Summary
Denne protokol beskriver flere procedurer for fremstilling af frosne vævsprøver af høj kvalitet på tidspunktet for obduktion til brug i kometanalysen til vurdering af DNA-skader: 1) hakket væv, 2) skrabede epitelceller fra mave-tarmkanalen og 3) ternet væv prøver, der kræver homogenisering ved hjælp af en vævshakkeanordning.
Abstract
Kometen assay er stigende popularitet som et middel til at vurdere DNA-skader i dyrkede celler og væv, især efter udsættelse for kemikalier eller andre miljømæssige stressfaktorer. Brugen af kometanalysen i reguleringstest for genotoksisk potentiale hos gnavere er blevet drevet af vedtagelsen af en testretningslinje for Organisationen for Økonomisk Samarbejde og Udvikling (OECD) i 2014. Comet assay dias er typisk fremstillet af frisk væv på tidspunktet for obduktion; frysning af vævsprøver kan dog undgå logistiske udfordringer i forbindelse med samtidig tilberedning af objektglas fra flere organer pr. dyr og fra mange dyr pr. undersøgelse. Frysning gør det også muligt at sende prøver fra eksponeringsanlægget til et andet laboratorium til analyse, og opbevaring af frosset væv gør det lettere at udskyde en beslutning om at generere DNA-skadesdata for et givet organ. Den alkaliske kometanalyse er nyttig til påvisning af eksponeringsrelaterede DNA-dobbelt- og enkeltstrengsbrud, alkaliske labilelæsioner og strandbrud forbundet med ufuldstændig DNA-excisionreparation. Men, DNA-skader kan også skyldes mekanisk klipning eller forkert prøve behandling procedurer, confounding resultaterne af analysen. Reproducerbarhed ved indsamling og behandling af vævsprøver under obduktioner kan være vanskelig at kontrollere på grund af svingende laboratoriepersonale med varierende erfaring med høst af væv til kometanalysen. Det er dyrt og er muligvis ikke altid muligt at forbedre sammenhængen gennem genopfriskningstræning eller implementering af mobile enheder, der er bemandet med erfarent laboratoriepersonale. For at optimere ensartet generation af prøver af høj kvalitet til kometanalyseanalyse blev en metode til homogenisering af frosne flashterninger af væv ved hjælp af en tilpasset vævshakkeanordning evalueret. Prøver forberedt til kometen analyse ved denne metode sammenlignes positivt i kvalitet til friske og frosne vævsprøver fremstillet ved hakke under obduktion. Desuden blev lav baseline DNA-skade målt i celler fra frosne terninger af væv efter langvarig opbevaring.
Introduction
Kometanalysen anvendes i stigende grad som et middel til at vurdere DNA-skader i dyrkede celler og væv, der udsættes for kemikalier eller andre miljøstressfaktorer1. Analysen kan detektere DNA dobbelt- og enkeltstrengsbrud, alkali-labile læsioner og enkeltstrengede brud forbundet med ufuldstændig DNA-reparation. Det Internationale Råd for Harmonisering af Tekniske Krav til Lægemidler til Human anvendelse (ICH) retningslinje for farmaceutiske test anbefaler en DNA-streng brud assay såsom komet en analyse som en anden test for at supplere gnaver erythrocyt micronucleus assay til vurdering af in vivo genotoksicitet og som en opfølgende test for vurdering af virkningsmekanisme i mål organer tumor induktion2. Den Europæiske Fødevaresikkerhedsautoritet (EFSA) anbefaler in vivo-kometanalysen som en passende opfølgningstest til undersøgelse af relevansen af et positivt resultat i en in vitro-genottoksicitetstest3. I 2014 blev der godkendt en OECD-testretningslinje for gnaverkometanalysen, hvilket øger accepten af analysen til brug ved myndighedstest af genotoksisk potentiale. Analysen er baseret på elektroforetisk adskillelse af afslappede DNA-sløjfer og fragmenter, der migrerer fra nucleoids af lysed celler. Dybest set, enkelte celler er indlejret i agarose, der er blevet lagdelt på mikroskop dias. Slides nedsænkes derefter i lysisbuffer efterfulgt af en alkalisk (pH > 13) opløsning, som gør det muligt for det tæt oprullede nukleare DNA at slappe af og slappe af. Slides placeres derefter i et elektrisk felt, som stimulerer migration af negativt ladet DNA mod anoden, hvilket skaber billeder, der ligner kometer; den relative mængde DNA i kometenen sammenlignet med komethovedet er direkte proportionalt med mængden af DNA-skader DNA-indhold i halen er typisk kvantificeret ved hjælp af digital billedbehandling software.
Da kometanalysen registrerer fragmenteret DNA, kan nøjagtig kvantificering af eksponeringsinduceret DNA-skade blive forvirret af chromatinfragmentering forbundet med nekrose eller apoptose som følge af behandlingsinduceret cytotoksicitet eller stress. Desuden kan DNA-skader opstå som følge af mekanisk klipning eller forkert prøvebehandling4. Betydningen af at opretholde høstet væv nedkølet før tilberedning af glide for at minimere baselineniveauet for DNA-skader er tidligere blevet påvist5,6. Mange laboratorier forberede komet analyse dias fra frisk væv; Dette kan dog være logistisk udfordrende, når der fremstilles objektglas fra flere vævstyper pr. dyr i en undersøgelse med et stort antal dyr. Desuden udgør dette et problem, når diasforberedelse og -analyse skal finde sted på et fjerntliggende laboratorium, hvilket nødvendiggør forsendelse af prøver. For eksempel omfatter US National Toxicology Program kometen assay som en del af sin genetiske toksikologi testprogram (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) og undertiden inkorporerer analysen i 28 eller 90 dages gentagen dosis toksicitet undersøgelser; dette kræver, at laboratoriet indsamles af væv, og at prøverne overføres til et andet laboratorium til analyse. For at opnå dette hakkes vævsstykker, og/eller epitelceller i mave-tarmkanalen skrabes, og cellesuspensioner nedfryses og opbevares i en fryser til efterfølgende forsendelse og opbevaring af det modtagende laboratorium indtil analyse7. Korrekt håndtering af prøver er afgørende for at opnå data af høj kvalitet ved hjælp af frosset væv. det er imidlertid vanskeligt at kontrollere reproducerbar manipulation af vævsprøver under obduktioner udført af personale i konstant forandring, især i laboratorier i live, som ikke rutinemæssigt høster væv til kometanalysen. Genopfriskningstræning af samlepersonale eller brug af en mobil enhed, der er bemandet med erfarent laboratoriepersonale til indsamling af friske eller frosne vævsprøver, er ofte for dyr, ikke mulig eller blot undervurderet.
For bedre at sikre ensartet generation af høj kvalitet vævsprøver til overførsel til et fjerntliggende sted for komet analyse, nytten af en offentliggjort metode6 af væv bevarelse fra flash frosne terninger af væv blev undersøgt. Ved denne metode lægges frosne terninger af væv ind i en papirhakkeanordning i rustfrit stål (figur 1), som anbringes i et mikrocentrifugerør, der indeholder kold buffer. Terningen af væv skubbes derefter gennem en lille maskemaske for enden af enheden. Gentagne gange at tvinge vævsuspensionen gennem maskesien i begge retninger flere gange resulterer i en relativt ensartet enkeltcellesuspension. Prøver fremstillet ved denne metode sammenlignes positivt i kvalitet til både friske og frosne vævsprøver tilberedt ved hakkekød. Som en ekstra fordel, i modsætning til hakkede prøver, kan væv terninger opbevares frosset i længere tid og stadig give høj kvalitet resultater i kometen assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Væv blev høstet under gennemførelsen af undersøgelser udført på AAALAC-akkrediterede anlæg på NTP kontraktlaboratorier i overensstemmelse med god laboratoriepraksis forordninger (21 CFR Del 58) og dyrbrug protokoller godkendt af institutional animal Care and Use Committee (IACUC) på hvert laboratorium.
1. Vævshøst og -forarbejdning
BEMÆRK: Det er nyttigt at fremstille dublerede prøverør (f.eks. lever) eller overføre ca. halvdelen af en prøve til et andet opbevaringsrør (f.eks. duodenum, mave) for om nødvendigt at foretage en ny analyse. For at minimere den potentielle variation mellem prøver og prøver for væv i tarmkanalen anbefales det, at der udvises forsigtighed for at udtage prøver af den samme vævsregion i forhold til maven for hvert dyr, og at der opdeles en prøve for at generere dublerede prøver. Plastic pincet anbefales til overførsel af klæbrigt væv såsom hjernen. Som muligt kan hakkede, skrabede eller homogeniserede vævspræparater filtreres for at opnå homogene encellesuspensioner ved hjælp af en 40 μm cellesi fastgjort til et konisk rør.
- Fjern eventuelle tilhørende forbinder væv, organer og snavs fra organ (r) af interesse. Umiddelbart efter fjernelse, swish orgel kraftigt i en mellemstor vejer båd, der indeholder ~ 7 ml kold frisklavet hakkeopløsning (Mg++, Ca++ og phenol rød-fri Hank's Balanced Salt Solution, 10% v / v DMSO, og 20 mM EDTA pH 7,5) for at fjerne resterende blod og snavs.
- Hvert organ overføres til en anden ren vejebåd, der indeholder tilstrækkelig (~7 ml) kold hakkeopløsning til at opretholde det væv, der er nedsænket på is, indtil videre forarbejdning.
- Fjern en del af hvert organ af interesse og læg den i en indlejringkassette. Fix i 10% neutral buffered formalin, trim, og paraffin indlejre i henhold til laboratoriets standard procedurer for eventuel fremtidig histopatologisk evaluering.
- For leveren, skæres en 5 mm langsgående del af venstre lap og forsigtigt swish i ~ 7 ml kold hakkeopløsning. Strimmelen anbringes i en ren mellemstor vejebåd, der indeholder ~7 ml kold hakkeopløsning, og holdes på is, indtil den er klar til at blive bearbejdet yderligere (trin 1.8 eller 1.11).
- For duodenum, skæres en 10 mm del af duodenum proksimalt til maven. Ved hjælp af en 21-25 G nål, flush at fjerne snavs og bakterier.
- Stik nålen ind i den ene ende af duodenum og skyl med 1 ml kold hakkeopløsning.
- Skyl den anden retning ved at vende duodenum over og gentage med en anden 1 ml hakkeopløsning. Kassér nålen.
- Skær duodenum åben og skyl det i ~ 7 ml hakkeopløsning, før du lægger den i en mellemstor vejebåd, der indeholder ~ 7 ml ren hakkeopløsning; holdes på is, indtil den er klar til at blive bearbejdet yderligere (trin 1.8 eller 1.11).
- For hjernen kan det være nyttigt først at opdele hjernen i to halvkugler; en halvkugle kan gemmes for eventuel histopatologisk (se trin 1.2).
- Dissekere hjerneregionen(-erne) af interesse og swish forsigtigt i ~ 7 ml kold hakkeopløsning.
- Væv overføres til en ren mellemstor mellemstor mellemstor mellemstor båd, der indeholder ~7 ml kold hakkeopløsning, og der holdes på is, indtil det er klar til at blive yderligere bearbejdes (trin 1.8 eller 1.11; bemærk, at små regioner som lillehjernen og hippocampus muligvis ikke kræver yderligere trimning).
- Til maven
- Fjern og kassér formaven. Skær åbne kirtel maven og vaskes fri for mad ved hjælp af ~ 7 ml kold hakkebuffer i en mellemstor vejer båd.
- Der fjernes en 5 mm strimmel kirtelmave proksimalt til duodenum med henblik på fiksering med henblik på eventuel histopatologisk evaluering (se trin 1.2).
- Placer den resterende mave i ~ 7 ml kold hakkebuffer i en mellemstor vejebåd og inkuber på is i 15-30 min.
BEMÆRK: Dette inkubationstrin er måske ikke nødvendigt. Dette trin blev medtaget i JaCVAM-valideringsprotokollen, men er ikke nævnt i OECD's testretningslinje8,9. - Overfør maven til et rent stykke paraffin (eller petriskål eller vejebåd) og skrab forsigtigt overfladeepitel to eller flere gange ved hjælp af en skalpelklinge eller en polytetrafluorethene (PTFE) skraber for at fjerne snavs. Pick up maveslimhinden med pincet og skyl med 1 ml kold hakkebuffer ved hjælp af en pipet. Overfør mavevævet til en ren overflade eller skål.
- Skrab forsigtigt maveepitel 4-5 gange (mere, hvis det er nødvendigt) i hakkeopløsning (typisk 250 μL/mus eller 500-1.000 μL/rotte) med bagsiden af en skalpelklinge eller PTFE skraber for at frigive cellerne. Eventuelt skylles væv med en omtrent lig volumen af hakkeopløsning for at genvinde flere celler. Hakkeopløsningen, der indeholder frigivne celler, opsamles ved hjælp af en pipet, og der overføres til et mikrocentrifugerør på is.
- Til hakkevævsprøver skæres en 3-4 mm del af lever- eller hjernevæv eller ~5 mm duodenum og overføres til et mærket 1,5 eller 2,0 ml mikrocentrifugerør indeholdende 1 ml koldhakkeopløsning. Hurtigt hakkekød (≤30 s) med hakkesaks, indtil den er fint dispergeret, mens prøven er kold. Prøven skal se lidt overskyet ud. Men det er almindeligt, at nogle stykker til at forblive, der vil bosætte sig til bunden af røret.
- For at bruge vævet frisk, opretholde rør, der indeholder hakket væv eller skrabet epitelceller på is; brug vævet til at tilberede kometrutsjebaner inden for ca. 1 time høst (beskrevet i afsnit 2).
- Til frysning af vævsprøverne umiddelbart efter hakke- eller indsamling af skrabede epitelceller
- Fastgør rørlåget og dræb røret i en dewar kolbe indeholdende flydende nitrogen; kan holdes i flydende nitrogen under obduktionen (≤3 h).
- Hent rør ved hjælp af en slev og sted på tøris til at sortere. Rør overføres til en fryseboks på tøris og opbevar æsken i en -80 °C fryser.
- Til fremstilling af frosne terninger af væv, skåret flere små stykker væv (≤4 mm i diameter og ~ 6 mm i længden; Figur 1).
- Hver for sig skal de slippes direkte ned i en mellemstor vejebåd eller en anden egnet beholder, der indeholder flydende nitrogen.
- Vent et par sekunder for stykkerne til at fryse helt og overføre individuelle frosne væv terninger til en mærket mikrocentrifuge rør eller cryotube opretholdes på tøris; lad ikke stykkerne klumpe sammen under fryseprocessen.
- Rør overføres til en fryseboks på tøris og opbevar æsken i en -80 °C fryser.
2. Slide Forberedelse
-
Til hakket/skrabet væv
- Hold rør, der indeholder frisk væv på våd is.
- Placer rør af frosset væv i et stuetemperatur vandbad, indtil prøverne er helt optøet, samtidig med at de holdes kolde. Overfør straks rørene på is.
- Umiddelbart før celler trækkes tilbage til agarose (trin 2.3), blandes hver cellesuspension forsigtigt; for ikke-filtrerede prøver, skal store stykker afregnes til bunden af røret. Hold alle rør på is, indtil der er forberedt objektglas til alle prøver.
-
Til terninger
- Rør, der indeholder vævsterninger, hentes fra fryseren på 80 °C, og der holdes på tøris, indtil objektglasset er klarlagt.
- Aliquot 1 ml Merchants medium (0,14 M NaCl, 1,47 mM KH2PO4,2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4, 10 mM NaEDTA, pH 7.4) eller hakkeopløsning i et mærket 1,7 ml mikrocentrifugerør for hver prøve og holdes på is.
- Arbejde hurtigt for at undgå væv optøning, placere en terning af væv i den åbne ende af en rumtemperatur væv hakkeanordning (Figur 1). Der kan anvendes flere vævsstykker. om nødvendigt kan det frosne væv skæres eller revnes i mindre stykker ved hjælp af en kold mørtel og støder for at reducere terningstørrelsen, så det passer ind i enheden.
- Sæt hurtigt et størrelsesmatchet sprøjtestempel ind i apparatet for at skubbe vævet til maskeenden, som derefter skal placeres i mikrocentrifugerøret, der indeholder kold hakkeopløsning. undgå at tvinge væsken til at overløbe røret. Der nednedsænkes i enhedens maskeende i ca. 5-10 s i den kolde hakkeopløsning, så vævet kan tø helt op.
- Tryk stemplet helt helt, indtil cellerne ses ekstrudere gennem maskens porer. Træk derefter stemplet op ca. 2,5 cm og tryk igen helt ned. processen gentages flere gange, indtil hakkeopløsningen bliver uklar.
- Om nødvendigt kan prøven koncentreres for at øge celletætheden ved nedkølet centrifugering i 5 minutter ved 1100 omdrejninger i minuttet og fjernelse af en del af supernatanten.
- Processen gentages for alle prøver ved hjælp af en ren vævshakkeanordning for hver prøve.
- 50 μL cellesuspension overføres til et rør, der indeholder 450 μL 0,5% lavt smeltepunkt agarose ved 37 °C.
BEMÆRK: Mængderne kan justeres, men mængden af agarose skal være ≤1%. - Forbered og score dias som beskrevet tidligere10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Studie 1
Leveren blev høstet fra to kohorter af mandlige Sprague Dawley rotter administreret majsolie i 4 dage, forskudt med en uge. Dias blev fremstillet af frisk hakket væv, frosset hakket væv, og frosset cubed væv behandles i Merchant's medium eller hakkeopløsning ved hjælp af væv scening enhed. Frosset væv fra dyr fra den første kohorte blev evalueret efter fryseopbevaring i ~3,5 måneder. Frosset væv fra dyr fra den anden kohorte blev evalueret efter opbevaring i ~6 måneder. Kometer, der udviser den karakteristiske "pindsvin"-morfologi, som er tegn på stærkt beskadigede celler (af usikker ætiologi, der kan omfatte cytotoksicitet eller mekanisk stress), blev ikke medtaget i scoringen af % hale-DNA. procentdelen af pindsvin, der udelukkende blev identificeret ved visuel inspektion af morfologi, blev opstillet særskilt i henhold til OECD TG 4899. De gennemsnitlige % hale-DNA-resultater for dyrene i de to kohorter (baseret på score 100 celler/dyr) er sammenfattet i figur 2A. Alle metoder, der anvender frosset væv produceret værdier højere, men ikke altid statistisk anderledes, end frisk væv. I betragtning af at den anbefalede øvre grænse for % hale-DNA i frisk rottelever er 6 %9, viser disse resultater , at nogen af disse metoder kan fungere godt til vurdering af frosset væv. Hakkeopløsning udført mindst lige så godt som Merchant's medium; da sidstnævnte er mere tidskrævende at forberede, hakkeopløsning blev udvalgt til efterfølgende undersøgelser. Der var ingen statistisk signifikante forskelle i vævsskader fra den anden dyrekohorte, som var blevet opbevaret frosset i ~6 måneder før forarbejdningen sammenlignet med væv fra den første kohorte, der blev behandlet efter ~3,5 måneders opbevaring. Samlet set sideløbende med % pindsvin ender % hale-DNA'et, selv om % pindsvin i det frosne væv i forhold til frisk væv var mere varierende end for % hale-DNA (figur 2B). Værdierne for disse endepunkter i det friske væv giver en basislinje, som dna-skader, der kunstrent faktisk indføres ved frysemetoderne, kan måles.
Studie 2
Hunnen B6C3F1-mus blev administreret normalt saltvand eller mutagen, ethylmetulfonat (EMS) ved 200 mg/kg/dag ved normalt saltvand i tre dage. Væv blev høstet 3 timer efter den endelige dosis administration og forarbejdet frisk i kometen assay. Yderligere væv blev flash frosset efter at være hakket i hakkeopløsning eller indsamlet som terninger. Cubed-prøver blev efterfølgende behandlet i hakkeopløsningen ved hjælp af sigteanordningen umiddelbart før klargøring af kometdias. Ud fra den forudsætning, at celler, der udviser pindsvinets morfologi, repræsenterer celler i den høje ende af kontinuummet af kemisk inducerede DNA-skader, blev pindsvin, der var fremstillet af billedbehandlingssoftwaren, inkluderet i den automatiske scoring af % hale-DNA. % hale-DNA-resultaterne (baseret på scoring 150 celler/dyr) er sammenfattet i figur 3. Levervæv frosset som terninger og efterfølgende behandlet ved hjælp af væv scening enhed gav resultater meget lig dem, der opnås for frisk hakket væv. % hale-DNA-værdierne var noget højere for det frosne hakkede væv, men baselineværdierne for det frosne hakkede væv var under 6 %, som anbefalet for frisk rottelever i OECD's testretningslinje for kometanalysen9. En statistisk signifikant stigning i EMS-induceret DNA-skade blev målt i vævsprøver, der blev behandlet efter alle tre metoder.
Studie 3
Dele af levervæv indsamlet fra kvindelige B6C3F1 mus i en 90 dages toksicitet undersøgelse af en test kemikalie udført af et fjerntliggende laboratorium blev hakket eller skåret i terninger, flash frosset, og sendes natten over på tøris til dette laboratorium til analyse. Hakket væv blev analyseret efter ~ 2 måneders opbevaring af fryser (Figur 4). Celler, der ved besigtigelse viste sig at være pindsvin, men som kunne måles af billedbehandlingssoftwaren, blev inkluderet i % hale-DNA-målingerne (150 celler scoret/dyr). Antallet af pindsvin (hvad enten de er scorable eller ikke-scorable), der udelukkende blev identificeret ved besigtigelse af morfologi i i alt 150 celler/dyr, blev opdelt separat for at give oplysninger om hyppigheden af disse stærkt beskadigede celler. Samlet set var DNA-skader (målt som % hale-DNA) i frosset hakket væv høje på tværs af alle dosisgrupper med betydelig dyre-til-dyr-variation, herunder i kontrolgruppen for køretøjer. % hale-DNA-resultaterne korreleret med % pindsvin (identificeret udelukkende på grundlag af morfologi), hvilket indikerer, at pindsvin bidrog væsentligt til det høje niveau af DNA-skader, der blev observeret i disse prøver. Baseret på det høje baggrundsniveau af DNA-skader målt i hakket væv blev frosset kuevæv efterfølgende analyseret efter ~ 22 måneders opbevaring (figur 4). Både DNA-skader og % pindsvin var meget lave i flash frosset kubikvæv, der var blevet udarbejdet parallelt med de hakkede vævsprøver. De stærkt beskadigede celler, der afspejles af pindsvinets morfologi i de hakkede vævsprøver, var således tydeligvis ikke et resultat af en biologisk proces, men blev sandsynligvis indført ved mekanisk forstyrrelse og/eller vævsopvarmning under hakkeproceduren, inden de blev flashfrosset. disse data blev anset for at være upålidelige. Heldigvis gav analysen af frosset ternet væv et klart resultat, nemlig manglen på dna-skader i leveren af hunmus efter tre måneders eksponering for testkemikaliet. Resultaterne af dette casestudie eksemplificerer den risiko, der er forbundet med fremstilling af hakket væv af et relativt uerfarent laboratorium, og viser nytten af den frosne vævsmetode til at omgå dette problem.
Figur 1: Vævshakkeanordning og stempel, der anvendes til at forberede en enkelt cellesuspension fra frosset væv. Prototypen (4,5 mm indvendig diameter, 0,4 mm maskestørrelse) blev venligt leveret af Dr. Gunnar Brunborg (NorGenotech, Oslo, Norge). Panelet til højre giver et eksempel på en passende størrelse terning af væv til brug med enheden. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Sammenligning af DNA-skader målt i friske og frosne hakkede og homogeniserede museleverprøver. Leveren blev høstet fra to forskudte kohorter (n = 5/gruppe/kohorte) af mandlige Sprague Dawley rotter administreret majsolie i 4 dage. Dias blev fremstillet af frisk hakket væv, frosset hakket væv, og frosset cubed væv behandles i Merchant's medium eller hakkeopløsning ved hjælp af væv scening enhed. Frosset væv blev analyseret ~ 3,5 og 6 måneder efter obduktion for kohorter 1 og 2, henholdsvis. Kometer, der er klassificeret som pindsvin baseret på morfologi, blev ikke medtaget i scoringen af % hale-DNA. (A) Kohorte gennemsnitlige % hale DNA-resultater. (B) Kohorte gennemsnitlige % pindsvin resultater. Fejllinjer afspejler standardafvigelse. Der blev udført statistiske analyser for at sammenligne frosset væv med frisk væv for hver kohorte og for at sammenligne resultaterne mellem de to kohorter for hver vævspræparatmetode. *Statistisk anderledes (p < 0,05) fra frisk hakket væv inden for samme kohorte ved hjælp af Student's t-test; #statistically forskellige (p < 0,05) fra frisk hakket væv i samme kohorte ved hjælp af Mann-Whitney-testen for ikke-normalt distribuerede data ¥ statistisk forskel (p < 0,05) mellem kohorter ved hjælp af Student's t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Sammenligning af DNA-skader forårsaget af EMS i levervæv forarbejdet ved forskellige procedurer. Gennemsnitlig % hale-DNA for hun-B6C3F1-mus administreret køretøj eller EMS på 200 mg/kg/dag i tre dage (n = 5/gruppe). Lever blev høstet 3 timer efter den endelige dosis administration og forarbejdet frisk i kometen assay. Yderligere levervæv blev flash frosset efter at være hakket i hakkeopløsning eller indsamlet som terninger; prøverne blev homogeniseret ved hjælp af vævshakkeanordningen umiddelbart før klargøring af kometobjektglas. For at sikre, at celler i den høje ende af kontinuummet af EMS-induceret DNA-skade ikke blev udelukket fra analysen, kometer, der ved visuel inspektion syntes at opfylde den morfologiske beskrivelse af pindsvin, men blev anset for at være scorable af billedbehandlingssoftware blev inkluderet. Fejllinjer afspejler standardafvigelse. En studentert-test blev anvendt til at sammenligne mængden af DNA-skader hos dyr, der udsættes for EMS, med mængden i køretøjets kontroldyr for hver prøveforberedelsesmetode. *Statistisk signifikant stigning ved p < 0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Casestudie, der viser nytten af frossen terningmetode og data af høj kvalitet opnået efter længere tids opbevaring. Dele af levervæv indsamlet fra kvindelige B6C3F1-mus, der blev eksponeret for forskellige koncentrationer af et testkemikalie i ~90 dage (n = 5/gruppe), blev hakket eller skåret i terninger og flash frosset i laboratoriet og efterfølgende sendt til dette laboratorium til analyse. Hakket væv blev analyseret efter ~ 2 måneders opbevaring; på grund af dataenes dårlige kvalitet blev frosset kuevæv efterfølgende analyseret efter ~ 22 måneders opbevaring. For at sikre, at celler i den høje ende af kontinuummet af kemisk inducerede DNA-skader ikke blev udelukket fra analysen, blev data fra scorable celler, som ved besigtigelse syntes at være pindsvin, medtaget. (A) Gruppens gennemsnitlige % hale-DNA-resultater. Sammenlignet med hakket væv, høj kvalitet resultater blev opnået fra frosset kubikvæv, selv efter langvarig opbevaring. (B) Koncernens gennemsnitlige % pindsvinsresultater. Dårlig hakketeknik fremgår tydeligt af de omfattende ikke-biologiske DNA-skader, der observeres som pindsvinkometer i de hakkede vævsprøver. Fejllinjer afspejler standardafvigelse. En ANOVA med Dunnetts test blev anvendt til at vurdere for et positivt respons på testkemikaliet for hver prøveforberedelsesmetode. Der blev ikke påvist nogen statistisk signifikant(p < 0,05) dosisgrupper for begge metoder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Baseline DNA-skader målt i frosset rottehjernevæv. Comet assay resultater er fastsat for frosne hakket eller kubikvæv, der repræsenterer flere forskellige regioner i hjernen af mandlige og kvindelige Sprague Dawley rotter. Data (genereret ved herunder scorable pindsvin kometer) blev samlet over flere undersøgelser; n = det samlede antal hjernevæv, der er evalueret for hver prøveforberedelsesmetode. Fejllinjer afspejler standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som påvist tidligere7,12,13, korrekt håndteret flash frosset hakket væv giver gode resultater i kometen assay. Faktisk er baseline % hale DNA-værdier for frossen hakket rotte og muselever tilberedt i vores laboratorium typisk ≤6%, som anbefalet af OECD's testretningslinje9 for friskhakkede rotteleverprøver. Gode resultater er opnået af flere laboratorier ved hjælp af en række forskellige vævstyper, der er hakket og opbevaret frosset; ligeledes flash frosne epitelceller skrabet fra organer i mave-tarmkanalen er blevet anvendt med succes i kometen assay7,12,13,14. Frosset hakket/skrabet væv synes at være relativt stabilt i mindst flere måneder. Den metode, der anvender homogenisering af flash frosne terninger af leveren ved hjælp af en væv hakkeanordning oprindeligt beskrevet af Jackson et al.6, giver resultater i kometen analyse mindst sammenlignelige og typisk bedre (dvs. lavere baseline niveauer af DNA-skader) end dem, der opnås for frosne hakket lever. Denne metode gælder også for andre vævstyper6. i vores erfaring, fremragende resultater er ligeledes opnået ved hjælp af frosne kubik duodenum (data ikke vist) og hjernevæv (Figur 5). Sigteanordningen kan dog ikke være egnet til homogenisering af alle vævstyper. I en pilotundersøgelse fandt vi, at muskelhjertevæv ikke let kunne tvinges gennem sigteanordningen, hvilket resulterede i dårlig cellegenopretning; I stedet hakkede vævet umiddelbart efter optøning encellesuspension med baseline % hale-DNA-værdier, der kan sammenlignes med dem, der blev hakket før flashfrysning (data ikke vist). Især, når de håndteres korrekt under obduktion (dvs. holdes koldt og fugtigt; flash frosset som enkelte stykker og ikke lov til delvist at tø), flash frosset cubed væv har givet meget lav baseline DNA-skader, selv efter ca to års fryser opbevaring (Figur 4).
Anvendelse af enten frosne cellesuspensioner eller ternet væv i kometanalysen giver flere fordele i forhold til friskvæv, herunder: 1) lettelse af samtidig indsamling af flere vævstyper til kometanalyse; 2) lettelse af vævsindsamling på et laboratorium i livet og overførsel af prøver til et andet laboratorium til analyse 3) bekvemmelighed at udskyde en beslutning om at analysere en given væv i flere måneder. Selv om homogeniseringen af frosset væv på tidspunktet for glidepræparatet er mere besværlig end at hakke frisk væv på høsttidspunktet, giver brugen af frosset kugetvæv flere yderligere fordele, der omfatter: 1) intet krav til personale, der er uddannet i kometanalysen (f.eks. mobile enheder) eller specialiserede forsyninger/reagenser ved obduktion; 2) færre muligheder for tekniske fejl (f.eks. opvarmning af prøver, utilstrækkelig frigivelse af celler, ikke-optimal størrelse af vævsprøver) under obduktion 3) minimal mulighed for at indføre mekanisk DNA-skade under prøvebehandling (f.eks. hakkeforskydning) og 4) lav baseline DNA-skade, selv efter længere tids opbevaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbejde blev støttet af Det Intramural Research Program af NIH, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) i henhold til kontrakten HHSN273201300009C; De udtalelser, udtalelser eller konklusioner, der er indeholdt heri, repræsenterer dog ikke nødvendigvis udtalelser, udtalelser eller konklusioner fra NIEHS, NIH eller den amerikanske regering.
Acknowledgments
Forfatterne står i gæld til Lincoln Martin og Kelley Owens for ekspert teknisk bistand forberedelse og scoring komet dias og Dr. Carol Swartz for at udføre statistiske analyser. Forfatterne anerkender også de støttende bidrag fra medlemmer af den genetiske toksikologi, undersøgende toksikologi, og obduktion programmer på ILS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. ICH. , (2012).
- EFSA. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).
- Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).
- Jackson, P., et al. Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay. Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).
- Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).
- Uno, Y., et al. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).
- OECD. OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. 489, (2016).
- Hobbs, C. A., et al. Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. Journal of Visualized Experiments. (111), 53833 (2016).
- Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).
- Hobbs, C. A., et al. Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential. Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).
- Pant, K., et al. Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).
