. Science Translational Medicine. 4 (160), (2012).
  3. Khademhosseini, A., Vacanti, J. P., Langer, R. Progress in tissue engineering. Scientific American. 300 (5), 64-71 (2009).
  4. Wobma, H., Vunjak-Novakovic, G. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review. Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (2), 101-113 (2016).
  5. Park, K. M., Shin, Y. M., Kim, K., Shin, H. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2017: A Year in Review. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (5), 327-344 (2018).
  6. Mattei, G., Giusti, S., Ahluwalia, A. Design criteria for generating physiologically relevant in vitro models in bioreactors. Processes. 2 (3), 548-569 (2014).
  7. Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three‐dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
  8. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  9. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  10. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
  11. Di Nardo, P., Minieri, M., Ahluwalia, A. Stem Cell Engineering. , Springer. 41-59 (2011).
  12. Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. Journal of the Royal Society Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
  13. Tayalia, P., Mooney, D. J. Controlled growth factor delivery for tissue engineering. Advanced Materials. 21 (3233), 3269-3285 (2009).
  14. Caddeo, S., Boffito, M., Sartori, S. Tissue Engineering Approaches in the Design of Healthy and Pathological In Vitro Tissue Models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 40 (2017).
  15. Chang, H. -I., Wang, Y. Regenerative medicine and tissue engineering-cells and biomaterials. , InTech. (2011).
  16. Rice, J. J., et al. Engineering the regenerative microenvironment with biomaterials. Advanced Healthcare Materials. 2 (1), 57-71 (2013).
  17. Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocols. 11 (10), 1775-1781 (2016).
  18. Yu, Y., Alkhawaji, A., Ding, Y., Mei, J. Decellularized scaffolds in regenerative medicine. Oncotarget. 7 (36), 58671-58683 (2016).
  19. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  20. Lovett, M., Lee, K., Edwards, A., Kaplan, D. L. Vascularization strategies for tissue engineering. Tissue Engineering Part B: Reviews. 15 (3), 353-370 (2009).
  21. Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
  22. Bae, H., et al. Building vascular networks. Sci Transl Med. 4 (160), (2012).
  23. Štumberger, G., Vihar, B. Freeform Perfusable Microfluidics Embedded in Hydrogel Matrices. Materials. 11 (12), 2529 (2018).
  24. Ibrahim, M., Richardson, M. K. Beyond organoids: In vitro vasculogenesis and angiogenesis using cells from mammals and zebrafish. Reproductive Toxicology. 73, 292-311 (2017).
  25. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Influence of adult mesenchymal stem cells on in vitro vascular formation. Tissue Engineering Part A. 15 (7), 1751-1761 (2009).
  26. Davies, N. H., Schmidt, C., Bezuidenhout, D., Zilla, P. Sustaining neovascularization of a scaffold through staged release of vascular endothelial growth factor-A and platelet-derived growth factor-BB. Tissue Engineering Part A. 18 (1-2), 26-34 (2012).
  27. Li, X., He, J., Zhang, W., Jiang, N., Li, D. Additive manufacturing of biomedical constructs with biomimetic structural organizations. Materials. 9 (11), 909 (2016).
  28. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773 (2014).
  29. Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
  30. Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Advanced Materials. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  31. Huang, Y., Zhang, X. F., Gao, G., Yonezawa, T., Cui, X. 3D bioprinting and the current applications in tissue engineering. Biotechnology Journal. , (2017).
  32. Wang, X., et al. 3D bioprinting technologies for hard tissue and organ engineering. Materials. 9 (10), 802 (2016).
  33. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
  34. Rocca, M., Fragasso, A., Liu, W., Heinrich, M. A., Zhang, Y. S. Embedded Multimaterial Extrusion Bioprinting. SLAS Technology. 23 (2), 154-163 (2018).
  35. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
  36. Huang, S., Yang, Y., Yang, Q., Zhao, Q., Ye, X. Engineered circulatory scaffolds for building cardiac tissue. Journal of Thoracic Disease. 10 (Suppl 20), S2312-S2328 (2018).
  37. Hoch, E., Tovar, G. E., Borchers, K. Bioprinting of artificial blood vessels: current approaches towards a demanding goal. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 46 (5), 767-778 (2014).
  38. Yeo, M., Lee, J. S., Chun, W., Kim, G. H. An Innovative Collagen-Based Cell-Printing Method for Obtaining Human Adipose Stem Cell-Laden Structures Consisting of Core-Sheath Structures for Tissue Engineering. Biomacromolecules. 17 (4), 1365-1375 (2016).
  39. Liu, W., et al. Coaxial extrusion bioprinting of 3D microfibrous constructs with cell-favorable gelatin methacryloyl microenvironments. Biofabrication. 10 (2), 024102 (2018).
  40. Gao, Q., He, Y., Fu, J. Z., Liu, A., Ma, L. Coaxial nozzle-assisted 3D bioprinting with built-in microchannels for nutrients delivery. Biomaterials. 61, 203-215 (2015).
  41. Akkineni, A. R., Ahlfeld, T., Lode, A., Gelinsky, M. A versatile method for combining different biopolymers in a core/shell fashion by 3D plotting to achieve mechanically robust constructs. Biofabrication. 8 (4), 045001 (2016).
  42. Colosi, C., et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink. Advanced Materials. 28 (4), 677-684 (2016).
  43. Kim, G., Ahn, S., Kim, Y., Cho, Y., Chun, W. Coaxial structured collagen–alginate scaffolds: fabrication, physical properties, and biomedical application for skin tissue regeneration. Journal of Materials Chemistry. 21 (17), 6165-6172 (2011).
  44. Luo, Y., Lode, A., Gelinsky, M. Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 2 (6), 777-783 (2013).
  45. Mistry, P., et al. Bioprinting Using Mechanically Robust Core-Shell Cell-Laden Hydrogel Strands. Macromolecular Bioscience. 17 (6), (2017).
  46. Banović, L., Vihar, B. Development of an extruder for open source 3D bioprinting. Journal of Open Hardware. 2 (1), (2018).
  47. HUV-EC-C [HUVEC] (ATCC® CRL-1730™) Homo sapiens umbilical vein. , Available from: http://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/CRL-1730.aspx?geo_country=si#documentation (2019).
  48. Habib, A., Sathish, V., Mallik, S., Khoda, B. 3D printability of alginate-carboxymethyl cellulose hydrogel. Materials. 11 (3), 454 (2018).
  49. Maver, T., et al. Combining 3D printing and electrospinning for preparation of pain-relieving wound-dressing materials. Journal of Sol-Gel Science and Technology. , 1-16 (2018).
  50. Kuo, C. K., Ma, P. X. Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: Part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties. Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).
  51. Topuz, F., Henke, A., Richtering, W., Groll, J. Magnesium ions and alginate do form hydrogels: a rheological study. Soft Matter. 8 (18), 4877-4881 (2012).
  52. Perets, A., et al. Enhancing the vascularization of three-dimensional porous alginate scaffolds by incorporating controlled release basic fibroblast growth factor microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 65 (4), 489-497 (2003).
  53. Ruvinov, E., Leor, J., Cohen, S. The effects of controlled HGF delivery from an affinity-binding alginate biomaterial on angiogenesis and blood perfusion in a hindlimb ischemia model. Biomaterials. 31 (16), 4573-4582 (2010).
  54. Peirce, S. M., Price, R. J., Skalak, T. C. Spatial and temporal control of angiogenesis and arterialization using focal applications of VEGF164 and Ang-1. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), H918-H925 (2004).
  55. Kageyama, T., et al. In situ cross-linkable gelatin-CMC hydrogels designed for rapid engineering of perfusable vasculatures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (6), 1059-1066 (2016).

Tags

Биоинженерия Выпуск 151 ядро/оболочка коаксиальные биопечать биоинженерия тканевая инженерия CMC альгинат трубчатые ткани инженерия васкуляризация
Ядро / оболочка Печать Scaffolds для ткани инженерных трубчатых структур
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Milojević, M., Vihar, B.,… More

Milojević, M., Vihar, B., Banović, L., Miško, M., Gradišnik, L., Zidarič, T., Maver, U. Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures. J. Vis. Exp. (151), e59951, doi:10.3791/59951 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter